UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONÍA

FACULTAD DE INGENIERIA Y CIENCIAS AMBIENTALES

INGENIERIA AGROFORESTAL - ACUICOLA

ICTIOPATOLOGÍA
Practica 5.

METODOS DE OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS. TECNICAS DE

OBSERVACION EN SECO. PREPARACION DE UN FROTIS. COLORACION. FORMAS.
AGRUPACIONES Y ESTRUCTURA BACTERIANAS.

M.Sc. Blga: Acui. Nadhia M. Herrera Castillo.

ESTUDIANTE:

 ALIAGA LOPE Rue A.

 ESQUIVEL SAJAMI, Dalia.
 CAMPOS CELESTINO, Vilma.
 CASTAÑAHUI, Wendi.

YARINACOCHA – PERÚ
2016
I. INTRODUCCION:

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente

al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células
y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por
ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana.
Los microscopios de contraste de fases, interferencia diferencial (DIC o la microscopía
de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste, empleándose para la
observación de vainas, filamentos u otras estructuras bacterianas. La tinción es un
método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto
contribuye a mejorar la imagen observada. (Waché, I.2008)
Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar
notablemente el contraste. En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de
suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y
fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se
puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química.
La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. La fijación
química con agentes como etanol, folmaldehido y ácido acético entre otros muchos, se
utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de
procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une a
ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen
en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados
que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por
enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los
más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el
reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el colorante se une a la
desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que no
penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los
microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro. (Marechal, P. 2008)

II. OBJETIVOS:

 Realizar un frotis bacteriano, su fijación y posterior colcoracion.

 Realizar y diferenciar los tipos de coloraciones simple, compuestos o diferencial
(Gram) y especial.
 Observar y diferenciar la morfología individual y de agrupación bacteriana.
 Utilizar y familiarizarse con el correcto empleo de aceite de inmersión en
observación al máximo aumento.
III. MATERIALES Y METODOS:

III.1. Material biológico:

 Suspensiones bacterianas de bacilus sp. Escherichia coli, staphyloccus spp.

Vibrio sp. Aeromonas sp, psudomonas sp.

III.2. Material de laboratorio:

 Microscopio.
 Laminas porta objetos.
 Asa bacteriológica.
 Mechero de alcohol.
 Colorantes: azul de metileno, (cristal de violeta, solución de lugol, alcohol,
acetona, safranina).

III.3. METODOS:

III.3.1. Métodos de descripción:

Este método consistió en describir cada característica e identificar el tipo de bacterias

observadas en el microscopio de la muestra de siembra.

III.4. PROCEDIMIENTO:

1. la práctica se realizó en el laboratorio de bio-química, lo cual contaban con equipos

que podemos trabajar.

2. Así mismo se procedió a extraer las muestras sembradas de la estufa, lo cual ya

habían crecido las bacterias, para la observación respectiva.

Imagen 1. Muestra de en la estufa. Imagen 2. M. listo para la observación.

 3. Seguidamente se procedió a la
preparación de la muestra
utilizando los materiales de
laboratorio. (pinza para la
extracción de la bacteria), colocando
al porta objeto.

Imagen 3. Calentando la pinza al rojo vivo.

Para la extracción de la bacteria.

Imagen 4. Extracción de la bacteria. Imagen 5. Colocando la bacteria al porta objeto.

 4. Seguidamente de procedió a realizar la coloración de la muestra del porta objeto
con el reactivo (cristal de violeta), una gota por muestra, y extenderla por toda la
muestra la coloración. Para que sea homogénea. Y dejarlo por un minuto al aire
libre.

eImangs6.Ctrioldv 7Uaecviol.Ptr1’

  aDemosjpr1’ilb.

eImang8.Ardoutl
  Dejar reposar durante un tiempo de dos minutos con el reactivo
(lugol). Después pasar a enjuagar.

eImang9.Aruodtc
extnadporlbj.Yv Imagen 10. Agregar safranina una gota;
conagudemit. dejar reposar por 2´. Pasar a lavar con
agua.

 después de la agregación de los reactivos para la coloración Gram, pasar a

flamear en el mechero de alcohol. Para después observar en el
microscopio.
IV. RESULTADOS:

IV.1. Los resultados obtenidos de la práctica de observación de estructuras

bacterianas.

