Vega Portalatino Edwin Jorge

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POSTGRADO
UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
DO
RA
Efecto de bacterias endofíticas aisladas de
SG
Solanum pimpinellifolium sobre el crecimiento
de Medicago sativa PO
DE
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
CA
CON MENCION EN
BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL
TE
IO
AUTOR : Br. EDWIN JORGE VEGA PORTALATINO

BL
ASESORA: Dra. CARMEN DEL ROSARIO TAMARIZ ANGELES

BI
TRUJILLO – PERU
2016
N° de Registro: ………
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
JURADO DICTAMINADOR
Dra. Bertha Soriano Bernilla
DO
PRESIDENTE
RA
SG
PO
Ms. Anibal Quintana Diaz
DE
SECRETARIO
CA
TE
IO
Dra. Carmen Del Rosario Tamariz Angeles

BL
MIEMBRO
BI
II
DEDICATORIA
A Dios por ser mi creador, el motor de

mi vida por no haber dejado que me
rinda en ningún momento e
iluminarme para salir adelante,
DO
porque todo lo que tengo, lo que
puedo y lo que recibo es regalo que
RA
él me ha dado.
SG
A Melania, mi madre, que es el ser
PO más maravilloso de todo el mundo.
Gracias por el apoyo moral, tu cariño
y compresión que desde niño me has
DE
brindado, por guiar mi camino y estar

junto a mí en los momentos difíciles.
CA
A Benjamín, mi padre, porque desde

TE
pequeño ha sido para mí un gran

hombre al que siempre he admirado
IO
por ser ejemplo de perseverancia y

superación.
BL
Gracias a ustedes por guiar mi vida

BI
con energía, esto ha hecho que sea

lo que soy.
A todos mis familiares y amigos que
de una u otra manera estuvieron
pendientes a lo largo de este
proceso, brindándome su apoyo
incondicional.
III
AGRADECIMIENTOS
Infinitas gracias a Dios, mi fortaleza y soporte, por permitirme concluir este

trabajo con salud y vida y por mantener siempre encendido en mí, la luz que me
guía.
DO
A mis padres Benjamín y Melania, por darme la vida, por ser el impulso
necesario para dar grandes pasos, porque me enseñaron a querer lo que hago
y por todos los sabios consejos que me permitieron hacer las cosas bien.
RA
SG
A mi asesora la Dra. Tamariz Angeles Carmen del Rosario por impartirme sus
conocimientos, por su tiempo, su paciencia, sugerencias y correcciones al
realizar este trabajo y por su invaluable supervisión que permitió la culminación
PO
de esta tesis.
DE
A mi colega Dr. Olivera Gonzales Percy Eduardo por apoyarme durante la

ejecución y culminación de mi proyecto de tesis, por sus valiosos aportes e
CA
incansable búsqueda de la verdad y las causas justas, así como sus abnegados
trabajos por la ciencia.
TE
A la Ing. Rosales Cuentas Miriam Marleni, por su inmensa colaboración en todo

IO
el proceso de la ejecución de mi tesis y siempre estar alentándome día a día.

BL
BI
Al laboratorio de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional

Santiago Antúnez de Mayolo, por la facilidades prestadas para la realización de
la presente tesis.
A todos muchas gracias.
IV
ÍNDICE
DEDICATORIA ............................................................................................... III
AGRADECIMIENTOS .................................................................................... IV
INDICE ............................................................................................................ V
DO
INDICE DE TABLAS ...................................................................................... IX
INDICE DE FIGURAS ..................................................................................... XIV
RA
INDICE DE SECUENCIAS ............................................................................. XX
SG
RESUMEN ...................................................................................................... XXI
PO
ABSTRACT ....................................................................................................XXII
DE
1. INTRODUCCION ................................................................................... 1
Objetivo general .................................................................................. 19

CA
Objetivo específico .............................................................................. 19

TE
2. MATERIAL Y MÉTODOS...................................................................... 20
2.1. Objeto de estudio ......................................................................... 20

IO
2.2. Población y muestra..................................................................... 20

BL
2.3. Variables........................................................................................ 21
BI
2.4. Instrumentación ............................................................................ 21
2.5. Métodos y Técnicas...................................................................... 22
a. Lugar de toma de muestra ........................................................ 22
b. Lugar de Procesamiento de muestras y trabajo laboratorio ...... 23
c. Aislamiento de los microorganismos endofíticos ....................... 23
d. Pruebas de promoción de crecimiento a partir de las bacterias
endofíticas aisladas .................................................................. 25
Producción de Ácido Indol Acético............................................ 25
Efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum ......................... 26
Solubilización de fosfatos ......................................................... 28
DO
Producción de sideróforos ........................................................ 28
Actividad celulolítica .................................................................. 29
RA
Actividad proteolítica ................................................................. 29
SG
e. Inoculación de bacterias endofíticas seleccionadas sobre
semillas de Medicago sativa “alfalfa” ......................................

PO 30
Preparación de suspensiones bacterianas ............................... 30

DE
Desinfección de las semillas de alfalfa ..................................... 30
Inoculación de las semillas de alfalfa ........................................ 31

CA
f. Análisis de resultados ............................................................. 32

TE
g. Identificación Molecular de la cepa con mejores resultados 33
3. RESULTADOS ...................................................................................... 34
IO
3.1. Aislamiento de bacterias endofíticas .............................................. 34

BL
3.2. Producción de Ácido Indol Acético a 24 horas ............................... 34

