INFORME DE LABORATORIO DEL MÓDULO

BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

Silvio G. Angulo Minota

Código: 67201810075
Cohorte XIX
Universidad de Manizales
Maestría en Desarrollo Sostenible y Medio Ambiente
Manizales, Colombia
Sep./2019

Introducción

Se dice que los colorantes son uno de los agentes contaminantes más recurrentes en el medio
ambiente. Se produce por varias industrias, entre ellas la textil, que es la de mayor producción en
Colombia.

Una de las formas de hacer biorremediación o tratamientos a los efluentes que tienen
presencia de colorantes, es haciendo uso de microorganismos. En ese grupo de microorganismos están
las levaduras, que tienen la capacidad de hacer degradación de los colorantes y reducir la carga del
contaminante.

Objetivo
Determinar la capacidad o eficiencia que tiene la levadura del pan Saccharomyce cerevisiae,
para remover el contenido de contaminante, colorante azul de metileno, en un medio de cultivo YDP.

Ingredientes:
Azul de metileno = Contaminante
Levadura = Organismo Biorremediador
Medio de cultivo = YPD: Levadura, Peptona y Dextrosa.

Experimento
En el laboratorio de microbiología, ingeniería genética y biotecnología de la Universidad de
Manizales, se llevó a cabo el experimento que corresponde al Módulo Electivo de Biotecnología
Ambiental. El propósito de este experimento es determinar la eficiencia de la “Levadura” como
REMEDIADOR utilizando un medio de cultivo YPD, contaminado con EL COLORANTE Azul de
Metileno, aplicado en cinco concentraciones o tratamientos, como son: un primer tratamiento Puro y
cuatro tratamientos en diluciones así: 1x10-1, 1x10-2, 1x10-3 y 1x10-4.

El propósito de la variación del colorante, se debe a que se puede tener diferentes niveles de
concentración del colorante como contaminante en el medio y para evaluar que tan eficiente es la
levadura removiendo la concentración del contaminante. Es decir, se pretende determinar si la
levadura sirve o no sirve en la degradación del contaminante.

El medio de cultivo YPD es óptimo para que la levadura crezca, es decir que si se llegara a
observar que la levadura funciona para la remoción del contaminante, se debe tener en cuenta que
ésta se encuentra en condiciones óptimas de crecimiento. Por lo tanto de pensar en aplicar la levadura
como biorremediador en un medio natural, se deberán practicar ensayos hasta encontrar un medio
adecuado para desarrollar el protocolo en campo, a partir de las condiciones naturales del agua que
se pretende recuperar.

La Levadura empleada en el ensayo es comercial, que se utiliza para hacer pan, la cual fue
pre inoculado. Su nombre científico es Saccharomyce cerevisiae.

Procedimiento

Para el experimento se utilizó un platito que tiene 96 pocillos, numerados en letras en la parte
horizontal y con números en la parte vertical; en él que se prepararon los cinco tratamientos, con tres
repeticiones por cada uno. A cada estudiante se le asignó una letra en sentido horizontal para las tres
repeticiones y en sentido vertido se ubicaron los tratamientos, quedando desde la letra A hasta la H,
teniendo en cuenta que se dejaba una letra vacía entre tratamiento.

Para el presente caso, me correspondió la letra A y se utilizaron tres pocillos o repeticiones

en el platillo, cuyo contenido son 200uL en cada repetición así: A1, A2, A3, en cada uno se echó un
contenido de 150uL del medio de cultivo YPD, 40uL de Levadura y 10uL del colorante puro sin
dilución, con una concentración del 100%. Para cada aplicación de los componentes (cultivo,
levadura, colorante) se utilizó una punta diferente en la pipeta.

En una cámara de flujo laminar con presencia de un mechero, en una pipeta se tomaron 150uL
del medio de cultivo YDP y se llenaron los tres pocillos que representan las tres repeticiones.
Posteriormente en los mismos pocillos se adicionó 40uL de levadura y 10uL del colorante, azul de
metileno, como contaminante. El volumen total en el recipiente fue de 200uL del tratamiento en tres
repeticiones.

Control

Para el control del experimento, se prepararon dos blancos: en el primero se utilizó 160uL
del colorante y 40uL de agua de disolución de la Levadura y el pocillo se ubicó en la línea A6 y en el
segundo se aplicó 200uL de levadura y se ubicó el pocillo en la línea A9.