Imagen. Observación de la bacteria en el microscopio en aumento de 40 X

Nombre de la bacteria: escherichia coli-bacilo gram negativo.

Morfología: bacilos bordes rectos; Bacilos fusiformes; bacilos curvos.

La tinción de Gramm (coloración) es un tipo de coloración usado en microbiología

para ver las bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Christian Gramm desarrolló
esta técnica y por ello su nombre (1884). Se ocupa para poder hacer referencia a
morfología celular bacteriana. Se considera la bacteria Gramm postiva que se ven de
color violeta, y la bacteria Gramm negativa se visualiza de color rosa.

El cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como
Gram negativas). El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) disuelto en agua destilada, el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2
entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal
violeta.

Estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas.

La gruesa pared celular de las bacterias grampositivas está constituida principalmente
por peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de peptidoglicano es la
determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta de la coloración de
Gram. (Prescott, 1999).

Estructura de la pared celular de las bacterias gramnegativas.

Si observamos la pared de las bacterias gramnegativas al microscopio electrónico

podemos observar tres zonas: la membrana plasmática, el espacio periplásmico que
incluye una fina capa de peptigolicano y la membrana externa. Esta última, exclusiva
de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipídica que difiere de otras
membranas por su capa externa, que está constituida por una molécula anfipática: el
lipopolisacárido (LPS) o endotoxina. (Schaechter M, 1993)

V. DISCUSION:

(Downes FP, 2001), menciona que la mayoría de las bacterias psicrófilas son Gram-
negativas y se encuentran en ambientes donde la temperatura está siempre por
debajo de 15 a 20ºC, mientras que las psicrotrofas crecen en ambientes donde la
temperatura fluctúa. La mayoría de los psicrófilos hallados en alimentos son especies
de Aeromonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Pseudomonas, Serratia y Vibrio.
Madigan MT et al. 2004. Los Gram positivos son especies de Bacillus, Clostridium y
Micrococcus. Aún cuando pueden crecer a 0ºC, lo hacen lentamente y a menudo
tardan varias semanas para formar las colonias. Entre las bacterias escherichia coli-
bacilo Gram negativo que producen deterioro en los alimentos se destacan: sepsis y
shock térmico l bacteria mas frecuente y algunas cepas de Bacillus cereus crecen
lentamente a temperaturas inferiores a 5ºC (2). En los pescados y mariscos con 1 a
4% de sal se encuentran especies halotolerantes de Bacilos, Acinetobacter,
Photobacterium, Pseudomonas, Shewanella, Vibrio, y las carnes curadas con 1 a 7%
de sal contienen bacterias Gram-positivas, por ejemplo bacterias lácticas,
Enterococcus y Micrococcus. La mayoría de las bacterias implicadas en el deterioro
con 5 a 20% de sal son especies de Bacillaceae y Micrococcaceae. Asi mismo la
práctica se menciona la bacteria encontrada en pes fresco, de la siembra; escherichia
coli-bacilo gram negativo.

(ICMSF. 1998). Algunos serotipos de Escherichia coli son patógenos, por ejemplo E.
coli O157:H7. Yersinia enterocolítica provoca una fiebre entérica y las especies de
Shigella son responsables de la disentería bacilar.
VI. CONCLUSION:

 Se realizó el frotis bacteriano, y su fijación y posterior coloración de la muestra

de bacterias.
 Se realizó la diferencias y los tipos de coloraciones simple, compuestos o
diferencial (Gram) y especial.
 Se observó y diferenciar la morfología individual y de agrupación bacteriana.
 Se utilizó y familiarizo con el correcto empleo de aceite de inmersión en
observación al máximo aumento.

VII. REFERENCIAS BILBLIOGRAFICAS:

 Cao-Hoang, L.; Marechal, P.-A.; Le-Thanh, M.; Gervais, P.y Waché, I.. 2008.
Fluorescent probes to evaluate the physiological state and activity of microbial
biocatalysts: A guide for prokaryotic and eukaryotic investigation. Biotecnology
Journal, 3: 890-903.

 ICMSF. 1998. Microorganisms in food. Vol 6: Microbial Ecology of Food

Commodities. Blackie Academic & Professional, London, p 131.

 Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 4ª ed. APHA, Washington, p. 159, 167, 187, 357.

 Madigan MT et al. 2004. Brock - Biology of Microorganisms. 10ª ed. Pearson -

Prentice Hall, p 812.