Universidad Católica Santa Maria

Facultad de Ciencias Farmaceúticas, Bioquímicas y Biotecnológicas

Arequipa

Extracción y Purificacion de Flavonoides a partir de

pétalos de Rosa
Lenny Orana Sarmiento Sánchez
Resumen
Se realizó una extracción por Soxhlet de los pétalos de rosas rojas, primero se
hace un desengrasado con éter que fue desechada, luego la extracción con
etanol, la que se concentro y filtro, se hizo un reextracción con Acetato de Etilo
por tres veces, se desecha la fase eterea y se conserva la fase acetica. Se agregó
cloroformo para formar un precipitado, se filtra y a la fase precipitada se le
resuspende en solucion etanolica. Procedemos a hacer las pruebas de
identificación y determinación, como lo es la reacción de Shinoda y la reacción
con el Tricloruro de Aluminio.

Summary

Extraction by Soxhlet of red rose petals you made, first degreasing with ether
which was discarded is, after extraction with ethanol, which was concentrated
and filter, made a re-extraction with ethyl acetate three times, discarded the
ether phase and the acetic phase is preserved. Chloroform was added to form
a precipitate, is filtered and the precipitated phase was resuspended in ethanol
solution. We proceed to make identification tests and determination, as is the
reaction of Shinoda and reaction with aluminum trichloride.

Introducción
Los flavonoides lato sensu son pigmentos casi universales en los vegetales. Casi siempre hidrosolubles, son
responsables de la coloración de las flores, frutos y a veces de las hojas. Asi ocurre con los flavonoides amarillos
(chalconas, auronas, flavonoles amarillos), con los antocianósidos rojos, azules o violetas. Si no son
directamente visibles, contribuyen a la coloración por su papel de copigmentos: asi ocurre con las flavonas y
flavonoles incoloros que copigmentan y protegen a los antocianósidos. En algunos casos, la zona de absorción
de la molecula se situa en el ultravioleta próximo: la “coloración” se percibe únicamente por los insectos que
se sienten asi eficazmente atraídos y guiados hacia el néctar y obligados por lo tanto a asegurar el transporte
del polen que condiciona la supervivencia de la especie vegetal. Los flavonoides se encuentran también en la
cutícula foliar y en las células epidérmicas de las hojas, asegurando asi la protección de los tejidos contra los
efectos nocivos de las radiaciones ultravioletas.

Distribución y localización
Distribución
La presencia de flavonoides en las Algas no se ha demostrado hasta el momento. Aunque son frecuentes en
Bryophytas (Musgos y Hepáticas), se trata de flavonoides stricto sensu, mayoritariamente de O- y C-heterósidos
de flavonas y de derivados O-urónicos. En Pteridophytas no es mayor la variedad estructural de flavonoides,
las Psylotales y Selaginellales se caracterizan por la presencia de biflavonoides, las Equisetales por la
proantocianidoles. Los O-heterosidos de flavonoles dominan en los Helechos que, según algunos autores,
elaboran asimismo chalconas o proantocianidoles. En Gymnospermas, los proantocianidoles son bastante
constantes y se observa la presencia, en Cycadales y Coniferales (a excepción de Pinaceae) de biflavonides,
ausentes en Gnetales; la distribución de estos compuestos y de heterosidos de flavonas y flavonoles que los
acompañan varía netamente, en este caso, en función del órgano(leño, corteza, hojas). La diversidad
estructural de flavonas es máxima en Angiospermas: así una treitena de tipos de flavonoides se han podido
identificar en las Asteraceae. Numerosos autores se han encargado de relacionar la distribución de estas
moléculas con los distintos sistemas taxonómicos propuestos por los sistemáticos contemporáneos: en líneas
generales no están en desacuerdo con las tendencias evolutivas establecidas para estos sitemas. Esto permite
incluso, sobre todo en el caso de las Dicotiledoneas, la construcción de un filograna bastante coherente entre
grupos que han conservado gran cantidad de caracteres ancestrales y otros mas evolucionados.

