PREPARACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEADAS DE SANGRE

PERIFERICA POR GRADIENTE DE DENSIDAD

Yenny Corpas1 • Manuel Alvarez1

Correspondencia: Manuelalvares1208@hotmail.com; yennycorpas@gmail.com

1 Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias, Programa de Biología, Línea de

profundización en Biotecnología, Inmunología, Sincelejo Colombia.
PROCEDIMIENTO

OBSERVACIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Se tiene un
Se obtuvo la muestra de sangre En un tubo de Falcón se
volumen final
con una jeringa de 5 ml adiciona 2 ml de sangre y un de 4 ml
previamente tratada con volumen igual de Solución de
anticoagulante. sales balanceadas

Centrifugamos a 2328 rpm por 30 min Pasar a otro tubo la sangre diluida con
Solución y dispensar muy
cuidadosamente y lentamente sobre el
Ficoll-paque plus en el tubo de
Con una micropipeta se extrae la capa centrifuga. Poner el tubo inclinado y
donde se encuentran los linfocitos apoyar la punta de la pipeta sobre la
pared del tubo para dejar deslizar la
sangre suavemente sobre el Ficoll y
Luego se adiciona tres veces poder formar una interfase (Ficoll abajo y
el volumen en sales sangre arriba)
balanceadas a la muestra
obtenida.

Para la parte final se

Re suspendemos en el pellet suavemente con centrifuga a 100g por 10min
ayuda de un pipeteador. y se descarta el
sobrenadante.

Centrifugamos la suspensión a 1164 rpm por 10

min a 20ºC
Instalamos la muestra en la
cámara de Neubauer y la
Se adiciona 6 ml de solución de sales muestra de azul de tripan y
balanceadas a los linfocitos, se se realiza el debido conteo
resuspender nuevamente. celular a 40x

1
RESULTADOS

Para realizar los estudios funcionales de células mononucleares de sangre periférica, para la práctica de
laboratorio el aislamiento de éstos a partir de muestras de sangre, se puede realizar por varios métodos, pero
en esta ocasión se realizó a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizando la centrifugación sobre
una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque. En las muestras de sangre fueron contadas
cantidades variables de leucocitos con una cámara de Neubauer, los cuales se observaron al microscopio
como células redondeadas con núcleos lobulados o no, ligeramente contrastadas con un color brillante para
células vivas y azules verdoso las células muertas (Figura 1).

Tabla 1. numero de células muertas y vivas avistadas en los cuadrantes 1,2,3 y 4 de la cámara
de Neubauer.
Para el cálculo del porciento de
Cuadrante 1
células viables en la cámara. El
Total de células vivas 6 porciento de células viables es
Total de células 2 igual al número de células no
muertas teñidas divididas por el total de
Cuadrante 2 células contadas multiplicadas por
Total de células vivas 3 100.
Total de células 1
muertas
Cuadrante 3
Total de células vivas 4
Total de células 1
muertas
Cuadrante 4
Total de células vivas 6
Total de células 7
muertas
Total de células 30

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 1
Numero de celulas por mL = 𝑋 104 𝑋 10 = 163,794 células/ml
4

Cálculo del porciento de células viables= 19/30 x 100 %= 63.33 % células viables

2
 Células
avistadas
muertas

La sangre periférica es la
fuente primaria de obtención
Células de células mononucleares. El
avistadas proceso de separación de
vivas células mononucleares del
resto de los elementos
formes de la sangre, se basa
en la diferencia de densidad
existente entre ambos.

En la imagen se identifican
células vivas por cuadrantes.

Figura 1. Observación de células

mononucleada en sangre periférica,
objetivo de 40X

Figura 3. Hemocitómetro, Neubauer;

Figura 2. Observación de fases en tubo
falcón de células mononucleada en
sangre periférica, en rojo (formación de
anillo) amarillo separación de plasma
sanguíneo.
Áreas de conteo Este sistema tiene 2
áreas de conteo separadas, cada una
debe contener de 0.1 mm3 de muestra
cuando se cubre con un cubre objetos
especial.

3
ANÁLISIS DE RESULTADOS

Por su parte, las variaciones en las cantidades de leucocitos, y por tanto de su concentración en las cuatro
muestras de la cámara de Neubauer observadas, se deben principalmente al hecho de que los leucocitos son
células asociadas a la defensa del organismo ante agentes patógenos [1] Por ende, su proporción varía de
acuerdo al estado fisiológico (cortadas, infecciones virales, bacterianas, entre otros casos) de la persona del
que se extrajeron las muestras en un momento particular. Si bien para diagnosticar de manera precisa una
enfermedad o infección hace falta entre otras cosas, determinar cuál es el tipo de leucocito asociado al
aumento [2], los valores obtenidos mediante conteo aportan información muy general y básica que puede
orientar hacia donde se debe hacer foco para dar con el diagnóstico correcto.

Las muestras número uno y cuatro (ver tabla I) presentaron altos porcentajes de viabilidad, no tan normales
debido a que eran muy poco número de células, esto puede deberse al momento de realizar la práctica no
se realizó un lavado correcto de las muestras perdiendo gran cantidad de estas.

