Determinación del coeficiente de difusión del sulfato

de cobre (CuSO4) en electroforesis en gel

D. Doval, G. Prentt, D. Tirado.
Programa de Ingeniería Química, Universidad del Atlántico

Entregado octubre de 2017.

Introducción:

En biología molecular, una gran cantidad de técnicas que se realizan comúnmente requiere el uso
de la electroforesis, lo que supone una parte importante del procedimiento sistemático del análisis
(separación, purificación, preparación) de los ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría de las
biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se
encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico
hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia de las proteínas, que pueden tener
una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa, debido a su
esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el
polo positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas, que suelen ser de carga neutra, se
realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere
carga negativa; con ello se homogeneizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el
polo positivo; sólo se separarán por tamaño. El principio de la electroforesis consiste en la
migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su
peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico. [1]

Marco teórico:

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un

campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños
moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.

La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito.
Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y
están unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un
pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador
interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.

También se da la electroforesis capilar (CE); es una técnica de separación que se ha desarrollado

gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los procedimientos más
tradicionales de electroforesis. Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas, donde la
cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular,
difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte. La
electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis. Esta
técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución, portadoras
de una carga eléctrica global, bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte
(medio de desplazamiento) adecuado.
En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos,
fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150µm). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y está lleno de
una solución buffer. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del
compartimiento catódico. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que
muestra el registro de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el
cátodo serán detectadas. [2]

Técnicas Electroforéticas

Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE):

Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por el

electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico (borato), o
anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico crece con el pH del medio
electroforético.

Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC):

En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o
aniónico para formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución
retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-
hidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a
migrar sin separación.

Electroforesis capilar en gel (CGE):

Esta es la transposición de la electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está

relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las
grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Los
oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de este modo.

Isoelectroenfoque capilar (CIEF):

Esta técnica, también conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de
pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. Cada compuesto migra y se
enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula).
Seguidamente, bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se
desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este
procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH.
[2]

Metodología:

Para este proyecto consiste en la electroforesis para determinar el coeficiente e difusión forzado
de una sustancia. Esta electroforesis será horizontal, en gel, y en una caja rectangular; se
colocaron electrodos en los extremos de la caja, estos electrodos conducirán la energía que les
suministrará una fuente de alimentación con voltaje variable. Nuestro elemento a estudiar será
el ion cobre presente en el sulfato de cobre (CuSO4); dicha separación se dará por el diferencial de
potencial eléctrico donde la atracción electrostática conducirá los cationes hacia el electrodo
negativo y los aniones hacia el electrodo positivo. Una vez se observen sus recorridos se mide su
distancia y se toma el tiempo requerido para avanzar dicha distancia para calcular
experimentalmente su coeficiente de difusión.

Caja de electroforesis:

Esta caja está hecha de acrílico de 3 mm de grosor, y sus dimensiones internas son las siguientes:
20 cm de largo, 6 cm de alto y 2 cm de espesor.

Gel:

El gel usado fue goma xanthn, se preparó con una concentración de aproximadamente 3 gramos
por cada 60 ml de líquido; dicho liquido fue una solución buffer compuesta de ácido cítrico, y
bicarbonato de sodio mezclado en partes iguales diluido en agua. Esta solución se añadió con el fin
de posibilitar el paso de corriente.

Fuente de alimentación:

Es una fuente de alimentación de voltaje variable los cuales pueden ser 54, 65, 74, 92 Y 136
Voltios. Funciona con un transformador de 4.5 Amp de intensidad que se conecta a cualquier red
eléctrica. Convierte la corriente de alterna a continua mediante un puente rectificador de 10 Amp.
Los electrodos que van conectados a la salida de la fuente son láminas de zinc.

Solución buffer:

Se procedió a preparar una solución buffer de un pH aproximado de 6 a 7 mezclando una cantidad

determinada de ácido cítrico con bicarbonato de sodio en agua, se agito hasta observar una
dilución completa de estas sustancias en el medio acuoso

imagen 1. Montaje del equipo

Resultados y discusión.