Localización
Los heterósidos de flavonoides, hidrosolubles, se acumulan en las vacuolas y, según las especies, se concentran
en la epidermis de las hojas o se reparten entre la epidermis y el mesofilo (aunque estos dos tejidos pueden
acumular de manera especifica estructuras diferentes, como se ha podido demostrar en algunos cereales). En
el caso de las flores, se concentran en las células epidérmicas. Cuando los flavonoides se encuentran en la
cuticula foliar, se trata casi siempre de geninas libres cuya lipofilia se incrementa por la metilación, parcial o
total, de los grupos hidroxilo. Esto se refiere sobretodo a plantas de regiones aridas o semiáridas, generalmente
provistas de estructuras secretoras.

Estructura Química
Quimicamente, estas sustancias son de naturaleza fenólica y se
caracterizan por poseer dos anillos aromáticos bencénicos
unidos por un ouente de tres atomos de carbono, con la
estructura general 𝐶6 − 𝐶3 − 𝐶6′ los cuales pueden formar o no
un tercer anillo. Los anillos son denominados A, B y C; los atomos
de carbono individuales son referidos por un sistema numérico,
el cual utiliza números ordinarios para los anillos A y C y números
primos para el anillo B.
Los flavonoides naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos fenólicos y se encuentran generalmente
combinados con azucares en forma de glucosidos, aunque también se presentan con relativa frecuencia como
agliconas libres (1,2). Varios subgrupos de flavonoides son clasificados de acuerdo con la sustitución del anillo
C. En esta clasificación son de suma importancia el estado de oxidación del anillo heterocíclico y la posición del
anillo B(2,3).

Los tipos de flavonoides están relacionados por una ruta biosintetica común, la que incorpora precursores de
las rutas del shiquimato y la acetato-malonato (4,5). Posteriores modificaciones ocurren en varios estados, lo
que resulta en la extensión de la hidroxilacion, metilación, isoprenilacion, dimerización y glicosilacion,
produciendo O-glicosidos y C-glicosidos.

Flavonas y flavonoles
Presentes en vegetales y son los flavonoides mas comunes, distribuidos en todos los pigmentos amarillos de
las plantas a pesar de los carotenoides

Flavanonas y flavanonoles
Son incoloros o solo ligeramente amarillos, son compuestos que existen en muy pequeñas cantidades por eso
son los flavonoides menos conocidos.Sus glicósidos son bien conocidos –hesperidina y naringina- extraidos de
la corteza de los frutos cítricos.

Antocianinas
Siempre se encuentran como glicósidos; después de la clorofila, son el grupo mas importante de pigmentos en
las plantas visibles al ojo humano y proporcionan el color malva, rosa, violeta y azulado a numerosas flores y
frutos, como la fresa, la rosa, las manzanas y la uva constituyen hasta aproximadamente 30% de su masa seca.
Propiedades físico-químicas, extracción
Solubilidades y extracción
Aunque por regla general, los heterósidos son hidrosolubles y solubles en alcoholes, muchos de ellos poseen
una escasa hidrosolubilidad (rutósido, hesperósido). Las geninas son, en su mayoría, solubles en disolventes
orgánicos apolares; cuando contienen al menos un grupo fenólico libre, se disuelven en disoluciones de
hidróxidos alcalinos.

Los flavonoides lipófilos de los tejidos superficiales de hojas (o de frondes) se pueden extraer directamente
con disolventes de polaridad media (diclorometano); seguidamente habrá que separar las ceras y grasas que
se extraen simultáneamente (se puede lavar en principio con hexano pero la selectividad de este disolvente no
es absoluta).

Los heterosidos pueden extraerse, normalmente en caliente, con acetona o alcohol (etanol, metanol) a los que
se adiciona agua(20 a 50% según que la droga sea fresca o seca). Se puede seguidamente realizar una
evaporizacicon al vacio y, cuando el medio contenga solo agua, proceder a una serie de extracciones liquido-
liquido con disolventes no miscibles con el agua: con éter de petróleo que elimina clorofila y lípidos; con
dietileter que extrae las geninas libres; con acetato de etilo que arrastra la mayoría de los heterósidos. Los
azucares libres permanecen en la fase acuosa junto con, en caso de fracaso, los heterósidos mas polares.

