Regulación enzimática

Ya sabemos que todos los procesos celulares están regulados, esta regulación necesaria, se
basa en la posibilidad de aumentar o disminuir el flujo a través de una vía. El flujo se
entiende como la velocidad de conversión del primer metabolito en el último. La regulación
de una etapa no es más que modificar la actividad de la enzima que la controla.

Mecanismos de regulación

 Generales: Se basan en la disponibilidad de sustrato o producto. Por ejemplo, la

disponibilidad de glucosa aumenta el flujo de la glucolisis, de igual forma que si
eliminamos el piruvato.

 Específicos: La regulación de la actividad de una o varias de las enzimas de la vía.

Ya que lo que se modifica es la velocidad, veamos las ecuaciones que la rigen. V =
K [S]; Vruta = [E] [metabolíto]. A través de ella podemos hacernos una idea de lo
que se modifica.

Enzimas reguladoras del flujo

En una ruta hay dos tipos principales de enzimas, las que denominamos reguladoras del
flujo, que son aquellas que al aumentar su cantidad de enzima activa aumentamos el flujo,
y aquellas que no son reguladas de forma específica.

El grado de influencia sobre el flujo a través de la vía se denomina Coeficiente de control

de flujo

Esto es así porque no podemos aumentar más el flujo de la vía que la actividad de la enzima
que estamos regulando específicamente. Para poner un ejemplo: Una hormona puede
aumentar la cantidad de enzima activa de 100 a 500 veces, de modo, que el denominador
sería 400/100 = 4. Como mucho, entonces (recordemos que no puede ser mayor que 1), el
numerador puede ser 4, pero pongamos que es 2. De esta forma tendríamos un
de 2/4 = 0,5.

Cuanto mayor coeficiente presente, más importante será la enzima en el control del flujo a
través de la vía metabólica. Estas enzimas reguladoras catalizan etapas lentas ya que la
cantidad de la cantidad de enzima activa que está presente es menor que el de la s demás de
la ruta, por ello, las etapas lentas (limitantes) son irreversibles.

Un ejemplo claro de esto es la etapa de la glucolisis catalizada por la PFK, que requiere
ATP. La bajada de la concentración del producto debido al drenaje del a vía haría que
faltara mucho para conseguir el equilibrio y, por tanto, la reacción es espontanea. En cuanto
a la ruta en general, el paso de Glu a Pyr produce ATP con una *Go' de "15,3 Kcal/mol, y
el inverso, consumiendo ADP de .4,2 Kcal/mol. Ambas son espontaneas, por lo que se
estarían dando a la vez, algo realmente estúpido para la célula. En la realidad, algunas de
las enzimas que catalizan etapas irreversibles están reguladas, como por ejemplo la que
veíamos antes, la PFK, que requiere otra enzima para la reacción inversa, la F1,6Bpasa, de
esta forma, cuando se requiere glucosa aumenta la actividad de la fosfatasa y disminuye la
de la kinasa, de forma inversa a lo que ocurre cuando hay demanda de energía.

La regulación de la enzima se puede conseguir a dos niveles:

 Regulación de la cantidad de proteína enzimática: mediante la síntesis y degradación

de la enzima. Este control como es lógico, es a largo"medio plazo.

 Regulación de la actividad catalítica: Se trata de un control muy fino y a muy corto

plazo. Esta a su ves se subdivide en:

 Cambios en la estructura covalente de la enzima de forma reversible, como por ejemplo

la fosforilación, metilación o farnesilación.

 Cambios conformacionales de la enzima por la unión de moléculas reguladoras. Se trata

del modelo típico de regulación alostérica, también es reversible.

De este modo, recordamos los distintos tipos de regulación:

 General

 Específica

 Cantidad de proteína activa

 Regulación de la actividad

 Modificación covalente de la enzima

 Unión de ligandos

Tipos de enzimas y su importancia en regulación

Podríamos preguntarnos si una enzima michaeliana puede llevar a cabo el control a

través de una vía metabólica. Para intentar dilucidarlo, no hay más que escoger un
valor para [S] pequeño y un grande en relación con Km (de forma equivalente a
como lo hacíamos para determinar [S] para Vmax, en función de Km). La diferencia
de coger [S] como Km/9 o 9·Km es de 0,1Vmax a 0,9 Vmax. Esto que significa,
pues que un aumento de aproximadamente 9 veces requiere añadir sustrato en 81
veces, algo que fisiológicamente no pasa, ya que las concentraciones de los
 metabolitos son pequeñas y no pueden variar tanto ya que romperían el equilibrio
osmótico. De hecho lo que se observa es que pequeñas variaciones en [S]
promueven variaciones de hasta 200 veces en la actividad de una enzima. De este
modo parece quedar claro que la regulación por [S] pertenece casi exclusivamente a
los enzimas alostéricos que, además, también se regulan por efectores. Una de las
características más importantes de estos enzimas es la cooperatividad, de la que
hablaremos más adelante.