El propósito del control es saber que no habrá variaciones de adsorbancia y que cualquier
variación de adsorbancia que se presente se podrá deber al efecto de la levadura degradando el
colorante.

Las muestras del tratamiento y los testigos o controles fueron sembradas en el

espectrofotómetro electrónico. Cada hora se hizo lectura de mediciones para obtener un total de 7
mediciones electrónicas, que dan cuenta del comportamiento de la levadura frente al colorante.

Supuesto

Si la disminución de adsorbancia de los tres pocillos que contienen el tratamiento, es igual a

la disminución de adsorbancia de los controles, entonces se podrá concluir que la disminución del
colorante no se podrá deber a la acción de la Levadura, sino a cualquier otro fenómeno que se pueda
estar presentando en los pocillos.
RESULTADOS

En la tabla 1, se muestran los resultados de las mediciones observadas durante siete horas,
tanto del tratamiento con sus repeticiones, como de los testigos que corresponden a colorante y
levadura.

Tabla 1. Medición en tiempos de los tratamientos y controles

TRATAMIENTO COLORANTE -AZUL DE METILENO- PURO al 100%

REPETICIONES CONTROL CONTROL

TIEMPOS PROMEDIO
COLORANTE LEVADURA
R1 R2 R3
T0 3,097 3,364 3,280 3,247 2,289 0,184
T1 3,437 3,789 3,733 3,653 3,791 0,1996
T2 3,784 3,996 3,999 3,926 3,537 0,201
T3 3,257 3,623 3,568 3,483 3,603 0,2099
T4 3,000 4,000 4,000 3,667 4,000 0,2091
T5 3,090 3,675 3,720 3,495 3,543 0,207
T6 3,142 3,479 3,471 3,364 3,630 0,206
Fuente: Este experimento, MDSMA -Umanizales-2019

En la tabla 2., se presentan los datos de la media aritmética de las repeticiones del tratamiento tomadas
durante un periodo de 6 hora y su relación con los testigos o controles de colorante y levadura.

Tabla 2. Resumen de resultados de análisis

CONTROL CONTROL
TIEMPOS PROMEDIOS
COLORANTE LEVADURA
T0 3,25 2,29 0,18
T1 3,65 3,79 0,20
T2 3,93 3,54 0,20
T3 3,48 3,60 0,21
T4 3,67 4,00 0,21
T5 3,50 3,54 0,21
T6 3,36 3,63 0,21
Promedio 3,55 3,48 0,20
Fuente: Este experimento, MDSMA -Umanizales-2019

Teniendo en cuenta que el propósito del experimento es determinar la eficiencia de la

levadura como microorganismo biorremediador para la remoción del colorante azul de metileno,
como agente contaminante, en los datos de la tabla 2, columna de promedios, se observa que la mayor
acción de la levadura se presenta entre los tiempos de medición T1 y T4; en este rango, el valor
máximo cercano a 4uL se presenta en el T2.

Por otra parte, se aprecia que en los valores extremos (T0 y T6), es decir al comienzo y final
de los tiempos de medición, se observan los valores más bajos los cuales se acercan entre sí (3,25 y
3,36 respectivamente); estos datos muestran una tendencia a estabilizar el accionar del
microorganismo, entendiéndose que la interacción inicia de manera tenua, luego se acrecienta y al
final se tiende a estabilizarse. En los tiempos T2 y T4 se indica la mayor interacción entre la levadura
y el colorante.

Gráfica 1. Resultados de la interacción entre el tratamiento y los controles

Resultados de mediciones remoción de colorante con levadura

BlK COL BlK LEV PROMEDIO

5,00
Valores en Microlitros

4,00 3,79 3,93 3,60 4,00 3,54 3,55

3,54 3,48 3,67 3,50 3,63
3,25 3,65 3,36 3,48
3,00
2,00 2,29

1,00
0,00 0,18 0,20 0,20 0,21 0,21 0,21 0,21

Tiempos de medición

Fuente: Este experimento, Umanizales-2019

En la gráfica 1, se muestra la interacción entre el tratamiento (curva de color azul) y el blanco

colorante (curva de color rojo), en esta se observa que en el T0, la concentración del tratamiento es
mayor que el control colorante, lo que puede estar asociado con el agua destilada donde se hizo la
disolución de la levadura. En el T1 el control sufre un incremento superando levemente el valor del
biorremediador; en el tiempo T2 se aprecia el máximo crecimiento en el tratamiento, superando el
accionar del contaminante. En el T3 los datos muestran un nivel de equilibrio entre el testigo y el
tratamiento. En los tiempos sucesivos hasta la última medición T6 la concentración del contaminante
azul de metilenos supera levemente los valores del tratamiento.