La separación y purificación de los diferentes flavonoides se funda en las técnicas cromatográficas habituales
(sobre poliamida, celulosa, gel de Sephadex, etc.). Al igual que para la mayoría de metabolitos secundarios de
los vegetales, la CLAR constituye en estos últimos años el método de elección en el arsenal de las técnicas de
aislamiento de heterosidos flavonicos (fases reversas C8 o C18 con disolventes se tipo agua -o acetonitrilo, o
THF- + metanol + acido acético).

Propiedades biológicas
La principal actividad atribuida a los flavonoides es la de ser “venoactivos”, es decir, ser capaces de disminuir
la permeabilidad de los capilares sanguíneos y aumentar su resistencia. En animal, pueden reducir la
sintomatología de una hipovitaminosis C esperimental. Esta propiedad le ha valido, durante un tiempo, el
nombre de “vitamina P”. Al no ser vitaminas (una carencia en flavonoides no ocasiona ningún síndrome
especial), se habla de “factores vitamínicos P” o, mejor aun, de “factores P”. Estos términos, ambiguos, tienden
a no utilizarse: en la actualidad, a estod productos naturales y a sus derivados que los diccionarios
especializados incluyen bajo la denominación general de “vasculoprotectores y venotonicos” se les denomina
“venotropos”. Este interés de los flavonoides en controvertido: así, la FDA (Food & Drug Administration)no les
reconoce ninguna actividad; además la lectura de tratados clásicos de farmacología no permite durar sobre la
escasa importancia que, por regla general, se atribuye a su valor terapéutico. No obstante los flavonoides y las
preparaciones a base de flavonoides son objeto –en Francia y en muchos países como Alemania, España o
Italia- de amplia prescripción, de frecuente recomendación farmacéutica y de una importante automedicación,
en el terreno de patologías ciculatorias menores. Ademas algunas moléculas de estos grupos, al menos en
posologías elevadas, han podido mostrar una cierta eficacia clínica. Actualmente, interesa sobre todo la
interaccion de los flavonoides con radicales y sus posibles consecuencias en términos preventivos. Muchos
trabajos experimentales se esfuerzan asimismo en demostrar, in vitro, la actividad celular de estas moléculas
y los sitemas implicados en la respuesta inmunitaria y en la inflamación.

Por regla general los flavonoides son in vitro inhibidores enzimáticos:

 Inhibición de la histidina descarboxilasa por el quercetol o la naringenina;

 Inhibición de la elastasa;
 Inhibición de la hialuronidasa, por las flavonas y sobre todo por los proantocianidoles, lo que permite
conservar la integridad de la sustancia fundamental de la pared vascular;
 Inhibición no especifica de la catecol-O-metiltranferasa, lo que aumenta la cantidad de catecolaminas
disponibles y provoca por tanto un aumento de la resistencia vascular;
 Inhibición de la fosfodiesterasa del AMPc que explicaría, entre otras y pro parte, su actividad
antiagregante plaquetaria;
 Inhibición de la aldosa reductasa- de la que se sabe que se encuentra implicada en la patogenia de la
catarata
 Inhibición in vitro de la protein-kinasa sobre todo por la luteolina;
 Numerosos flavonoides –hipolaetina, cirsiriol, etc.- son potentes inhibidores de la 5-lipooxigenasa y
por tanto de la producción de los leucotrienos mediadores de la inflamación y de las manifestaciones
alérgicas.

Otras propiedades de los flavonoides, a menudo presentados como antiinflamatorios –lo que es compatible
con lo que se conoce como sus interacciones (in vitro) con los polinucleares y los trombocitos o también con el
metabolismo del acido araquidónico, los flavonoides pueden ser antialérgicos, hepatoprotectores (isobutrina,
hipidulina, flavanolignanos), antiespaspodicos sobre ileon de cobaya estimulado por diversos agonistas
(flavonoides de tomillo y de otras Lamiaceae), hipocolesterolemiantes, diuréticos, antibacterianos, antivirales
in vitro, etc.

Un pequeño numero de flavonoides son anticancerígenos e inhibidores del crecimiento de células tumorales
in vitro: pueden interaccionar con los enzimas del metabolismo xenobiotico, poseer efectos anti-iniciadores
y/o antipromotores o incluso ser citostáticos, es decir, citotóxicos. La mayoría de los flavonoides son, in vitro,
antimutagenicos; a contrario, algunos flavonoles son, sobre los mismos modelos, mutagenicos. Las variaciones
de actividad en función de las características estructurales no permiten ninguna generalización.