Estudio de primeras enzimas de una ruta

Monod, Changeux y Jacob estudiaron las características comunes de enzimas que

catalizaban la primera reacción de una vía o ruta metabólica inhibida por el
producto final de la misma:

 El ligando regulador (efector activador o inhibidor) es distinto estructuralmente al

sustrato o al producto de la reacción.

 Muchas de ellas presentaban cinética sigmoide (algunas enzimas son reguladoras

pero con cinética michaeliana), pero hay que tener en cuenta que hay enzimas con
cinética sigmoide per no son reguladoras.

 Varios tratamientos fisico"químicos (Tº, reducción de puentes disulfuro)

desestabiliza la enzima frente al efector, sin pérdida de la actividad catalítica. Esto
es debido a la menos posibilidad de transmitir cambios conformacionales en
estructuras más flexibles, (similar a la mejor transmisión de los sonidos por sólidos
o líquidos que por el aire).

 Suelen ser hetero u oligoméricas.

La conclusión a sacar es que el efector se une a un sitio distinto del C.A. generando
cambios conformacionales en la enzima que causa un cambio en la estructura del
C.A., lo que provoca cambios en las propiedades cinéticas de la enzima. De este
trabajo surgió en término alosterísmo, no como respuesta a una cinética sigmoide,
sino a una regulación por ligando.

Cooperatividad

Se trata de la propiedad que permite responder con gran sensibilidad a cambios

relativamente pequeños en la [S], O2 para nuestro ejemplo, la Hg y Mg. Como
hacemos siempre al describir una propiedad cinética, hay que caracterizarla
matemáticamente, por ello definimos Y como el grado de saturación, definido por
el nº de sitios ocupados por el ligando dividido entre el nº total de sitios de unión.

Mioglobina
Se trata de una única cadena polipeptídica con cinética hiperbólica y un único sitio
de unión por cadena. Mediante el desarrollo de las constantes de la reacción
(constante de disociación, de equilibrio, Y) llamando P a la proteína y A al O2 se
llega a la conclusión de que Y no puede ser mayor que 1, acercándose sólo en el
caso de [A]
, cuando todos los sitios están ocupados por el ligando.

Hemoglobina

Se trata de un tetrámeno (2 ,
2 ) con un sitio de unión por subunidad, lo que hace un

total de 4. Para esta proteína

, que se denomina curva de saturación sigmoide. El exponente h para la
hemoglobina es de 2,6.

Cooperatividad infinita

Imaginamos que inmediatamente y simultaneamente, las subunidades unen ligandos

(algo que no ocurre en la Hg). La 1ª molécula que se une aumenta la afinidad de
unión del resto por parte de la proteína. El desarrollo de K, nos lleva a una ecuación,
similar a la de Hill, pero que ahora presenta n en lugar de h, definiendo n como el nº
e sitios de unión dividido entre la molécula (P). es el caso de la Hg, n = 4, que
obviamente es distinto de 2,6. Esto es debido a que no hay un equilibrio todo o nada
en la unión de ligando. Hay estadíos intermedios (Hg con 1, 2, 3, 4 sitios ocupados).
Afirmamos que en la Hg hay cooperatividad positiva, teniendo en cuenta, además,
que h<n, nunca igual.

Definimos h como una medida de lo fuerte que es la cooperatividad, en mis

palabras, la fuerza que hay que ejercer para provovar un estado más receptivo en
las subunidad de al lado. Cuando h sea próximo a n, indicará una cooperatividad
infinita, que indicará que inmediatamente de la unión del ligando se induce la unión
del resto. Para h>1 es positiva, para h=1 no hay cooperatividad (recordad las
prácticas) y para h<1 es negativa, lo que significa que la unión de un ligando
disminuye la afinidad del resto de las subunidades por el ligando.

