Teoría

Los bioquímicos utilizan normalmente diversos métodos para estudiar el mecanismo de acción de
enzimas purificados. La estructura tridimensional de la proteína proporciona información importante,
que se puede completar con la obtenida por la química de proteínas clásica y por los métodos modernos
de muta génesis dirigida (el cambio de la secuencia de aminoácidos de una proteína mediante ingeniería
genética).
Estas tecnologías permiten a los enzimologos examinar el papel de aminoácidos concretos en la
estructura y en la acción del enzima. No obstante, el método más antiguo para estudiar mecanismos de
reacción enzimáticos consiste en la determinación de la velocidad de la reacción y del modo en que esta
cambia en respuesta a cambios en los parámetros experimentales, una disciplina conocida como cinética
enzimática.
Cinética Enzimática

El estudio cuantitativo de la catálisis enzimática, se denomina cinética enzimática, ésta proporciona

información sobre las velocidades de reacción. Los estudios cinéticos miden también la afinidad de las
enzimas por los sustratos y los inhibidores, y proporcionan conocimientos sobre los mecanismos de
reacción. La cinética enzimática tiene varias aplicaciones prácticas, que incluyen una mejor comprensión
de las fuerzas que regulan las rutas metabólicas y el diseño de tratamientos más adecuados.

Uno de los primeros y grandes avances en bioquímica, fue el descubrimiento de que las enzimas se unen
en forma transitoria a los sustratos, resultado de la investigación de la cinética enzimática. Emil Fischer,
en 1894, propuso que una enzima presenta una plantilla rígida, o cerradura, y que el sustrato es la llave
que le corresponde. Sólo los sustratos específicos se pueden ajustar a determinada enzima. Los primeros
estudios de cinética enzimática confirmaron que una enzima (E) se une a un sustrato para formar un
complejo enzima-sustrato (ES). Los complejos ES se forman cuando los ligandos se unen de manera no
covalente a sus lugares adecuados en el sitio activo. El sustrato reacciona en forma transitoria con la
proteína catalizadora (y con otros sustratos, en una reacción multisustratos) para formar el producto de
la reacción.
𝑬 + 𝑺 → 𝑬𝑺

El complejo ES constituye la clave para entender el comportamiento cinético, del mismo modo que
represento un punto de partida para la discusión de la catálisis. Víctor Henri, bajo la dirección de Wurtz,
propuso en 1903 que la combinación de un enzima con su molécula de sustrato para formar el complejo
ES es un paso necesario en la catálisis enzimática. Esta idea fue ampliada para dar lugar a una teoría
general de la acción enzimática, en particular a cargo de Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913.
Postularon que el enzima se combina en primer lugar de forma reversible con su sustrato formando un
complejo enzima- sustrato en un paso reversible relativamente rápido:

El complejo ES se descompone seguidamente en un segundo paso más lento dando el enzima libre y el
producto de la reacción P:
Puesto que la segunda reacción es la más lenta y limita, por tanto, la velocidad de la reacción global,
dicha velocidad global ha de ser proporcional a la concentración de la especie que reacciona en el
segundo paso, es decir, ES.

En cualquier momento de una reacción catalizada por un enzima, éste existe en dos formas, la forma
libre o sin combinar E y la forma combinada ES. A baja concentración de [S], la mayor parte del enzima
estará en la forma sin combinar E. Aquí la velocidad será proporcional a la concentración de [S] porque
el equilibrio de la ecuación será empujado hacia la formación de más ES a medida que [S] aumenta. La
velocidad inicial máxima de la reacción catalizada se observara cuando virtualmente todo el enzima de
la reacción este en forma de complejo ES y la concentración de E sea extremadamente pequeña. En estas
condiciones, el enzima esta “saturado” con su sustrato de modo que el aumento adicional de [S] no
tendrá efecto sobre la velocidad. Esta condición se producirá cuando (S) sea lo suficientemente alta
como para que todo el enzima libre se haya convertido en la forma ES. Cuando el complejo ES se
descompone dando el producto P, el enzima queda libre para catalizar la reacción con otra molécula de
sustrato. El efecto de saturación es una característica distintiva de la catálisis enzimática y es el
responsable de la meseta observada.
Cuando el enzima se mezcla inicialmente con un gran exceso de sustrato, existe un periodo inicial,
denominado estado pre estacionario, durante el cual aumenta la concentración del complejo ES.
Normalmente el estado pre estacionario es demasiado corto para que sea observado fácilmente y dura
tan solo unos microsegundos, por lo que no aparece en la gráfica. La reacción alcanza rápidamente en
estado estacionario en el que [ES] (y la concentración de otros intermedios) permanece
aproximadamente constante con el tiempo.. La Vi medida refleja generalmente el estado estacionario,
aun cuando Vi se limite a los primeros instantes de la reacción, y el análisis de las velocidades cruciales
se conoce como cinética del estado estacionario.