BI
3.3. Producción de Ácido Indol Acético a 48 horas ............................... 36
3.4. Efecto Antagónico de las cepas bacterianas endofíticas aisladas sobre
Fusarium oxysporum a los 6 días ................................................. 38
3.5. Solubilización de fosfatos de las cepas bacterianas endofíticas aisladas
a los 7 días .................................................................................... 41
VI
3.6. Evaluación de Sideróforos de las cepas bacterianas endofíticas
aisladas a los 7 días ...................................................................... 43
3.7. Evaluación de la Actividad Celulolítica de las cepas bacterianas
endofíticas aisladas a 48 horas ..................................................... 46
3.8. Evaluación de Actividad Proteolítica de las cepas bacterianas
DO
endofíticas aisladas a 48 horas ..................................................... 48
3.9. Selección de las cepas promotoras de crecimiento para la evaluación
RA
de su efecto sobre Medicago sativa .............................................. 52
SG
3.10. Porcentaje de Germinación de semillas de alfalfa inoculadas con
PO
cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a 24 horas ............. 54
3.11. Evaluación del Tamaño Radicular de las Semillas de Alfalfa

DE
Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de
5 días ............................................................................................ 57
CA
3.12. Evaluación del Tamaño del Tallo de las Semillas de Alfalfa Inoculadas
TE
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días 59
3.13. Evaluación del Número de Hojas Cotiledonales de las Semillas de

IO
Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas

BL
luego de 5 días.............................................................................. 61
BI
3.14. Evaluación del Tamaño Radicular de las Semillas de Alfalfa
Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de
5 días ............................................................................................ 63
3.15. Evaluación del Tamaño del Tallo de las Semillas de Alfalfa Inoculadas
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días 65
VII
3.16. Evaluación del Número de Hojas Cotiledonales de las Semillas de
Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas
luego de 5 días.............................................................................. 67
3.17. Identificación Molecular de las cepas bacterianas endofíticas
seleccionadas ............................................................................... 69
DO
Identificación molecular de la Cepa 21 ....................................... 71
RA
SG
PO
DE
4. DISCUSIÓN........................................................................................... 76
5. CONCLUSIONES .................................................................................. 96
CA
6. RECOMENDACIONES ......................................................................... 97
TE
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 98
8. ANEXOS ............................................................................................... 122

IO
BL
BI
VIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Datos de ubicación de la colecta en la localidad de pedregal –Trujillo
...................................................................................................... 22
Tabla 2. Análisis de varianza de la producción de AIA (μg/mL) de la cepa 35 a
DO
las 24 horas................................................................................... 128
Tabla 3. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de
RA
la cepa 24 a las 24 horas .............................................................. 129
SG
Tabla 4. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de
PO

DE

CA

TE

IO

BL

BI
IX
DO
RA
SG
PO

DE

CA

TE

IO
Tabla 19. Análisis de varianza del porcentaje de inhibición de las bacterias

BL
endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días ....... 137

BI
Tabla 20. Prueba de DUNCAN del porcentaje de inhibición de las bacterias
endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días ....... 137
Tabla 21. Análisis de varianza de solubilización de fosfatos de las bacterias
endofíticas aisladas a los 7 días ................................................... 138
Tabla 22. Prueba de DUNCAN aplicado a solubilización de fosfatos de las
bacterias endofíticas aisladas a los 7 días .................................... 138
Tabla 23. Evaluación de sideróforos de las bacterias endofíticas aisladas según
su desempeño a los 7 días ........................................................... 43
Tabla 24. Análisis de varianza de la actividad celulolítica de las bacterias
DO
endofíticas aisladas a los dos días................................................ 139
Tabla 25. Prueba de DUNCAN aplicado a la actividad Celulolítica de las
RA
bacterias endofíticas aisladas a los dos días ................................ 139
SG
Tabla 26. Análisis de varianza de la actividad proteolítica de las bacterias
PO
endofíticas aisladas a los dos días................................................ 140
Tabla 27. Prueba de DUNCAN aplicado a la actividad proteolítica de las

DE
bacterias endofíticas aisladas a los dos días ................................ 140
Tabla 28. Análisis de varianza del porcentaje de germinación de semillas de

CA
alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de

TE
24 horas ........................................................................................ 141
Tabla 29. Prueba de DUNCAN al porcentaje de germinación de semillas de

IO
alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de

BL
24 horas ........................................................................................ 141

BI
Tabla 30. Análisis de varianza del tamaño radicular de las plántulas de alfalfa
inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de
5 días ............................................................................................ 142
XI
Tabla 31. Análisis de varianza del tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa
5 días ............................................................................................ 142
Tabla 32. Prueba de DUNCAN del tamaño tallo de las plántulas de alfalfa
DO
5 días ............................................................................................ 143
Tabla 33. Análisis de varianza del número de hojas cotiledonales en alfalfa
RA
inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego
SG
de 5 días ....................................................................................... 143
PO
Tabla 34. Prueba de DUNCAN del número de hojas cotiledonales en alfalfa

DE
de 5 días ....................................................................................... 144
CA

TE
de 30 días ..................................................................................... 144
Tabla 36. Prueba de DUNCAN del tamaño radicular de las plántulas de alfalfa
IO

BL
de 30 días ..................................................................................... 145

BI
de 30 días ..................................................................................... 145
XII
Tabla 38. Prueba de DUNCAN del tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa
de 30 días ..................................................................................... 146
Tabla 39. Análisis de varianza del número de hojas verdaderas por plántulas de
alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego
DO
de 30 días ..................................................................................... 146
Tabla 40. Prueba de DUNCAN del número de hojas verdaderas por plántulas
RA
de alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de
SG
30 días .......................................................................................... 147
PO
Tabla 41. Pruebas de promoción de crecimiento realizadas para las cepas
bacterianas endofíticas aisladas ................................................... 52

DE
CA
TE
IO
BL
BI
XIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Colectando las muestras de tomate silvestre en la localidad de
pedregal – Trujillo........................................................................ 122
Figura 2. Lugar de colecta Solanum pimpinellifolium en la provincia de Trujillo
DO
localidad de pedregal .................................................................. 122
Figura 3. Prensando el material biológico para su posterior identificación.. 123
RA
Figura 4. Selección, corte y desinfección de raíz, tallo y hojas de
SG
Solanum pimpinellifolium ............................................................ 123
PO
Figura 5. Cepas bacterianas endofíticas presentes en los tejidos desinfectados
.................................................................................................... 124
DE
Figura 6. Aislamiento de cepas bacterianas endofíticas por siembra en estrías
en placas con TSA ...................................................................... 124