Para poder medir la difusividad de la sal usada (CUSO4) se procedió a medir el desplazamiento de
esta sal en un medio poroso (Goma Xantan) bajo la acción de una diferencia de potencial
proporcionada por la fuente de poder. se tomaron datos de voltajes y longitudes los cuales se
encuentran registrados en la siguiente tabla

Voltaje Tiempo Distancia Velocidad (cm/s)

150V 964s 4,1cm 0,00425311
120V 1233s 3,5cm 0,00283861
97V 2020s 3,0cm 0,00148515
76V 3780s 2,2cm 0,00058201
52V 3300s 1,3cm 0,00039394
36V 2700s 0,8cm 0,0002963
tabla 1. Voltajes, tiempos y distancias medidos en la experiencia

Según los resultados obtenidos se alcanza a visualizar una dependencia del potencial suministrado
con respecto al tiempo y la distancia con los que iones se ven desplazados, dándonos una idea de
la proporcionalidad que existe en este problema.

Graficando el potencial eléctrico vs la velocidad de difusión y realizando una regresión lineal es

posible determinar una ecuación que prediga el comportamiento de esta sal en proceso de
difusión, en donde, se encuentra que la gráfica se ajusta a un polinomio de primer orden y con R2
igual a 0,9707.

0.0045
y = 4E-05x - 0.0013
0.004 R² = 0.9707
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
-0.0005

Grafica 1. Velocidad Vs Potencial

Para obtener un valor de velocidad de difusión debemos comprender que hay dos tipos de
difusiones, una forzada y una natural, en donde se tomara la ecuación arrojada por la gráfica y la
pendiente de esta será igual a la difusión forzada y a su vez el intercepto será el valor para la
difusión libre obteniendo así los siguientes valores de Difusividad:
Difusión forzada Difusión libre
4x10^-5 0,0013
Tabla 2. Valores de velocidad de difusión

La velocidad de difusión del ion cobre (Cu2+) a través del equipo de electroforesis es
principalmente basado en un gradiente de concentraciones de iones de la misma naturaleza pero
que al suministrar un gradiente de potencial esta fuerza impulsora de concentraciones es
despreciable en comparación con el gradiente de potenciales pudiendo asi poder despreciar esta
fuerza impulsora y concentrarles en la variabilidad de potenciales a los cuales se les pueden
suministrar al sistema.

Imagen 2. Desplazamiento del ion Cobre (Cu 2+) al polo negativo del equipo de electroforesis

Conclusiones:

Para poder utilizar la electroforesis como técnica y obtener valores de difusividad es necesario
tener en cuenta parámetros especiales y hacer un rearreglo del concepto general de
electroforesis, en donde por gradiente de potenciales eléctricos obtendremos un desplazamiento
de iones según su carga eléctrica, estos desplazamientos varían en su velocidad según el potencial
sea suministrado y asi se puede llegar a expresiones matemáticas que predigan el
comportamiento de la difusión.

Con base a los datos obtenidos se puede concluir que la velocidad es directamente proporcional
al diferencial de potencial, por lo tanto el coeficiente de difusión también lo es. También se
observó en el gel alrededor del electrodo positivo la aparición con el tiempo de un color amarillo
claro lo cual es atribuido al azufre presente en el ion sulfato; esto prueba que la separación de los
iones se llevó a cabo y se trasladaron a través del gel según su orientación electrostática.

Una de las variables a tener en cuenta es la temperatura, debido a que el flujo de electrones en los
electrodos se genera un desprendimiento de calor de estas placas causando así desviaciones en
los resultados. Al aumentar la potencia puede aumentar la producción de calor, lo que con lleva
Convección (y eso provoca una mala separación en la muestra), una disminución en la viscosidad
del medio (y por lo tanto, mayor corriente y aún más calor)
Bibliografía:

[1] ARDEMARIZ QUIMICA GENERAL David A. López de la Mora Y Ana S. Sandoval Rodríguez,
Capitulo 13, ELECTROFORESIS disponible en: file:///C:/Users/User/Downloads/13_CHAPTER_13
_ARMENDARIZ_117_126.pdf.

[2] ILLAN MORALES BECERRIL, ELECTROFORESIS. 2008. Disponible en:

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf.