Extraccin y separacin de pigmentos de los cloroplastos

Extraccin y separacin de pigmentos de los cloroplastos

I. Introduccin

Los pigmentos vegetales, pueden dividirse en dos grandes grupos, en base a su
solubilidad:
a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el jugo
vacuolar.
b) Solubles en solventes orgnicos: clorofilas "a" y "b" y carotenoides (rojo,
naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y tilacoides de los
cloroplastos. Son los responsables de la captacin de la energa luminosa en
el proceso de la fotosntesis. Las clorofilas poseen unas estructura porfirnica,
formada por cuatro anillos pirrlicos con un tomo de magnesio en su centro,
un anillo de ciclopentanona y un ster de fitol unido a uno de los anillos de
pirrol que provee a la molcula de una cola lipfila. La diferencia entre las
distintas clorofilas existentes (se conocen al menos siete) se encuentran en los
sustituyentes que se presentan; as la clorofila "a" (verde azulada) presenta un
grupo metilo (-CH3) en el carbono 3, y la "b" (verde amarillenta) un grupo
aldehido (-CHO) en la misma posicin.

Existen plantas que contienen solamente clorofila "a", como las algas azules, las
diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo muchas de ellas
contienen en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras
clorofilas (c, d, e), fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que
comunican sus respectivos colores a las algas.

Entre los carotenoides se encuentran los carotenos (anaranjados), cadenas
hidrocarbonadas de unos cuarenta tomos de carbonos, y las xantofilas (amarillas
u ocre), que son derivados oxigenados de aquellos.
Frmulas estructurales de las clorofilas "a" y "b", -carotenos y la luteina (una
Fundamento Terico



Clorofilas y carotenoides se encuentran en estrecha asociacin entre s y con
protenas y lpidos de las membranas en los grana de los cloroplastos. Los
pigmentos fotosintticos pueden extraerse de los tejidos gracias a su solubilidad
en disolventes orgnicos como ter y benceno. Sin embargo, para que su
extraccin sea completa, el primer paso - la trituracin no se realiza con estas
sustancias sino con otras que adems de disolver los pigmentos sean solubles en
agua, como acetona o alcohol etlico, ya que gran parte del peso fresco de los
tejidos vegetales corresponde al agua. Posteriormente el extracto acetnico o
alcohlico se mezcla con ter o benceno, en los que se disuelven las clorofilas y
parte de los carotenos y xantofilas.

Para el anlisis de los carotenoides se utiliza un disolvente distinto, el hexano.

En hexano se disuelven perfectamente los pigmentos carotenoides pero tambin
se solubilizan en parte las clorofilas, por lo que es necesario eliminarlas de la
solucin como paso previo a la lectura espectrofotomtrica del extracto. La
eliminacin se lleva a cabo por saponificacin del grupo ster de las clorofilas, lo
que las hace insolubles en este disolvente.

La mezcla de pigmento as obtenida puede separarse mediante cromatografa en
capa fina utilizndose un eluyente adecuado, identificndose los pigmentos por su
comportamiento cromatogrfico y espectro de absorcin en la zona azul-violeta
(429 nm la corofila "a" y 453 nm
la clorofila "b") acompaada de una absorcin secundaria en la zona del rojo (660
nm la clorofila a" y 643 la clorofila "b"). Los carotenoides presentan un espectro de
absorcin de triple banda en la regin de 400 a 500 nm. En la figura 2 se
presenta el espectro de absorcin de las clorofilas "a" y "b" (Fig. 2a) y de los a -
carotenos y una xantofila (Fig. 2b).

















Figura 2.- Espectro de absorcin de las clorofilas a y b, el a -caroteno y una
xantofila
(Tomado de Richter, 1972 y Barcel Coll et al., 1992).

Cuando una solucin de clorofila es iluminada con luz blanca o azul se produce un
fenmeno de excitacin molecular, observable por la emisin de luz de color rojo
vinoso intenso. La luz emitida por fluorescencia es siempre de mayor longitud de
onda y de menor energa que la luz incidente, pues siempre algo de esa energa
se disipa en forma de calor.

Esta emisin de luz por parte de la clorofila, demuestra que es capaz de realizar
reacciones fotoqumicas.

Las clorofilas son poco estables in vitro, especialmente bajo iluminacin intensa. El
tomo central de magnesio es fcilmente reemplazado por hidrgeno, dando lugar
a las feofitinas respectivas, pigmentos de color pardo oliva.

Los pigmentos migran a distintas velocidades de acuerdo a su solubilidad. De este
modo se puede efectuar una separacin entre ellos y cada compuesto puede ser
definido por una magnitud especfica denominada Rf (relacin de frente), que tiene
valores entre 0 y 1.

donde e = es la distancia que separa el centro de la mancha inicial, del producto
revelado por
arrastre.
h = distancia entre el centro de la misma mancha y la lnea frontal del disolvente.
Si e = 0 el Rf = 0 es decir no hay separacin del producto.

Si e = h el Rf =1 es decir que el producto asciende hasta igual nivel que el
solvente.

El trabajo Prctico tendr los siguientes objetivos: separar cualitativamente los
pigmentos fotosintticamente activos y en la segunda parte, verificar la capacidad
de excitacin molecular de la clorofila en solucin.