Utilización de Flavonoides en Terapeutica

Pese a los resultados parciales proporcionados por test bioquímicos o por estudios de farmacología animal, la
realidad de la eficacia clínica de la mayoría de los flavonoides –y, a forfitiori, de la de las drogas que los
contienen- casi nunca ha sido correctamente establecida. Los ensayos en el hombre –que no son normalmente
mas que meras “observaciones”-, no se realizan siempre de acuerdo con las normas actualmente en vigor para
este tipo de pruebas. Unicamente un pequeño numero de moléculas puras o de extractos estandarizados ha
podido demostrar una eficacia sintomática moderada a pesar de la subjetividad de los síntomas y de la
importancia del efecto placebo en el principal tipo de patología involucrada. Los flavonoides se utilizan sobre
todo en el terreno capilar-venoso: solos o asociados, son constituyentes habituales de vasculoprotectores y
venotonicos y de tópicos utilizados en flobologia. En general las especialidades que se disponen en la actualidad
en el mercado poseen las indicaciones o propuestas de empleo siguiente:

 Tratamiento de síntomas relacionados con la insuficiencia venolinfática (pesadez y dolores de pierna)

  Tratamiento de los signos funcionales debidos a la crisis hemorroidal.
 Mejoría de los transtornos de fragilidad capilar a nivel de la piel (petequias); tratamiento de apoyo de
transtornos funcionales de la fragilidad capilar.
 Tratamiento de metrorragias debidas a la contracepción por microprogestagenos y de metrorragias
debidas a la utilización de dispositivos intrauterinos, después de su exploración clínica o paraclinica.
 Propuesto en transtornos ligados a la circulación retiniana y/o coroidiana.
 Tratamiento del linfoedema de miembro superios consecuente al tratamiento radioquirurgico del
cáncer de mama.

Los expertos se ponen de acuerdo para subrayar que los venotropos carecn de interés demostrado en la
prevención de transtornos tróficos en pacientes que poseen varices en los miembros inferiores y en la
cicatrización de ulceras de las piernas. En la insuficiencia venosa, no poseen indicación en ausencia de
sintomatología funcional; no eximen de una terapéutica etiológica y patogénica.

Pigmentos involucrados en la Rosa Roja (Rosa Gallica sp.)

Las Antocianinas son los pigmentos mas importantes responsables del color rojo de las rosas. Estos pigmentos
pueden causar que los petalos se observen rosados, rojos, violeta o azules, dependiendo de la copigmentacion
que se presente. La copigmentacion es la interaccion de antocianinas con flavonoides y otros compuestos como
metales, alcaloides, taninnos y polisacáridos. La pigmentación de los tejidos vegetales también se afecta por el
pH y la temperatura (Jungmin et al., 2008).

Compuestos como las antocianinas y los fenoles son sintetizados con base a información genética y estadio de
desarrollo de la planta, e influenciado por factores ambientales como disponibilidad de nutrientes,
temperatura y radicación lumínica. La mayoría de los flavonoides protegen a las células de los daños
ocasionados por la luz UV y también están involucradas en la defensa de la planta en otras situaciones de estrés,
como heridas o ataque de patógenos (Grotewold, 2006).

Cuando algunas flores inician el proceso de senescencia, sus petalos cambian de color. Este cambio de color
puede disminuir el valor estético de la flor y puede ser utilizado como parámetro de senecencia. La
modificación del color puede ser causada por cambios bioquímicos de los pigmentos, por el grado de
copigmentacion y por cambios en el pH de los petalos. Entre una de las manifestaciones de estos fenómenos
bioquímicos se puede mencionar el ennegrecimiento de los petalos de la rosa roja, lo cual ocurre debido a la
oxidación ade flavonas, antocianinas y otros fenoles (Halevy y Mayak, 1979).