CA
Figura 7. Siembra de cepas bacterianas endofíticas en tubos inclinados ... 125

TE
Figura 8. Almacenamiento de cepas bacterianas endofíticas en tubos inclinados

IO
.................................................................................................... 125
BL
Figura 9. Realizando las pruebas promotoras de crecimiento .................... 126
Figura 10. Realizando pruebas de producción de AIA ................................ 126

BI
Figura 11. Curva estándar de producción de AIA ....................................... 127
Figura 12. Realizando pruebas de sideróforos ........................................... 127
Figura 13. Revelación de actividad celulolítica en las cepas bacterianas
endofíticas aisladas..................................................................... 128
XIV
Figura 14. Producción de AIA (μg/mL) de las cepas bacterianas endofíticas
aisladas a 24 horas ..................................................................... 34
Figura 15. Producción de AIA (μg/mL) de las cepas bacterianas endofíticas
aisladas a 48 horas ..................................................................... 36
Figura 16. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Fusarium oxysporum por
DO
cepas bacterianas endofíticas aisladas....................................... 38
Figura 17. Actividad antagónica de las cepas bacterianas aisladas sobre
RA
Fusarium oxysporum a los 6 días ............................................... 40
SG
Figura 18. Solubilización de fosfatos de las cepas bacterianas endofíticas
PO
aisladas a los 7 días.................................................................... 41
Figura 19. Confirmación de solubilización de fosfatos por las formación de un

DE
halo transparente alrededor del disco correspondiente a las cepas
35, cepa 26 y cepa 21 con respecto a su control negativo a los 7 días

CA
.................................................................................................... 42
TE
Figura 20. Confirmación de producción de sideróforos por el cambio de
coloración de azul a amarillo alrededor del disco correspondiente a

IO
las cepas 32, 23, 20, 29, 24 y 26 con respecto a su control negativo a
BL
los 7 días..................................................................................... 45
BI
Figura 21. Evaluación de la actividad celulolítica de las cepas bacterianas
endofíticas a los 2 días ............................................................... 46
Figura 22. Confirmación de actividad celulolítica por la formación de un halo
amarrillo alrededor del disco correspondiente a las cepas 35, cepa 24
y cepa 29 con respecto a su control negativo a los dos días ...... 47
XV
Figura 23. Evaluación de la actividad proteolítica de las cepas bacterianas
endofíticas aisladas a los dos días.............................................. 48
Figura 24. Confirmación de actividad proteolítica por la formación de un halo
transparente alrededor del disco correspondiente a las cepas 20, 31,
21, 24 y 35 con respecto a su control negativo a los dos días. Cepas
DO
con actividad proteolítica alta ...................................................... 50
Figura 25. Confirmación de actividad proteolítica por la formación de un halo
RA
transparente alrededor del disco correspondiente a las cepas 42, 29
SG
y 27 con respecto a su control negativo. Cepas con actividad
PO
proteolítica media ........................................................................ 51
Figura 26. Porcentaje de germinación de semillas de alfalfa inoculadas con

DE
cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 24 horas 54
Figura 27. Germinación de semillas de alfalfa a las 24 horas después de ser

CA
inoculadas con las cepas 29, 31, 26, 23, 21, 35 y 24.................. 56
TE
Figura 28. Tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas
bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber

IO
germinado las semillas de alfalfa ................................................ 57

BL
Figura 29. Evaluando el tamaño radicular de las semillas de alfalfa inoculadas

BI
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de
haber germinado las semillas de alfalfa ...................................... 58
Figura 30. Tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas con las cepas
XVI
Figura 31. Evaluando el tamaño del tallo de las semillas de alfalfa inoculadas
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 de haber
Figura 32. Número de hojas cotiledonales en alfalfa después de ser inoculadas
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 5 día de
DO
habergerminado las semillas de alfalfa ....................................... 61
Figura 33. Evaluando el número de hojas cotiledonales de las plántulas de
RA
alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas
SG
luego de 5 días de haber germinado las semillas de alfalfa........ 62
PO
Figura 34. Tamaño radicular de las semillas de alfalfa inoculadas con cepas

DE
Figura 35. Evaluando el tamaño radicular de las semillas de alfalfa inoculadas

CA
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 30 días de

TE
Figura 36. Tamaño del tallo de las semillas de alfalfa inoculadas con cepas
IO

BL

BI
Figura 37. Evaluando el tamaño del tallo de las semillas de alfalfa inoculadas
con bacterias endofíticas seleccionadas luego de 30 días de haber
XVII
Figura 38. Número de hojas verdaderas en alfalfa después de ser inoculadas
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 días de
Figura 39. Número de hojas verdaderas en alfalfa después de ser inoculadas
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 días de
DO
Figura 40. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas
RA
endofíticas identificadas taxonómicamente similares basados en las
SG
secuencias del gen 16S rDNA . Número de acceso TheGenBank se
PO
da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de endófitos
están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa

DE
21 ................................................................................................ 71

CA

TE

IO

BL
24 ................................................................................................ 72
BI
XVIII
26 ................................................................................................ 73
DO
RA
29 ................................................................................................ 74
SG
PO

DE

CA
35 ................................................................................................ 75
TE
IO
BL
BI
XIX
ÍNDICE DE SECUENCIAS
Secuencia 1: gen 16s rRNA de Yokenella sp. Cepa 21.............................. 148
DO
Secuencia 2: gen 16s rRNA de Bacillus subtilis Cepa 24 ........................... 149
RA
Secuencia 3: gen 16s rRNA de Paenibacillus sp. Cepa 26 ........................ 150
SG
PO
Secuencia 4: gen 16s rRNA de Serratia liquefaciens Cepa 29 ................... 151
DE
Secuencia 5: gen 16s rRNA de Bacillus subtilis Cepa 35 ........................... 152