II. Procedimiento





Fluorescencia

Macerar 10 gramos de espinaca con un poco de alcohol etlico al 95 %, decantar y
filtrar (con gasa y/o algodn); agregar ms alcohol etlico, seguir macerando y
repetir el proceso. En total no usar ms de 60 ml. El producto as obtenido se
utilizar para observar la fluorescencia de la clorofila, iluminndolo son una fuente
de luz paralelo (aparato de proyeccin, lmpara de microscopio, etc.).

Cromatografa en capa fina, ascendente simple (TLC).

Bsicamente, la cromatografa en capa fina es la tcnica de separacin e
identificacin de sustancias qumicas, por medio de un disolvente que se mueve
por una capa delgada de un adsorbente idneo.

Este adsorbente, generalmente con un adhesivo, se deposita sobre una hoja de
vidrio o de otro material que acta como soporte inerte de la capa. Para preparar
la capa se hace una masa o pasta de materiales finamente molidos y mezclado
con un lquido apropiado como el agua, se coloca sobre la lmina de vidrio,
extendindola como una cubierta fina y lisa, y se seca. En este trabajo prctico se
utilizar slica-gel G 254, para preparar las placas. El adsorbente, una vez seco, se
adhiere a la lmina.

Se activan las placas en estufa colocndolas a una temperatura de alrededor de
100 C, durante 15 minutos. Luego se retiran y se colocan en el desecador, el cual
contiene una caja de Petri con slica gel, hasta que se enfre; de esta manera se
elimina el agua de la placa.

Luego se coloca las mezcla de los solventes (75:25 ter de petrleo-acetona), en
la cuba de cromatografa hasta saturar (tiempo estimado de 1 a 1:30 hs). Este
paso se realiza para evitar distorsin en el frente de la cromatografa y en la
separacin de lo sembrado.

Para la extraccin de clorofilas y carotenoides: pesar dos gramos de material
vegetal (peso fresco) y triturar en mortero con una mezcla de acetona-hexano a
partes iguales. Filtrar con vaco, reextrayendo si es necesario hasta que la pulpa
quede incolora y aforar el filtrado a 25 ml con la mezcla de extraccin.

Pasar el extracto as obtenido a un embudo de decantacin que contiene 10 ml de
hexano y aadir unos 25 ml de agua destilada, resbalando por la pared del
embudo. Esperar unos minutos, desechar la fase de acetona-agua y del
remanente (pigmentos totales) tomar unas alcuota. Aadir unos 5 ml de alcohol
metlico saturado de KOH, agitar y dejar reposar hasta que se separe la fase
alcohlica con las clorofilas saponificadas, y desechar stas ltimas.

Para realizar la cromatografa se extrae parte del extracto con una jeringa y aguja
para insulina, se coloca una gota del extracto en la parte inferior de la placa a 1 cm
del borde blanco inferior, se seca con el secador de cabello con aire fro, para que
no se difunda las gota. Luego se coloca la segunda gota y se repite las operacin.
Colocar en total no ms de 5 gotas.

Luego se colocan las placas en la cuba de cromatografa, se tapa o se cubre con
vidrio para no perder la saturacin de la misma y se coloca en oscuridad hasta que
ascienda el solvente hasta 3/4 partes de la placa (aproximadamente 1 hora).

Una vez que se verifique la separacin se retiran las placas, siempre tomndolas
de los bordes, sin tocar la zona blanca; se las coloca sobre una mesa, se marca
sobre los costados el frente del solvente (para luego calcular la Rf), luego se seca
la placa con el secador de aire fro.

Se marcan con una punta fina las diferentes manchas, para los clculos
posteriores de Rf.

- Tomar hojas verdes y tiernas de espinacas.
- Separar los pecolos y venas grandes de las hojas y machacarlas.
- Luego lo filtramos y lo colocarlas en un vaso de precipitado de 250mlcon
50ml de agua hirviendo por dos minutos























































1) EXTRACCIN DE LA CLOROFILA:


















































VI. RESULTADOS

El procedimiento de la muestra para la separacin de
los pigmentos de las clorofilas se desarroll con 75:25 ter de petrleo-
acetona).Poco a poco se iban separando los pigmentos y esto se observaba en la
almina. Se iban separando lentamente los pigmentos en sus tonalidades: abajo
amarillo y arriba quedaba de nuevo el amarillo.
Las clorofilas extradas fueron las clorofilas de las que se obtuvieron 3 tubos: el
primero verde claro, el segundo verde amarillento y el ltimo verde amarilloso. Por
ltimo se obtuvo un tubo completamente lleno de carotenos en color amarillo.

Conclusiones


Concluimos que l color de un pigmento depende de la absorcin selectiva
de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexin de otras. Por
ejemplo, la clorofila, el pigmento de las plantas, absorbe luz en la parte
violeta y de la zona naranja a la zona roja del espectro luminoso. Convierte
esta energa luminosa en energa qumica mediante la fotosntesis y refleja
luz en la parte del verde y en la parte del amarillo del espectro. De esta
manera, la clorofila presenta este color verde.



Se concluye que hay una relacion entre las longitudes de onda y
perceptibilidad de que los pigmentos sean fotosensibles y cumplan
funciones como la formacin de energa a partir de recibir luz







































REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS


http://ies.mariasarmiento.climantica.org/files/2011/12/imaxen7.pdf

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm

J. Azcn-Bieto, M. Taln (eds.). Fundamentos de Fisiologa Vegetal.