Determinación del valor de h

Al igual que sucedía con la cinética michaeliana, la linearización de la curva de

velocidad permite obtener unos valores mucho más reales. Por ello, comenzamos
describiendo 1"Y como la fracción de sitios de unión libres, al ser 1 el máximo
grado de saturación. A partir de ahí y mediante una serie de desarrollos matemáticos
llegamos a una ecuación logarítmica:
 La representación del primer término Vs log [A] nos da una pendiente igual a n y un
corte en ordenadas que nos da el "log de K. A este representación se la denomina
representación de Hill.

Como ya vimos en prácticas, los datos que obtenemos experimentalmente no es Y,

sino la curva de velocidad, por ello, cogiendo los puntos del tramo central, más
lineal, representamos la siguiente ecuación:

El cambio de n por h se debe a la partida de un supuesto falso, una cooperatividad

infinita, al coger el tramo lineal. Definimos ahora K = K0,5 como análoga a Km, es
decir, la concentración de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima.

Modelo concertado o de simetría

Monod, Wyman y Changeux dilucidan este modelo para explicar el alosterísmo. En

el propio título se explican varias cosas, concertado implica que las dos subunidades
cambian de conformación a la vez y la simetría nos indica que las dos subunidades
tienen la misma conformación y la misma constante de disociación. Para enunciarlo
partieron de las siguientes premisas:

 La proteína es un oligómero.

 Existe en dos posibles estados conformacionales T de tenso y R de relajado. La

primera predomina cuando el ligando no está unido.

 La conformación R tiene más afinidad por el ligando, lo que significa que la

constante de disociación de T es mayor que la de R y, por lo tanto, el ligando se une
preferentemente a R.

 Todos los sitios de unión en cada estado son equivalentes (ya lo habíamos dicho, es
la condición de concertado) y tienen idénticas constantes de disociación por los
ligandos (resultado de la simetría). En definitiva, todas las subunidades cambian de
conformación a la vez

Parámetros

o
: El grado de saturación.
 o
: Fracción de proteína en estado R

o
. En ausencia de ligando L>1.

o
. De modo que, en concordancia con lo que dijimos antes C<1.

Origen de la cooperatividad

La base es que la proteína predomina en ausencia de ligando en estado T, pero el

ligando se une preferentemente a R. Por esto, nos preguntamos:

¿Cómo puede aumentar

?

 Aumentando la concentración de ligando

 Aumentando el estado R

 Las dos

Al aumentar el ligando, se satura el estado R, más receptivo, lo que lleva al

equilibrio entre las dos formas a desplazarse, aumentando a su vez el nº de sitios
activos. De este modo a mayor L (más T y menos R en situación inicial, necesaria
para que se produzca un desplazamiento, ya que si toda la proteína se encuentra en
un solo estado no hay posibilidad de cooperatividad) y menor C (KT > KR), mayor
será el efecto cooperativo (mayor h)

Regulación por interacciones alostéricas

El efecto alostérico bien sea positivo o negativo, modifica la razón del equilibrio
R"T estabilizando uno u otro.

o Activador: se une preferentemente a R aumentando su concentración, lo

que provoca los efectos mencionados en el apartado anterior.
 o Inhibidor: se une preferentemente al estado T disminuyendo R y, por tanto,
el nº de sitios activos, lo que conlleva la disminución de
.

El efecto que tienen estos dos tipos de efectores sobre las curvas de saturación
alostéricas ya los conocemos por prácticas. Si el efector alostérico se une sólo (no
preferentemente) a uno de los dos estados se pierde la cooperatividad, obteniendo
una curva de saturación hiperbólica.

Efectos alostéricos

o Homotrópicos: Son los producidos por interacciones entre moléculas

idénticas del sustrato. Se trata de cooperatividad.

o Heterotrópicos: Son los producidos por interacciones entre los efectores

alostéricos (moléculas distintas ala sustrato) y el sustrato. Se trata de la
regulación alostérica en sentido estricto.

Enzimas alostéricas

Hay dos sistemas, el K y el V, que detallaremos a continuación:

Sistemas K

Se caracteriza por tener afinidades diferentes tanto por sustrato como por ligando.
Su actividad se regula (positiva o negativamente) por cambios en la afinidad por el
sustrato. Kcat no cambia, siendo Vmax constante, sólo cambia K0,5, como se
observa en la gráficas de las hojas.