Tabla 3. Eficiencia de la levadura en la remoción del colorante

DIFERENCIA DIFERENCIA
DIFERENCIA
TIEMPOS CONTROL CONTROL
TRATAMIENTO
COLORANTE LEVADURA
T1-T0 0,41 1,50 0,02
T2-T1 0,27 -0,25 0,00
T3-T2 -0,44 0,07 0,01
T4-T3 0,18 0,40 0,00
T5-T4 -0,17 -0,46 0,00
T6-T5 -0,13 0,09 0,00
Sumatoria 0,12 1,34

Fuente: Este experimento, Umanizales-2019

 Gráfica 2. Análisis de las diferencias en la interacción entre el tratamiento y los controles

Eficiencia de Levadura en la remoción del colorante

2,00

Valores tratamientos en microlitros 1,50 1,50

1,00

0,50 0,40
0,41 0,27
0,01 0,00
0,00 0,18 0,00 0,09
0,00 0,02 0,07 0,00 -0,17 -0,13
T1-T0 T2-T1
-0,25 T3-T2 T4-T3 T5-T4 T6-T5
-0,50 -0,44 -0,46

-1,00
Diferencia de tiempos

DIF. TTO. DIF. BIK COL DIF. BIK LEV.

Fuente: Este experimento, Umanizales-2019

Al realizar la diferencia entre las horas de medición para el caso del testigo de levadura de la
gráfica 2, se observó que no hay ningún tipo de accionar puesto que los valores casi en la totalidad
de los rangos es cero; es decir que sin la presencia de contaminantes la levadura es inerte, no realiza
ninguna actividad metabólica.

Contrario al fenómeno presentado con la levadura, el testigo colorante presenta una fuerte
actividad, puesto que, en la primer diferencia entre la medición T0 y T1 alcanza su nivel máximo de
1,50uL, mientras que en el mismo lapso de tiempo el tratamiento también presenta su máxima
actividad 0,41uL; ya en el segundo intervalo de tiempo entre T2 y T1, se observa un abrupto descenso
del colorante que baja hasta -0,25uL, convirtiéndose en un valor negativo; sin embargo, el tratamiento
se mantiene en el cuadrante positivo pero también se presenta un importante descenso. En la tercera
relación entre los tiempos T3 y T2 los valores del contaminante crecen positivamente alcanzando a
superar ligeramente la escala positiva con 0,07uL, caso contrario se presenta con el tratamiento que
alcanza el punto máximo negativo de la curva con -0,44uL, entendiéndose que a este nivel se presenta
la máxima actividad de biorremediación del microorganismo, es decir el nivel más alto de remoción
del contaminante. En los tiempos T4 y T3, el testigo contaminante alcanza su segundo nivel más alto
con 0,40uL; de igual manera, el tratamiento alcanza un punto positivo con 0,18uL. En el intervalo T5
y T4 el tratamiento remediador y el contaminante alcanzan valores negativos, siendo el máximo valor
negativo para el contaminante con -0,46uL. Finalmente en la diferencia de los tiempos T6 y T5 el
contaminante supera el nivel del 0, pero el tratamiento se mantiene por debajo de cero con -0,13uL,
manteniendo de esta manera el control sobre el contaminante azul de metileno.

Interpretación de resultados

Partiendo del supuesto anterior, donde se considera que “Si la disminución de adsorbancia de
los tres pocillos que contienen el tratamiento, es igual a la disminución de adsorbancia de los
controles, entonces se podrá concluir que la disminución del colorante no se podrá deber a la acción
de la Levadura, sino a cualquier otro fenómeno que se pueda estar presentando en los pocillos”; de lo
que se concluye, que según los resultados obtenidos, si se presentan diferencias entre los valores
observados en los datos del tratamiento con respecto a los datos observados del colorante.

De lo anterior, se puede inferir que bajo las condiciones del cultivo YDP y la levadura
(Saccharomyce cerevisiae) inoculada, si se presenta acción de biorremediación o remoción del
contaminante o colorante azul de metileno.