CA
TE
IO
BL
BI
XX
Efecto de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium

sobre el crecimiento de Medicago sativa
RESUMEN
La inoculación de semillas con bacterias promotoras de crecimiento vegetal

incide de forma positiva en la germinación y emergencia de las semillas;
DO
además su aplicación sobre plantas jóvenes puede llevar a la obtención de
plantas de tamaño homogéneo, vigorosas y con desarrollo radicular adecuado
RA
para su trasplante a campo. En tal sentido se determinó el efecto de las
bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium sobre la germinación
y crecimiento de Medicago sativa, como una alternativa para optimizar el
SG
manejo agronómico. Se colectaron muestras de S. pimpinellifolium en la
localidad de Pedregal – Trujillo, se aislaron las bacterias endofíticas de las
PO
raíces, hojas y tallo usando técnicas microbiológicas. Las cepas aisladas fueron
evaluadas en la capacidad de producir AIA, sideróforos, solubilizar fosfatos,
actividad celulolítica, actividad proteolítica y actividad antagónica in vitro sobre
DE
Fusarium oxysporum. Las cepas con mejores propiedades fueron inoculadas

sobre semillas de Medicago sativa en condiciones in vitro y se evaluó el
porcentaje de germinación, crecimiento radicular, crecimiento del tallo,
CA
formación de hojas cotiledonales y verdaderas. La identificación taxonómica de

las cepas se realizó mediante el análisis del gen 16S del ADN ribosomal. De las
doce cepas endofíticas aisladas, 5 produjeron AIA, 12 tuvieron efecto
TE
antagónico sobre Fusarium oxyporum, 3 solubilizaron fosfatos, 6 produjeron

sideróforos, 3 presentaron actividad celulolítica, y 8 presentaron actividad
IO
proteolítica. Se seleccionaron 5 cepas que fueron inoculadas por separado, las

cuales indujeron al mayor porcentaje de germinación, crecimiento de la raíz y
BL
tallo, formación de hojas cotiledonales y verdaderas en Medicago sativa

“alfalfa”. De acuerdo a la identificación taxonómica molecular las cepas 24 y 35
BI
correspoden a Bacillus subtilis; las cepas 21, 29 y 26 pertenece a los géneros

Yokenella, Serratia y Paenibacillus respectivamente. Estos resultados, indican
que Solanum pimpinellifolium se encuentra asociada a bacterias endofíticas con
cualidades apropiadas para promover crecimiento de Medicago sativa.
Palabras claves: AIA, antagonismo, Fusarium oxysporum, sideróforos, celulolítico,

proteolíticos, solubilización fosfatos, germinación, y caracterización molecular.
XXI
Efecto de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium

sobre el crecimiento de Medicago sativa
ABSTRACT
Seed inoculation with plant growth promoting bacteria has a positive effect
DO
against seed germination and emergence; besides its application against young
plants can lead to the obtaining of plants with homogeneous size, vigorous and
RA
adequate root development for their field transplant. In this sense, the effect of
isolated endophytic bacteria from Solanum pimpinellifolium against the
germination and growth of Medicago sativa was determined as an alternative to
SG
optimize agronomic management. Samples of S. pimpinellifolium were collected
in the locality of Pedregal - Trujillo, the endophytic bacteria of roots, leaves and
PO
stem were isolated using microbiological techniques. The isolated strains were
evaluated for their ability to produce AIA, siderophores, phosphate solubilization,
cellulolytic activity, proteolytic activity and antagonistic activity in vitro against
DE
Fusarium oxysporum. The strains with better properties were inoculated on

Medicago sativa seeds under in vitro conditions, and the germination
percentage, root growth, stem growth, cotyledonal and true leaf formation were
CA
evaluated. The taxonomic identification of the strains was performed by 16S

gene of the ribosomal DNA analysis. Of the twelve endophytic strains isolated, 5
produced AIA, 12 had antagonistic effect against Fusarium oxyporum, 3
TE
solubilized phosphates, 6 produced siderophores, 3 had cellulolytic activity, and

8 had proteolytic activity. Five strains selected were inoculated separately, and
IO
induced the highest percentage of germination, root and stem growth,

cotyledonal and true leaves formation in Medicago sativa "alfalfa". According to
BL
the molecular taxonomic identification strains 24 and 35 were Bacillus subtilis;

the strains 21, 29 and 26 belong to the genera Yokenella, Serratia and
BI
Paenibacillus respectively. These results show that Solanum pimpinellifolium is

associated with endophytic bacteria with appropriate properties to promote
growth of Medicago sativa.
Keywords: AIA, antagonism, Fusarium oxysporum, siderophores, cellulolytic,

proteolytic, phosphate solubilization, germination and molecular
characterization.
XXII
1. INTRODUCCIÓN
El tomate cultivado Solanum lycopersicum L. es una de las hortalizas de mayor
importancia para la alimentación humana, su consumo y uso es de manera
fresca o industrialmente; es así que después de la papa es el segundo cultivo
DO
vegetal de mayor consumo y como cultivo de jardín es el más popular en el
RA
mundo (Foolad et al., 2012).
SG
A pesar de la gran cantidad de cultivares de esta especie; el cultivo de tomate
PO
se encuentra expuesto a una serie de limitaciones tal como la baja calidad, el
empobrecimiento del suelo y el uso indiscriminado de agroquímicos

DE
(Hernández; 2011); siendo susceptible a una amplia variedad de plagas y

CA
enfermedades capaces de ocasionar pérdidas del cultivo (Labate et al., 2007).

