Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Polarimetria
Polarimetria
Análisis de Rating:
disacáridos. Métodos espectrofotométricos. Métodos no enzimáticos. Tell a Friend
Métodos enzimáticos.(V)
11,048 visitas
Autor: Marcie Jiménez Riani
Indice
1. Estructura y función
2. Un poco de historia...
3. Análisis de disacáridos
4. Métodos espectrofotométricos
5. Métodos no enzimáticos
6. Métodos enzimáticos
7. Bibliografía
1. Estructura y función
2. Un poco de historia...
3. Análisis de disacáridos
Estrategia
Antes de aplicar un procedimiento analítico específico es necesario tener una buena idea de
cuales carbohidratos están presentes y los rangos de concentración de las soluciones
estudiadas.
Si el sistema es completamente desconocido, una evaluación cualitativa por TLC y un análisis
de los azúcares totales presentes deben ser obtenidos primero.
La elección de la metodología cuantitativa específica va a depender de muchos factores:
Cabe notar que para muchos fines, una técnica simple y barata para el análisis de
carbohidratos puede lograr excelentes resultados- casi tan buenos como los obtenidos con
técnicas e instrumentos sofisticados y caros.
Recordar que la caracterización de un disacárido por una técnica dada, debe ser siempre
verificada por un segundo método independiente.
4. Métodos espectrofotométricos
- Magnitudes en Espectrofotometría
La transmitancia se define de la siguiente forma:
En tanto, la absorbancia se define como:
Cuando no se absorbe luz, P = Po y por lo tanto A = 0. Cuando se absorbe 90 % del haz de luz,
10 % de éste se transmite, por lo que P = Po / 10 y A = 1.
- Ley de Beer
Donde:
5. Métodos no enzimáticos
1. Fenol – H2SO4
2. Antrona - H2SO4
6. Métodos enzimáticos
1. Introducción
Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones
específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en diversos
campos del análisis como análisis clínicos, análisis de productos alimentarios, análisis de
preparados farmacéuticos etc.
El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en:
1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible determinar
específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la
cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:
a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de métodos (los más
utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática se complete o llegue al
equilibrio y se mide la variación producida en la concentración de un producto de reacción o de
un reactivo presente inicialmente en exceso.
b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reacción
enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de medida son
idénticos a los utilizados para reacciones catalíticas en general.
2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos cinéticos en los que
se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación del producto, relacionada
con la concentración de enzima en disolución.
2. Fundamentos
Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen de
especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en análisis
clínicos como en la industria alimentaria y farmacéutica se utilizan métodos enzimáticos para la
determinación de glucosa.
La glucosa oxidasa es una flavoproteína altamente específica que cataliza la oxidación de la
glucosa a -D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión
apreciable.
C6H12O6 + O2 C6H10O6 + H2O2
Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante
un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción
espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática
indicadora adecuada. Así, para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la
oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina el peróxido de
hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado según el
siguiente esquema de reacción:
H2O2 + Aceptor de oxígeno Producto coloreado + H2O
(DH2) (D)
Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin
embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de
aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina, que reacciona con el p-
hidroxibencensulfonato y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un
colorante quinonaimina con un máximo de absorción a 505 nm, de acuerdo al siguiente
esquema de reacción.
Este método, propuesto por Trinder (1) en 1972, será el empleado en esta práctica para la
determinación de glucosa en un preparado. A continuación se resumen las distintas reacciones
acopladas que se utilizarán para la determinación de la glucosa. La cantidad de colorante
generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamente proporcional a la
cantidad de glucosa.
El disacárido sacarosa puede también determinarse específicamente basándose en el
esquema de reacciones anterior, previa hidrólisis enzimática del mismo con el enzima
fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformación de la sacarosa en una
molécula de fructosa y una molécula de glucosa (azúcar invertido).
4 matraces de 100 ml
8 matraces de 25 ml
1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml
1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj.
c. Reactivos
Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la
determinación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que se indican a
continuación:
o 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L
o p-hidroxibencensulfonato 20 mmol/L
o Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 15 U/mL
o Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 10 U/mL
Pesar las cantidades adecuadas de los reactivos indicados y disolver en una disolución
reguladora de Tris 0,02 M de pH 7,0. Llevar a volumen en un matraz de 100 mL. Esta
disolución debe almacenarse en botellas color topacio y en el refrigerador.
Procedimiento
Se empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de sacarosa en una muestra de un
preparado.
Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones de glucosa
de concentraciones comprendidas entre 5 10-5 M y 5 10-4 M por dilución del patrón de
glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo Trinder y 250 µL de patrón,
mezclar e incubar exactamente 18 minutos a temperatura ambiente.
Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente a un blanco de
reactivos.
Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se disolverá y/o diluirá con
agua en la proporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado.
Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su hidrólisis
enzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2 mL de la
disolución de muestra y se mezclan con 8 mL de la disolución de invertasa. Se incuban 15
minutos a 55 ºC. La suspensión fría se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en
un matraz aforado enrasando con agua hasta la marca.realizando a continuación la
determinación del contenido total de glucosa según el procedimiento anteriormente descrito. El
contenido de sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa
obtenidas antes y después de la inversión enzimática. Expresar el contenido de glucosa y
sacarosa en la muestra en g/g de muestra.
7. Bibliografía
www.chemweb.com
www.spectragalactic.com
www.probes.com/handbook
www.netbiochem.com