Si se comienza una reacción catalizada por una enzima mezclando sustrato y enzima, no hay producto
presente durante las primeras etapas de la reacción. Bajo estas condiciones se puede ignorar la reacción
inversa, donde P se combina con E y se convierte en S. Entonces, la reacción se puede describir

Constantes de velocidad:
k1: velocidad de asociación de S con E
k-1 velocidad de disociación de S a partir de ES
La constante de velocidad para el segundo paso es k2, la velocidad de formación del producto a partir
de ES. Nótese que la conversión del complejo ES en enzima libre y producto se indica con una flecha de
una dirección porque la velocidad de la reacción inversa (ES →E + P) es insignificante. La velocidad,
medida durante este corto periodo es la velocidad inicial (V0), que fue descrita anterior. La formación y
disociación de los complejos ES son reacciones que suelen ser muy rápidas ya que sólo se forman y se
rompen enlaces no covalentes. En contraste, la conversión de sustrato en producto suele ser la velocidad
limitante. Es durante este paso cuando se produce la alteración química del sustrato.
Las reacciones catalizadas por enzimas, como cualquier reacción química, se pueden describir en forma
matemática como ecuaciones de velocidad. En ellas, varias constantes indican la eficiencia y
especificidad de una enzima y en consecuencia son útiles para comparar las actividades de varias
enzimas o para evaluar la importancia fisiológica de una determinada enzima.

Ecuación de Michaelis-Menten
La curva que representa la relación entre [S] y Vi tiene la misma forma general para la mayoría de
enzimas (se acerca a una hipérbola rectangular), y se puede expresar algebraicamente mediante la
ecuación de Michaelis-Menten. Estos investigadores dedujeron esta ecuación a partir de su hipótesis
básica de que el paso limitante de velocidad en las reacciones enzimáticas es la descomposición del
complejo ES para formar el producto y el enzima libre. La ecuación es

Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, la ecuación de velocidad de una reacción catalizada

enzimáticamente con un sustrato. Es una definición de la relación cuantitativa entre la velocidad inicial
Vo, la velocidad máxima Vmax y la concentración inicial de sustrato [S], todos ellos relacionados a través
de la constante de Michaelis, De esta ecuación emerge una relación numérica importante en el caso
especial en que Vi es exactamente la mitad de vmax:

Esta es una definición práctica muy útil de Km. km es equivalente a la concentración de sustrato a la
cual Vi es la mitad de vmax. La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en
formas que son útiles para la determinación práctica de Km y Vmax .
 Interpretar el significado de KM, y Vmax

Representación gráfica de la ecuación de Michaelis y Menten.

La pendiente de la curva de v0 en función de [S] es la de una hipérbola rectangular.

La ecuación de una hipérbola rectangular es:

Dónde:
a es la asíntota de la curva (el valor de y a un valor de x infinito)
b es el punto del eje x que corresponde a un valor igual a a/2.
En los experimentos de cinética enzimática:
y = vo
x= [S]
a = Vmax (Es la velocidad máxima de la reacción a concentraciones de sustrato infinitamente grandes)
b = Km (se define como la concentración de sustrato cuando y0 es igual a la mitad de la Vmáx)

Una de las características de las curvas hiperbólicas es que parecen aplanarse a concentraciones
moderadas de sustrato, a un valor que parece ser mucho menor que la Vmáx.

La ecuación completa de velocidad es

Esta es llamada la ecuación de Michaelis-Menten, por Leonor Michaelis y Maud Menten que describe la
relación entre la velocidad inicial de una reacción y la concentración del sustrato. La pendiente de la
curva de y 0 en función de [S] es la de una hipérbola rectangular. Las curvas hiperbólicas son indicativas
de procesos donde hay una disociación simple Esta es una evidencia más de que la reacción sencilla que
se estudió es biomolecular, Implicando la asociación de E y S para formar un complejo ES.

Identificación de KM y Vmax en un gráfico de Vo vs [S]

La velocidad inicial “vo” de una reacción catalizada por un enzima es directamente proporcional a la
concentración del enzima. Para una concentración dada del enzima, vo dependerá de la concentración
del sustrato [S]. Para la mayoría de los enzimas, vo se relaciona con [S] mediante la hipérbola
representada.

A concentraciones muy bajas de S, “vo” aumenta linealmente como función de [S]; a medida que
aumenta la concentración de sustrato, el aumento de vo se produce con menor intensidad, hasta que
alcanza un valor límite llamado Velocidad máxima (Vm) a concentración de saturación de S, es decir,
cuando todos los sitios activos del enzima están ocupados por el sustrato. Cuando la velocidad de una
reacción catalizada por un enzima depende, tal como se acaba de exponer, de la concentración de
sustrato y es independiente de otros ligandos no relacionados estéricamente con el enzima, se sabe que
su cinética cumple la ecuación de Michaelis-Menten, siendo la llamada constante de Michaelis, Km , la
concentración de sustrato [S], a la que la velocidad inicial de la reacción es igual a la Vm / 2.

