Técnicas de siembra

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones

mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas
en el laboratorio en cultivos puros (o axénicos).

Aislamiento: Es la separación de un determinado microorganismo del resto de

microorganismos que le acompañan. El método más usual es la siembra por
estría simple sobre un medio de cultivo sólido adecuado dispuesta en una placa
de petri.

Para ello se toma una pequeña cantidad de muestra con un asa de platino y se
reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas
e inmovilizadas las células bacterianas. Tras la incubación en condiciones
adecuadas, cada célula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas
divisiones celulares.
Cada colonia bacteriana tiene unas características determinadas en cuanto a su
forma, borde, elevación, tamaño, consistencia, etc. Los tipos de bacterias
presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes de colonias. A
partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de
cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.
Estrías múltiples

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo
de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la
placa con agar, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no
dañar el agar.
Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente,
se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este
proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura
adecuada, siempre en posición invertida.
Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que
contenga un elevado número de gérmenes.
Técnica de los cuatro cuadrantes:

Se divide la placa en cuatro cuadrantes.

Se toma el inoculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar.
En el cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos colonias aisladas.

Estría por agotamiento

Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las

colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en
caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma
material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio
formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:

A- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando

se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres
cuadrantes de la caja de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar
con el asa nuevo material.
El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la
superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el
mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias
confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales
deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un
reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población
sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente
separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.

Por picadura o punción

Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el

tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal
de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para
estudiar la movilidad de los microorganismos.
Medio de cultivo. Semisólido (Medio SIM y MIO)
Instrumento: aguja bacteriológica
Por picadura y estría en la superficie:

En este método se siembra por picadura en el fondo del tubo y a medida que va
saliendo del botón se realiza una estría en la superficie del gel, esto se hace con la
finalidad de estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo
largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte
superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los
nutrientes del medio.

Asada en caldo:

Se esteriliza el asa y se toma el inoculo con el asa con punta redondeada y se

esteriliza la boca del tubo y el tapón y posteriormente se introduce el asa dentro
del tubo que contiene medio líquido y se agita con dos o tres movimientos
circulares, se saca el asa del tubo y se vuelve a esterilizar para eliminar el exceso
de microorganismo que haya quedado adherido.
Técnica de Barry o vaciado en placa

En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra

y a continuación se añade el medio de cultivo (agar) fundido y atemperado
aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De
esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio
de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

Técnica de dilución seriada

Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan después

de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo
determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el
número de células aisladas o microorganismos unicelulares viables como
bacterias, levaduras, también se utiliza para el conteo de esporas fúngicas
presentes en la muestra.

La muestra a inocular debe ser homogénea y no contener conglomerados de

células. Después de la incubación cada microorganismo o célula viable formará
una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el número de
colonias permitirá a su vez determinar el número de organismos viables en la
muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en
profundidad.

Generalmente la muestra original se diluye para que el número de colonias

desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y así permitir un
óptimo crecimiento y facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluye
seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se
mezclan adecuadamente. Este proceso se repite hasta obtener una dilución
apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a
una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma
(método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en
placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan.
Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias.

Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se realiza contando las

colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica
por el factor de dilución. Los resultados se expresan en colonias por ml. Los
resultados también pueden expresarse en unidades formadoras de colonias
(UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el número relativo de
microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un metro cúbico de
muestra.
Técnica de siembra con asa de Dygralski

Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el

recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la
dilución. Consiste en depositar sobre la superficie de una placa con agar una
gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos
problema y extenderlo con ayuda del cayado de un asa de Dygralski, previamente
esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco.

Todas las técnicas de siembra van acompañadas de una incubación, las placas,
en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según
el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el agua de
condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención
de colonias aisladas. Y los tubos en posición vertical en una gradilla o frasco de
contención.

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por

una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio. Entre ellos destacan:

• Disponibilidad de nutrientes adecuados

• Consistencia adecuada del medio
• Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
• Condiciones adecuadas de humedad
• Luz ambiental
• pH
• Temperatura
• Esterilidad del medio