Trabajo práctico Nº

MEDICIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

La determinación de la concentración de pigmentos fotosintéticos nos permite

estimar la biomasa y la capacidad fotosintética del fitoplancton. La calidad,
distribución y relación entre las distintas clases de pigmentos nos indica el estado
fisiológico de la comunidad y la composición del fitoplancton en cuanto a grupos
algales.
La concentración de pigmentos varía ampliamente y depende del metabolismo
algal y de factores físico-químicos como la luz, la temperatura y la disponibilidad
de nutrientes.
Los pigmentos algales consisten principalmente en clorofilas (a, b y c) y
carotenoides (carotenos y xantófilas). Para estimar su concentración el método
consiste en extraer los pigmentos mediante un solvente orgánico y leer en un
espectrofotómetro la absorción de luz a la longitud de onda específica para cada
pigmento.
Se toma una muestra de agua cuyo volumen varía entre 0,5 y 5 litros de acuerdo a
la concentración algal. La muestra se filtra con filtro de fibra de vidrio para retener
las algas en el mismo. Luego el filtro se tritura agregándole un volumen de 10 ml
de acetona al 90% para preparar un extracto. El mismo se coloca en un tubo de
ensayo y se guarda a 4ºC durante 24 horas. La finalidad de estos procedimientos
es que las células algales se rompan y los pigmentos se disuelvan en la acetona.
Posteriormente los tubos de ensayo se centrifugan (2.000 a 3.000 rpm durante 10
minutos) para separar los restos del filtro. El extracto resultante se coloca en una
celda de 1 cm de recorrido óptico (o de 5 cm si su concentración de clorofila es
muy baja) y se leen las densidades ópticas (absorbancias) a las distintas
longitudes de onda en un espectrofotómetro:
- 750 nm: turbidez de la muestra
- 664 nm: clorofila a
- 647 nm: clorofila b
- 630 nm: clorofila c
- 430 nm: carotenoides para el cálculo del Indice de Margalef

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Luego de realizar estas lecturas se agregan 3 gotas de HCl 0,1 N al extracto en la
celda para acidificarlo, logrando que toda la clorofila se degrade y se transforme
en feofitina, entonces se vuelve a leer la absorbancia a 665 y 750 nm. A las
lecturas de absorbancia a 664, 647, y 630 nm se les debe restar la lectura a 750
nm, obteniéndose las lecturas corregidas. Se utilizan diferentes fórmulas para
estimar la concentración de pigmentos en la muestra de agua a partir de estos
datos (Clesceri et al., 1998):

Clorofila a, mg/m3= 26.7 (DO 664antes – DO 665después) V1

V2 L

Feofitina a, mg/m3= 26.7 [1,7 (DO 665después) – DO 664antes] V1

V2 L
V1= volumen del extracto en ml
V2= volumen de la muestra filtrado en litros
L= largo del paso de luz, o sea, ancho de la celda en cm
664antes = densidad óptica o absorbancia del extracto antes de acidificarlo
665después = densidad óptica o absorbancia del extracto después de acidificarlo

Método tricromático para determinación de clorofilas a, b y c

Cl a = 11,85 (DO 664) - 1,54 (DO 647) – 0,08 (DO 630)
Cl b = 21,03 (DO 647) – 5,43 (DO 664) – 2,63 (DO 630)
Cl c = 24,52 (DO 630) – 7,60 (DO 647) – 1,67 (DO 664)
Luego de determinar la concentración de estos pigmentos en el extracto (para
celda de 1 cm de paso de luz) se calcula su concentración en la muestra de agua
con la siguiente fórmula:

Clorofila a, b o c, mg/m3= Cl a, b o c V1
V2

El Indice de Margalef (DO430/DO665) nos da una idea del estado de madurez de

la asociación algal y se calcula dividiendo las absorbancias a estas longitudes de
onda (Margalef, 1983). El valor del índice es bajo (alrededor de 2) cuando se trata

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de una asociación joven con alta productividad por unidad de biomasa y alto (de 5
a 7) cuando se trata de una comunidad madura con baja tasa de renovación.

BIBLIOGRAFIA

Clesceri L. S., Greenberg A. E. & Eaton A. D. (Eds.). 1998. Standard methods for
the examination of water and wastewater. (APHA, American Public Health
Association, Washington D.C.)
Margalef, R. 1983. Limnología. Barcelona, 1010 p.

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Grupos algales y sus principales pigmentos (+ = presente) (Margalef, 1983)

Clorofilas Fico-
a b c1 c2 d bilinas Carotenoides principales
Cianofíceas (Cyanophyta, + - - - - + β-caroteno, equinenona,
Cianobacteria, Nostoco- zeaxantina, mixoxantofila,
phyceae, Schizomycophyta) oscilaxantina
Rodofíceas (Rodophyta) + - - - + + α- y β-caroteno, luteína,
zeaxantina, anteraxantina
Dinofíceas (Dinophyta) + - + + - - β-caroteno, fucoxantina,
diadinoxantina, peridinina
Criptofíceas (Cyptophyceae) + - - + - +? α-caroteno, aloxantina
Rafidofíceas (Raphidophy- + - + - - -
ceae, Chloromonadales)
Crisofíceas (Chrysophyce- + - + - - - α- y β-caroteno,
ae+Haptophyceae+ fucoxantina, diatoxantina,
Craspedophyceae) diadinoxantina
Diatomeas + - + - - - β-caroteno, fucoxantina,
(Bacillariophyceae) diatoxantina, diadinoxantina
Xantofíceas (Xanthophyce- + - + - - - β-caroteno, diadinoxantina
ae, Heterocontae+
Eustigmatophyceae)
Feofíceas (Phaeophyta, + - + - - - β-caroteno, fucoxantina,
Fucophyceae) violaxantina
Euglenales + + - - - - β-caroteno, equinenona,
(Euglenophyceae) anteroxantina, neoxantina
Prasinofíceas + + - - - - α- y β-caroteno, neoxantina,
(Prasinophyceae) violaxantina
Clorofíceas (Euchlorophy- + + - - - - α- y β-caroteno, luteína,
ceae+Zygophyceae (conyu- neoxantina, violaxantina,
gadas)+Charophyceae) zeaxantina (macrófitos)

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 V1 (ml) Peso V2 (L) T
Muestra volumen seco volumen Turbidez D430 D430-T D630 D630-T D647 D647-T D664 D664-T D665a D750a D665a-Ta
solvente (g) filtrado D750

Muestra Clorofila a (µg l-1) Clorofila b (µg l-1) Clorofila c (µg l-1) Feopigmentos (µg l-1) D430/D665