La dependencia de la velocidad de reacción inicial de [S] y Km puede ilustrarse al evaluar la ecuación de

Michaelis-Menten en tres condiciones.

A. Cuando [S] es mucho menor que Km ([S] << Km) el termino Km + [S] es en esencia igual a la Km.
El remplazo de Km +[S] con Km reduce la ecuación a:
 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑣𝑜 = 𝑣𝑜 = ≈ ( ) [𝑆]
𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑚 𝐾𝑚

Donde ≈ significa “aproximadamente igual a”. Dado que tanto Vmax como Km son constantes, su
proporción es una constante. En otras palabras, cuando [S] está muy por debajo de Km, vi es
proporcional a k[S]. Por ende, la velocidad de reacción inicial es directamente proporcional a [S].

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

B. Cuando [S] = Km 𝑣𝑜 = = =
𝐾𝑚+[𝑆] 2 [𝑆] 2

La ecuación declara que cuando [S] es igual a Km, la velocidad inicial es de la mitad del máximo. La
ecuación también revela que Km es la concentración de sustrato a la cual la velocidad inicial es de la
mitad del máximo.

C. Cuando [S] es mucho mayor que Km el termino Km + [S] es en esencia igual a [S]. Reemplazar
Km + [S] por [S] reduce la ecuación a:

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]

𝑣𝑜 = 𝑣𝑜 = ≈ 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚 + [𝑆] [𝑆]

De este modo, cuando [S] excede con mucho a Km, la velocidad de reacción es máxima (Vmax) y no está
afectada por aumentos adicionales de la concentración de sustrato.
 ¿Relación entre el valor de KM y la afinidad enzima-sustrato?

Interpretación de Vmax Y Km:

La Km puede variar considerablemente de un enzima a otro, e incluso para diferentes sustratos del
mismo enzima. A veces el termino se utiliza (a menudo de forma inadecuada) como una indicación de la
afinidad de un enzima por su sustrato. El significado real de Xm depende de aspectos específicos Del
mecanismo de reacción tales Como el número y velocidades relativas de los pasos individuales de la
reacción. Para reacciones de dos pasos.

Cuando k2 es limitante de velocidad, k2 << k-1 por lo que se simplifica k-1/ki que se define como constante
de disociación, Kd, del complejo ES. Cuando se dan estas condiciones, representa una medida de la
afinidad del enzima por su sustrato en el complejo ES.
Sin embargo, esta situación no es válida para la mayoría de enzimas. A veces, k2 >> k-1 por lo que km =
k2/k-i.
En otros casos k2 /k_1 son comparables por lo que km es una función más compleja de las tres
constantes, motivo por el cual La ecuación de Michaelis-Menten y el comportamiento de saturación
característico del enzima siguen siendo válidos, pero km no se puede considerar como una medida
sencilla de la afinidad por el sustrato. Aun son más comunes los casos en los que la reacción transcurre
a través de múltiples pasos después de la formación del complejo ES; en estas condiciones Km es una
función muy compleja de muchas constantes de velocidad.

Vmax también varía mucho de un enzima a otro. Si un enzima reacciona según el mecanismo de
Michaelis-Menten de dos pasos, Vmax = k2(Et] en donde k2 es el paso limitante de velocidad. No
obstante, el número de pasos en la reacción y la identidad del paso limitante de velocidad pueden variar
según el enzima. Por ejemplo, consideremos la situación, bastante frecuente, en la que la liberación del
producto, EP→ E + P, es el paso limitante de velocidad. Al inicio de la reacción (cuando la (P)) es baja),
se puede describir la reacción completa mediante el esquema
En este caso, la mayor parte del enzima se encuentra en la forma EP en condiciones de saturación, con
lo que vmax = k3lEt).

[Es útil definir una constante de velocidad más general, kcat para describir la velocidad limitante de
cualquier reacción enzimática en condiciones de saturación. Si hay varios pasos en la reacción y uno de
ellos es claramente limitante, kcat es equivalente a la constante de velocidad del paso limitante. En la
ecuación de Michaelis-Menten, kcat = Vmax/lEtl, se trasforma en:

La constante Kcat es una constante de velocidad de primer orden con unidades de tiempos inversos y
recibe también el nombre de número de recambio (en inglés tumover number). Es equivalente al número
de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y a cargo de una sola molécula
de enzima cuando el enzima está saturado con el sustrato.]