Para nuestra muestra se tienen valores aproximados a 163,794 células/ml. Lo cual demuestra muy bajos
resultados. En la centrifugación por gradiente de densidad, la separación de una muestra se logra por
sedimentación a través de un gradiente de densidad, esto es, una solución que incrementa en densidad desde
la parte superior hacia la inferior del tubo de centrifuga, se presentaron problemas al momento del lavado
lo cual puede explicar el poco número de células avistadas.
VALORES NORMALES EN UN ANALISIS DE SANGRE: Número de leucocitos (WCC) Valor normal
entre 3.500 y 11.000/mL Los glóbulos blancos o leucocitos son células de defensa que circulan por el
torrente sanguíneo. Existen varios tipos: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos. El valor total agrupa
a la suma de todos ellos; si uno de estos tipos está elevado o disminuido, puede afectar a la cifra global.
Neutrófilos: Valor normal entre 2.000 y 7.500/mL. Son los más numerosos. Se encargan de atacar a las
sustancias extrañas (básicamente bacterias, agentes externos...) que entran en el organismo. En situaciones
de infección o inflamación su número aumenta en la sangre. En estos casos se observan algunos que son
'inmaduros' y se denominan cayados. En la analítica se indica en forma de porcentaje sólo cuando hay
infección porque en condiciones normales su cifra es cero. Linfocitos: Valor normal entre 1000 y 4500/mL.
Aumentan sobre todo en infecciones por virus o parásitos. También en algunos tumores o leucemias.
Monocitos: Valor normal entre 200 y 800/mL. Esta cifra se eleva casi siempre por infecciones originadas
por virus o parásitos.
Las sales balanceadas son moléculas inorgánicas de fácil ionización en presencia de agua, las sales disueltas
en agua siempre están ionizadas. Estas sales tienen función estructural y funciones de regulación del pH,
de la presión osmótica y de reacciones bioquímicas, en las que intervienen iones específicos. Participan en
reacciones químicas a niveles electrolíticos.
Cuando la sangre se extiende sobre el Ficoll y se expone a fuerzas centrífugas, las células
mononucleares permanecen entre el plasma y la solución Ficoll-PAQUE (ver figura 2), mientras que los
eritrocitos y los granulocitos gravitan hacia el fondo. Los linfocitos, monocitos y plaquetas no son lo
suficientemente densos para penetrar en las capas del medio de Ficoll-Paque. Estas células, por lo tanto, se
reúnen como una banda concentrada en la interfase de la muestra. Esta banda permite aislar las células
mononucleares para ser recuperadas con un alto rendimiento en un pequeño volumen [3].

El azul de tripano, azul de tripán o azul tripán es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas
para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar células vivas de células muertas. Las células vivas o

4
tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva
respecto a qué compuestos pueden atravesarla. En las células viables, con membrana intacta, no se incorpora
el azul de tripano; por el contrario, sí atraviesa la membrana de las células muertas [4].

CONCLUSIÓN

De las cuatro muestras, dos de ellas poseían concentraciones cerca de un rango normal, pero presentando
pocas células por errores de procedimiento.

En el momento de la extracción se aconseja recoger la máxima información posible relativa a la muestra,

no solo dato de conteo de células también se debe tener en cuenta la fecha y hora de extracción. Tipo de
anticoagulante. Incidencias ajenas al protocolo, manejo de la máquina de centrifuga.

El azul de tripan permite diferenciar células no viables de las viables.

Las características del método manual que se ha empleado permite definirlo como un procedimiento simple,
económico y eficiente, que puede ser empleado satisfactoriamente en centros de salud con pocos recursos
en que se desee introducir la terapia celular regenerativa, lo que podría ser una solución factible no solo
para nuestro país, sino también para otros comprendidos entre los menos desarrollados.

BIBLIOGRAFÍA

[1] Welsch U, Sobotta J. Histología. 2da edición. España: Editorial Médica Panamericana; 2009. p. 677.

[2] Rodak B. Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas. 2da edición. España: Editorial Médica
Panamericana; 2002. p. 839.

[3]Alberto Checa Rojas. (2018). Método: aislamiento de células sanguíneas por gradiente de Ficoll-
Paque. 2019, septiembre 7, Conogasi.org Sitio web: http://conogasi.org/articulos/metodo-aislamiento-de-
celulas-sanguineas-por-gradiente-de-ficoll-paque/

[4] Azul tripán (C.I. 23850) para microscopia. Hoja informativa sobre el producto comercial. Merck.

Anexo
𝑻𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 𝟏
1.1 𝐍𝐮𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐩𝐨𝐫 𝐦𝐋 = 𝑿 𝟏𝟎𝟒 𝑿 𝟏𝟎
#𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒂𝒏𝒕𝒆𝒔 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒂𝒅𝒐

= 867/4 X 10^4 X 1/10 = 216750 linfocitos/ml

1.2 216.750 en los 4 cuadrantes

1.3 Se conoce con el nombre de: Linfocitosis
1.4 Las patologías que podría dar son:
 Infección (bacteriana, viral o de otro tipo)
 Cáncer en la sangre o el sistema linfático
 Leucemia linfocítica aguda
 Leucemia linfocítica crónica
 Tuberculosis
 Trastorno auto inmunitario que provoca inflamación continua
 VIH/sida

5
2.1 el número de linfocitos por ml es:

𝑻𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 𝟏
𝐧𝐮𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐩𝐨𝐫 𝐦𝐋 = 𝑿 𝟏𝟎𝟒 𝑿
#𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒂𝒏𝒕𝒆𝒔 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒂𝒅𝒐 𝟏𝟎
47/4 X 10^4 X 1/10 = 11750

2.2 11.75 en los 4 cuadrantes

2.3 Se conoce con el nombre de: Linfopenia
2.4 Las patologías que podría dar son:
 Trastornos auto inmunitarios como: Lupus ente-matoso
 Artritis reumatoide
 Miastenias graves
 Ciertas enfermedades crónicas como: (sida, tuberculosis intensa)
 Algunos tipos de canceres como: (Leucemia, Linfomas)