Métodos Experimentales de extracción

Los flavonoides en general se extraen de muestras secas y molidas. La muestra se desengrasa inicialmente
con éter de petróleo ó n-hexano, y el marco se extrae con etanol puro o del 70%. Este último es
recomendado para garantizar la extracción de los más polares. El extracto obtenido se evapora con
calentamiento no superior a los 50°C y se le hacen particiones sucesivas con éter etílico, acetato de etilo y
n-butanol. Los flavonoides apolares quedan en la fase etérea, los medianamente polares en la fase acetato
de etilo y los más polares en el nbutanol. Cada una de estas tres fracciones se puede analizar por
cromatografía en capa fina (CCF) y HPLC en fase reversa.
  Se pesaron 5g de pétalos de rosas, se somete a una extracción con éter por Soxhlet, por 3 ciclos
para el desengrasado y luego continuamos la extracción con Etanol por 5 ciclos.

 El extracto etanolico es evaporado a sequedad y suspendido en agua destilada hirviendo a 100ml

con agitación.
 La suspensión acuosa es filtrada por papel y el filtrado se lleva a una re extracción con Acetato de
Etilo, por tres veces cada una con 20ml.
 La fase Acética contiene los flavonoides los cuales precipitan al agregarle Cloroformo.
 Filtrar el precipitado, y el residuo re disolverlo en Etanol para las pruebas de identificación.

Reacción de Shinoda o Cianidina

Caracteriza compuestos de estructura benzopirona. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol –como
es el caso- se diluye con 1ml de HCl concentrado y un pedacito de cinta de Magnesio°. Despues de la reacción
se espera 5minutos, se añade 1ml de alcohol amílico, se mezclan fases y se deja reposar hasta que se separen.

 Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de la misma manera, a partir de la adicion
del HCl concentrado.
 El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o
rojo. Intensos en todos los casos.

Reaccion con el FeCl3 5%

Utilizar una solución acuosa de rutina, añadirle gotas del reactivo de FeCl3 5%. Observar a la luz UV con y sin
vapores de amoniaco en un cromatograma.
Resultados y discusiones
Discusión de resultados
Las antocianinas son mas estables en un medio acido que en un medio neutron o alcalino. En medio acido a
pH 1, la forma predominante es la del ion flavilio, el cual da el color rojo, cuando esta es sometida a pH basico
o alcalino, el ion flavilio es susceptible al ataque nucleofilio por parte del agua, produciendose la pseudobase
carbinol, esto es a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras. A un pH 7 se produce la
base quinoidal, el cual da una coloracion azul debido a cambios conformacionales y a la estabilizacion de los
electrons de Valencia del cation flavilio y la resonancia del anillo aromatico 𝐵3 .

En el caso de la reaccion de Shinoda, el extracto de Rosas en contacto con el acido clorhidrico con las Cintas de
Magnesio metalico se genera hidrogeno, este ultimo reduce al flavonoide lo cual se reconoce por la coloracion
rosada.

En la reaccion de coloracion con FeCl3, la muestra de extracto de Rosas cambio a una coloracion roja rosada.
Esto se debe a que la naturaleza polifenólica de los flavonoides, especificamente compuestos con orto-
difenoles, lleva a la formacion de coloraciones variadas en presencia de FeCl3, que en este caso por presentar
antocianinas produce una coloracion roja rosada.

Conclusiones
1. Las diferentes especies vegetales estudiadas, en especial las drogas de estas, como: los petalos de
rosas; presentan diferentes tipos de flavonoids, utilizados hoy en las industrias con fines
terapeuticos, alimentarios, etc.
2. Mediante los metodos de extraccion y las reaccion de identificacion, las rosas presentan heterosido
flanonico antocianina.
3. La muestra problema de flavonoides, presenta una relacion de flujo determinado, cercano a los
estandares empleado en UV.

Bibliografía
 BRUNETON JEAN, Farmacognosia, Editorial Acribia S.A. 2da Edicion ZARAGOZA, España
 CLAUDIA KUKLISKI, Farmacognosia, Ediciones Omega, S.A, 2000, primera impresión 2003
 DOMINGUEZ XORGE, Métodos de investigación de fitoquimica
 HARBONE J.B, Biochemistry of phenolic compounds, 1964
 Catedra de Farmacognosia y medicina Tradicional, guia de practicas- Farmacognosia, 2012
 LOCK, O. Investigacion Fitoquimica, Metodo en el Estudio de Productos Naturales. Fondo Editorial
PUCP. Lima. 1994, pp.114-130