Sistemas V

Se caracteriza porque tanto R como T presentan la misma afinidad por el sustrato,

con lo que se da en enzimas alostéricas sin cooperatividad (recordemos las
premisas). LA diferencia, por tanto, entre las dos conformaciones es di distinta
Kcat. Es esto lo que permite que estos sistemas tenga representación sigmoide.

El trabajo del efector consiste en desplazar el equilibrio R"T, de modo que si

predomina la forma de menor Kcat, disminuye la velocidad, siendo entonces un
inhibidor y viceversa.

Modelo secuencial

Este modelo más complicado enunciado por Koshland, Némethy y Filmer parte de
dos premisas:
 En ausencia de ligando, la proteína existe en una única conformación (al contrario
que ocurría con el modelo de simetría).

 En presencia de ligando, el cambio de conformación es secuencial, subunidad por

subunidad.

Origen de la cooperatividad

En este modelo, son las interacciones entre las subunidades, bien positivas o
negativas, las que favorecen o impiden la unión de ligando a la adyacente. De este
modo llamamos cooperatividad positiva a la interacciones favorecedoras de la unión
de ligando y negativa a las desfavorecedoras.

Cooperatividad negativa o anticooperatividad

Este comportamiento sólo se puede explicar con el modelo secuencial. No se ajusta

la modelo concertado porque A estabiliza el estado de alta afinidad, por lo que no
puede aumentar el estado de baja afinidad.

Se caracteriza por una curva

Vs [A] sin tendencia a la saturación, con lo que no tiene nada que ver ni con la
cinética hiperbólica ni con una sigmoide, ya que a medida que se añade más sustrato
hay que ir añadiendo más y más para conseguir una subida que antes o en otros
modelos se consigue con poca variación de concentración. Se obtienen resultados
equivalentes a diferentes sitios de unión de ligando con distintas afinidades y no
interactivos.

No es lo mismo cooperatividad negativa que regulador alostérico negativo, ya

que el primero se produce por la unión de sustrato y la segunda por la de in
inhibidor distinto al sustrato. Además, un efector alostérico negativo no produce
cooperatividad negativa.

Representación de Scatchard

Una forma de dilucidar si nos enfrentamos a una cooperatividad es esta

representación. Se basa en estudios de unión de ligando a receptor, y suele utilizarse
para ver si un mismo ligando se une a dos o más tipos de receptores. Si partimos de
una proteína con un solo tipo de unión, podemos hallar la cantidad de ligando
unido, a través de filtrado y posterior contabilización (como el centelleo). El ligando
unido depende de la cantidad total de proteína y de la fracción de saturación. De ahí
se obtiene la ecuación de una hipérbola. Ya que [E] << [A] podemos considerar, de
forma equivalente a como lo hacíamos en temas anteriores que la concentración de
A libre es la total.

Si consideramos ahora una proteína oligomérica con n sitios de unión por molécula,
se nos transforma la ecuación anterior incorporando el término n multiplicando el
segundo término. A partir de esta ecuación y mediante un procesamiento se
consigue linearizarla, representando la fracción de ligando unido frente al total Vs
lo unido. De esta forma, podemos calcular (como se ve en la gráfica de las hojas) n
y K, la constante de disociación.

Una vez conocida esta linearidad, podemos comparar lo que sucede si cogemos una
población de dos proteínas con distintas n y K (siendo K1 < K2). En este caso, la
ecuación que nos define el ligando unido será la suma de las dos hipérbolas. Si esto
lo representamos podremos obtener dos tipos de curvas, una descendente desde el
primer momento, que nos indicará que hay dos poblaciones y que también se
corresponderá con una única población de una enzima alostérica con cooperatividad
negativa, ya que al cambiar K con la añadidura de ligando, la representación parece
indicar que se trata de dos poblaciones.

Si se obtiene una curva ascendente en primer lugar, indicará una verdadera suma de
afinidad conforme se aumenta el ligando unido, o lo que es lo mismo, una población
con una cooperatividad positiva.

Si se pudiera observar las dos poblaciones de forma independiente, éstas se

corresponderían con las dos rectas discontinuas.

Evidentemente aquí pasa algo, ya que si recordamos el las prácticas ese término era
S0,5 y, además, de la propia representación, es imposible que K tenga unidades de
concentración ya que se trata de un término adimensional. Por ello, y porque así lo
demostró en el examen, designamos a partir de ahora S0,5 como la concentración de
sustrato para conseguir ½ de Vmax. K es la constante de disociación

No entra la ecuación de Adair.

ENZIMOLOGÍA

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Regulación enzimática