TE
A pesar de la amplia variabilidad genética presente y explotable en las especies

IO
silvestres de Solanum existen pocos cultivares con resistencia a plagas; entre

BL
ellas esta el S. habrochaites, S. Knapp, S. peruvianum y S. pennellii Correll

BI
(Razdan, 2007), S. lycopersicum , S. pimpinellifolium, S. cheesmaniae, S.
chmielewskii y S. chilense (Farrar, 1991).
El Solanum pimpinellifolium L. “tomate silvestre”, según Mostacero y Mejía,
(2002) es una especie herbácea de 4 – 5 m de alto con flores amarillas, nativa
de América y probablemente del Perú. Se extiende desde Ecuador hasta Bolivia
y Norte de Chile; crece entre los cultivos, laderas abiertas y rocosas, suelos
arcillosos, arenosos y pedregosos de aluvión ubicadas entre los 130 – 2700
m.s.n.m. en los departamentos de la Libertad, Cajamarca, Lima y Arequipa.
DO
La investigación minuciosa de todas las alternativas que puedan aumentar la
producción y favorecer el cultivo del tomate en favor de la economía de nuestro
RA
país ha estimulado el estudio de la posibilidad de disminuir el uso de
SG
agroquímicos en el cultivo de tomate y sugiere que el uso de la fertilización
PO
orgánica y el uso de inoculantes microbianos (Matson et al., 1977).
DE
En este sentido, el interés por organismos benéficos que incrementan la
productividad, mejoran la salud de la planta y que reduzcan el uso

CA
indiscriminado de agroquímicos, ha permitido generar alternativas de el control

TE
biológico para el manejo de plagas y enfermedades entre ellos se encuentra el

IO
uso de endofíticos (Hernández, 2011).

BL
Se define como endofíticos vegetales a aquellos organismos no agresivos que

BI
viven dentro de tejidos vegetales y en los últimos años han adquirido gran
importancia como una alternativa de control biológico debido a la creciente
necesidad de disminuir el uso de agroquímicos en los sistemas de producción
agrícola (Petrini, 1986).
La palabra endófito se deriva del griego endon, que significa dentro y phyte que
significa planta; de Barry fue el primero en utilizar este término (Wang et al.,
2006). Hasta la fecha, el término endófitos se refiere a los microorganismos que
pueden ser aislados de tejidos vegetales desinfestados por superficie o
extraídos del interior de la planta (Shulz y Boyle, 2006).
DO
También se puede definir como microorganismos que colonizan espacios
RA
intercelulares y vasculares en plantas sin expresar patogenicidad (Wang et al.,
SG
2006). Anteriormente se desconocían las funciones de los endófitos;
inicialmente fueron consideradas como patógenos latentes o contaminantes de

PO
una incompleta desinfestación de la superficie (Compant et al., 2005).
DE
Sin embargo, en la actualidad varios reportes han demostrado que las
microorganismos endofíticos son capaces de promover el crecimiento y la salud

CA
de la planta (Compant et al., 2005). Los microorganismos endofíticos también

TE
inhiben patógenos, ayudan a remover contaminantes, solubilizan fosfatos y

IO
contribuyen a asimilar el nitrógeno por las plantas (Wang et al., 2006).

BL
La inducción de crecimiento vegetal por microorganismos puede ser a

BI
consecuencia de la fijación de nitrógeno o la producción de fitohormonas,
biocontrol de fitopatógenos en la zona de raíz a través de la producción de
agentes antifúngicos, antibacteriales, producción de sideróforos o inmunidad
(Sessitsch et al., 2002).
Las bacterias endofíticas presentes en las plantas son muy diversas, en una
misma planta se han encontrado varias especies de endófitos, es así que los
estudios moleculares sobre diversidad de bacterias endofíticas han revelado
una gran riqueza de géneros y especies endofíticas en las misma planta
(Rosenblueth y Martínez, 2006).
DO
El número de bacterias endofíticas varía por planta y región que colonizan; por
RA
ejemplo, existen reportes de poblaciones endofíticas en raíz de arroz de 102 a
SG
103 UFC g-1 de peso fresco (Gyaneshwar et al, 2001). También se reportó en
cítricos de 103 a 104 UFC g-1 peso fresco (Araujo et al., 2002) y en caña de
PO
azúcar 102 a 106 UFC g-1 peso fresco (Mendes et al., 2007).
DE
Dentro de los mecanismos realizados por las bacterias endofíticas promotoras

CA
del crecimiento vegetal encontramos dos tipos, mecanismos directos e
indirectos; los mecanismos directos son aquellos donde los microorganismos

TE
actúan sobre la planta, como la producción de fitohormonas por ejemplo

IO
auxinas, gliberelinas y citoquininas (Bobadilla y Rincón, 2008).

BL
BI
La producción de estos metabolitos generan una mejor regulación de estomas,
evitando su deterioro asociado a depresión del crecimiento y síntomas de
marchitamiento en la planta (Reyes et al., 2008). Ocasionan también un
desarrollo radicular más ramificado jugando un papel fundamental en la
absorción de agua y nutrientes (Rivieros, 2008).
Las auxinas participan en la mitosis, alargamiento celular, formación de raíces
adventicias, dominancia apical, gravitropismo, floración, emergencia y
elongación radicular (Hans et al., 1997). Las auxinas sintetizadas durante el
proceso de germinación por el endospermo y embrión; inducen el alargamiento
de los meristemos radiculares primarios y el tallo (Li et al., 2008).
DO
Dentro del grupo de las auxinas, el ácido indol acético (AIA), es una de las
RA
auxinas naturales más importantes que pueden ser sintetizadas por diferentes
especies de bacterias, hongos y algas (Bobadilla y Rincón, 2008). Entre los más
SG
destacados encontramos a los géneros bacterianos Azospirillum, Azotobacter,
PO
Pseudomonas, Rhyzobium y Bacillus (Patten y Glick, 2002).
DE
Aunque la producción de estas fitohormonas por parte de los microorganismos

CA
está debidamente documentada, aún no se encuentran muchos estudios acerca
de los efectos fisiológicos que producen en ellos mismos (Tudzinzki y Sharon,

TE
2002). Las bacterias que habitan en varias plantas son capaces de estimular la
IO
producción de auxinas, gracias a su acción elicitora (Waisel, 2002).

BL
BI
Las vías de síntesis de AIA en bacterias son diversas y varios genes están
implicados en su regulación y expresión; como la vía del indol-3-acetamida
(IAM) en fitopatógenos y la vía del ácido indol-3-pirúvico (IpyA) en bacterias
benéficas (Lambrecht et al., 2000). Los genes responsables de la síntesis de
AIA, se encuentran en plásmidos o integrados a cromosomas (Kapulnik, 2002).
Según Hans et al. (1997), la síntesis de AIA es a partir del L-triptófano que
puede estar libre o formando parte de proteínas, donde una transaminasa se
transforma en ácido indolpirúvico el cual se descarboxila por acción de una
descarboxilasa formándose indol-acetaldehído; luego actúa una oxidasa que lo
transforma en ácido indol acético.
DO
Existen otras vías de síntesis que conducen al compuesto mediante la
RA
formación intermedia de triptamina, o bien mediante un intermediario nitrílico
SG
(Hans et al., 1997). Por lo tanto, existen dos vías principales de producción de
PO
AIA en bacterias: la vía indol-3-piruvato (IpyA) y la vía indol-3-acetamida (IAM),
ambas son dependientes de triptófano (Lambrecht et al., 2000).

DE
El aminoácido triptófano se considera el mayor precursor de la síntesis de las

CA
auxinas; sin embargo los mutantes auxotrófos de tiptófano mostraron evidencia

TE
de una ruta de síntesis independiente de triptófano (Patten y Glick, 2002) en la
que se utiliza el indol-3-glicerol fosfato como precursor, pero esta es poco

IO
conocida (Soberón et al., 2005).

BL
BI
Adicionalmente, las bacterias endofíticas pueden promover el crecimiento
vegetal mejorando la disponibilidad de fosfatos en el suelo mediante la
solubilización (Bobadilla y Rincón, 2008). Los géneros Pseudomonas, Bacillus,
Serratia, Enterobacter Flavobacterium, Streptomyces y otros; son capaces de
solubilizar in vitro fosfatos insolubles en el suelo (Mehta y Nautiyal, 2001).
Hameeda et al. (2008), reportaron que las bacterias Serratia marcescens EB 67
y Pseudomonas sp. incrementan la producción de biomasa en plantas de maíz
en condiciones de campo e invernadero, mediante la capacidad de solubilizar
fosfatos; en varios trabajos se han aislado y caracterizado de diversas especies
DO
vegetales bacterias rizosféricas solubilizadoras de fósforo.
RA
Por ejemplo, Fernández et al. (2005) estudiaron la habilidad para solubilizar
SG
fosfatos de diferentes grupos bacterianos y cepas de Bradyrhizobium sp.
PO
aislados de suelos soyeros, la evaluación fue en función del tamaño de los
halos que las cepas generaban al crecer en un medio con fosfatos insolubles
DE
como fuente de fósforo y del porcentaje de fosfato solubilizado en medio líquido.

CA
En el medio natural, la solubilización del fosfato debe ocurrir en la rizósfera

TE
debido a la lenta difusión del fosfato en el suelo y la falta de sustratos fuera de
la zona rizosférica; además los exudados radicales y residuos vegetales

IO
proveen el sustrato energético para soportar la intensa actividad microbiológica

BL
como solubilizadores de fosfato (Burbano, 1989).

BI
La solubilización de fosfatos por bacterias se da por secreción de ácidos
orgánicos como el láctico, oxálico y cítrico (Mehta y Nautiyal, 2001). En los
medios utilizados para establecer la acción fosfato solubilizadora a nivel in vitro
se desarrollan zonas claras alrededor de las colonias microbiales, las cuales
indican un viraje en el pH del medio por los ácidos orgánicos (Burbano, 1989).
Las bacterias fosfato solubilizadoras como Bacillus megaterium y Pseudomonas
fluorescens producen fosfatasas o ácidos orgánicos que solubilizan formas
orgánicas e inorgánicas de fósforo no disponible en la solución del suelo (Mehta
DO
y Nautiyal, 2001). Los mecanismos que emplean las bacterias para solubilizar
RA
compuestos insolubles de fósforo son varios y se citan a continuación.
SG
La acidificación del medio permite la liberación de fosfato en condiciones
PO
alcalinas (Arcand y Schneider, 2006). Algunos de los principales ácidos
orgánicos producidos por bacterias son el ácido glucónico y el ácido 2-

DE
cetoglucónico; también se producen los ácidos láctico, isovalérico, isobutírico,

CA
acético, glicólico, oxálico, malónico y succínico (Rodríguez y Fraga, 1999).

TE
Los ácidos orgánicos no son las únicas estrategias, algunas bacterias liberan
IO
ácidos sulfúrico y nítrico durante la actividad quimioautótrofa oxidante de

BL
amonio y azufre, por ejemplo el género Thiobacillus (Fernández et al., 2005;

BI
Vassilev et al., 2006). Según Martin (1980), la secreción de sustancias
quelantes, es otra manera en que las bacterias solubilizan el fósforo.
Los aniones de los ácidos orgánicos pueden solubilizar fósforo a través de
reacciones de quelación; que son reacciones en las que se forman dos o más
enlaces coordinados entre moléculas aniónicas o polares y un catión,
resultando una estructura de anillo también denominada complejo (Rodríguez y
Fraga, 1999).
Los aniones de ácidos orgánicos, son capaces de formar complejos estables
DO
con cationes tales como el Ca+2, Fe+2, Fe+3 y Al+3, que comúnmente están
unidos con fosfato en compuestos insolubles (Arcand y Schneider, 2006). A
RA
parte del fósforo, la concentración de hierro disponible en el suelo constituye
SG
una limitación para el desarrollo de las plantas (Rodríguez y Fraga, 1999).
PO
Del cual los microorganismos requieren hierro para su crecimiento, ya sea
DE
mediante la producción y excreción de sideróforos que son agentes quelantes
de bajo peso molecular de alta especificidad por Fe3+, formando un complejo Fe

CA
sideróforo; reconocidos y transportados al citosol por una proteína receptora

TE
específica de membrana la externa (Hantke, 2001; Mehta y Nautiyal, 2001).

IO
En este sentido, la capacidad que tienen muchas bacterias de internalizar el

BL
hierro no disponible es fundamental para la obtención de este; las formas en

BI
que lo logran son por la producción de sideróforos y ácidos orgánicos que
pueden formar complejos de hierro mejorando sus sistemas de asimilación
(Montie, 1998).
Una vez en el citoplasma se produce la liberación de hierro de los sideróforos
por una reducción de Fe (III) a Fe (II) (Faraldo y Sansom, 2003). El gen fur, se
encuentra en todas las especies bacterianas que han sido secuenciadas; es el
encargado de regular las proteínas encargadas de la captación de hierro y de
almacenamiento y uso de hierro (Miethke y Marahiel, 2007).
DO
Según Hantke ( 2001), la proteína Fur (ferric uptake regulation) es la encargada
RA
de regular la expresión de genes implicados en la captación de hierro. El
SG
reconocimiento ocurre cuando la proteína Fur forma un complejo con Fe II, por
PO
lo cual la transcripción de estos genes se bloquea en presencia de hierro y así
se inhiben los procesos de captación almacenamiento y uso de hierro.

DE
La estructura de los sideróforos así como la biosíntesis varían según las

CA
especies; sin embargo, se coincide que hay tres tipos de sideróforos según su
TE
estructura y los grupos quelantes que poseen: los hidroxamatos poseen ácidos
hidroxámicos en su estructura, los catecolatatos contienen anillos catecol y los

IO
carboxilatos contienen grupos hidroxiácidos (Miethke y Marahiel, 2007).

BL
BI
Mientras que algunas bacterias producen un tipo de sideróforos, otras secretan
varias siendo más eficientes al permitirles colonizar diferentes hábitats; por
ejemplo, E. coli produce dos tipos de sideróforos: enterobactina y aerobactona
(Montie, 1998). Estas también son consideradas sideróforos primarios en
Shigella sp., Salmonella sp., Klebsiella sp. y Yersinia sp. (Kapulnik, 2002).
10
En el caso de los sideróforos producidos por Pseudomonas fluorescens; se ha
observado pioverdinas o piocianinas que se producen en ausencia de hierro
soluble (Montie, 1998). Una forma de detectar su presencia es la siembra en
agar King B donde los pigmentos difusibles (piverdinas o piocianinas) presentan
o no fluorescencia y difusión en el medio (Kapulnik, 2002).
DO
El significado ecológico de los sideróforos por parte de las bacterias endofíticas
RA
reside en su capacidad para capturar un nutriente esencial del medio y de privar
SG
a los competidores de él, en un ambiente en el cual el hierro es escaso (Montie,
PO
1998). Se conocen más de 500 sideróforos en bacterias Gram negativas y
positivas (Kapulnik, 2002).

DE
Por otro lado, la presencia de bacterias con actividad proteolíticas que pueden
CA
mejorar la disponibilidad de nitrógeno; estos microorganismos son capaces de

TE
degradar proteínas extracelularmente; por lo tanto, participan en los procesos
de mineralización del N proteínico de los residuos orgánicos (Robertson y

IO
Groffman, 2007).
BL
BI
Este grupo de microorganismos es importante porque inician el ciclaje del N en
el suelo a partir de residuos orgánicos; además, su actividad permite la
liberación de aminoácidos y amonio que pueden ser utilizados directamente por
las plantas o microorganismos del suelo o en el proceso de nitrificación
(Hofmockel et al., 2010).
11
Del mismo modo, se ha demostrado que las bacterias endofíticas ayudan a
disminuir la resistencia a la conductividad hidráulica, permitiendo a las plantas
una mayor tolerancia a la sequía (Rivieros, 2008). Los mecanismos indirectos
son aquellos en donde el microorganismo es capaz de inhibir diferentes
patógenos que interfieren con el desarrollo de la planta (Shulz y Boyle; 2006).
DO
Los fitopatógenos como hongos y bacterias son neutralizados por diversos
RA
mecanismos propios de las bacterias endofíticas asociadas a las plantas; por
SG
ejemplo, competencia por espacio o nutrientes, producción de metabolitos
antibióticos y secreción de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared

PO
celular de los patógenos (Reyes et al., 2008).
DE
Se ha evidenciado la producción de sideróforos por bacterias, hongos y plantas

CA
monocotiledóneas en respuesta al estrés por escases de hierro (Perez et al.,

TE
2007). Como la biodisponibilidad de hierro es limitada en el suelo, la producción

IO
de sideróforos por las bacterias juega un papel importante en la competencia

BL
por este recurso porque tienen una mayor afinidad que los producidos por
hongos, limitando así a posibles patógenos (Compant et al., 2005).

BI
Según Ramírez (1998) en los últimos años, la superficie dedicada al cultivo de
tomate ha disminuido gradualmente debido a diversos factores, entre ellos: la
incidencia creciente de plagas y enfermedades. Aunque en Sinaloa se conocen
12
al menos 10 enfermedades radiculares vasculares del tomate, la más
importante es el marchitamiento vascular o fusariosis (Fusarium oxysporum).
Esta enfermedad es más agresiva en climas cálidos y suelos con textura
arenosa; sin embargo, fuertes infecciones en cultivares susceptibles se han
DO
reportado bajo condiciones de invernaderos y los daños se presentan con
mayor severidad cuando las plantas son sometidas a un período de estrés
RA
hídrico, principalmente en la etapa de floración y fructificación (González, 1974).
SG
PO
Según Girlanda (2001), Pseudomona fluorescens puede ejercer control
DE
biológico sobre hongos fitopatógenos y puede deberse a dos mecanismos: a)
la producción de sideróforos al secuestrar el hierro quedaría no disponible para

CA
los fitopatógenos y b) la producción de distintos antibióticos capaces de suprimir

TE
el crecimiento de hongos patógenos en cultivos agrícolas.

IO
BL
Existen referencias bibliográficas de los últimos cinco años que contienen una
BI
gran variedad de información científica donde los autores exponen el porcentaje
de inhibición micelial máximo obtenido en sus ensayos de antagonismo entre
bacterias y diferentes formas especiales de Fusarium oxysporum evaluadas
(González, 1974).
13
Se pudo evidenciar que en algunos casos el mejor desempeño in vitro alcanza
un 18% de inhibición micelial del patógeno, mientras que en otros casos hubo
100% de inhibición; las bacterias evaluadas en las diferentes investigaciones
provienen en su mayoría de la rizósfera de la planta de interés y en algunos
casos la procedencia fue de la rizósfera de otras plantas (Nandhini et al., 2012).
DO
RA
Nandhini et al. (2012), han encontraron antagonismos frente a Fusarium
SG
oxysporum de los géneros Streptomyces sp. y Bacillus sp. con porcentajes de
inhibición de 18% aproximadamente (Rocha y Moura, 2013), de Bacillus subtilis

PO
con 46.04% (Ramyabharathi y Raguchander, 2014), de Bacillus sp. con 50% y
DE
de Pseudomonas sp. con 70%.

CA
Todas estas bacterias provenían de rizósfera de tomate, excepto el

TE
Streptomyces sp. que fue aislado de rizósfera de árboles de naranja. Por lo

IO
tanto, se puede notar que existe gran variedad en la capacidad antagónica de

BL
los diferentes géneros de bacterias, aun cuando el patógeno es el mismo y

BI
provienen en su mayoría de la misma planta (Rocha y Moura, 2013).
Según Valencia et al. (2005), el mecanismo antagónico de la cepa
Pseudomonas fluorescens ZUM80 en concentraciones menores de hierro,
14
mostraron la inhibición total del hongo Fusarium oxysporum a menos 48 horas
de la siembra. Pero en condiciones de suficiencia de hierro, la cepa ZUM80
perdió su capacidad para inhibir al hongo.
DO
La actividad proteolítica de las bacterias endofíticas podrían jugar un papel
antagónico en hongos e insectos, habiéndose observado que podrían estar
RA
involucradas dentro del proceso de patogenicidad (López et al., 2002). Otro
SG
mecanismo indirecto es el incremento de la capacidad de respuesta sistémica
de la planta frente a los patógenos (Vessey, 2003). PO

DE
También se debe considerar que una bacteria promotora de crecimiento puede

CA
tener diferentes mecanismos para beneficiar a su hospedero vegetal como la
producción de fitohormonas, sideróforos, solubilizar fosfatos y además

TE
presentan antagonismo con uno o varios patógenos de plantas, es decir los

IO
mecanismos no son excluyentes (Rodríguez y Fraga, 1999).

BL
BI
En los años 70 se demostró que la baja tasa de germinación de algunas
semillas de hortalizas podía ser aumentada mediante el tratamiento con cepas
de Pseudomonas sp. (Kapulnik, 2002). Eklund (1970), sugirió que las quinonas
sintetizadas por las bacterias promotoras de crecimiento eran las responsables
de este fenómeno induciendo un incremento en la emergencia de las semillas.
15
Posteriormente, el mismo evento fue reportado en Canadá en la emergencia de
semillas de soya y canola (Kapulnik, 2002). Es evidente que las hormonas
vegetales juegan un papel importante en el proceso de germinación y su
aplicación exógena mejora el proceso (Eklund, 1970), y las bacterias son una
DO
fuente potencial exógena de hormonas vegetales (Rojas, 1987).
RA
La diversidad de bacterias dispersas en la naturaleza es difícil de estudiar
SG
debido a la complejidad de sus hábitats y problemas para obtener cultivos
PO
puros, desconociéndose hasta el 99% de estos (Vandamme et al., 1996). En
algunos casos se conoce parcialmente sus requerimientos metabólicos y en

DE
otros requieren períodos de incubación prolongados (Lathe, 1985).

CA
Sin embargo, en los últimos años se han descrito técnicas moleculares

TE
aplicadas a la ecología microbiana; las cuales han facilitado la identificación y
clasificación de microorganismos que incluso se encuentran como parásitos,

IO
saprofitos, comensales, simbiontes o endófitos de las plantas (Rademaker et

BL
al., 2005).
BI
Entonces, las técnicas moleculares basados en el secuenciamiento del ADN
es utilizada para la identificación taxonómica y se aplica por la necesidad de
establecer un sistema de identificación de nuevos microorganismos que
16
complemente la identificación morfológica y química (Vandamme et al., 1996),
donde la mas utilizada es del gen ARNr 16S (Lathe, 1985).
El gen ribosómico 16S (Woese, 1987) conocido también como 16S ADNr tiene
DO
aproximadamente 1500 nucleótidos, que además de tener regiones
conservadas que permiten el estudio de las relaciones entre taxones distantes,
RA
contiene regiones muy variables que se utilizan en la diferenciación de géneros
SG
y especies (Stackebrandt et al., 2002).
PO
Por otro lado, el uso de bacterias endofíticas para la mejora de la planta en su
DE
producción y en la disminución del uso de agroquímicos para no contaminar
agua y suelos se está convirtiendo en una práctica más ampliamente aceptada

CA
en muchos países como Australia, Bélgica, Egipto, Nueva Zelanda, Rusia, Los
TE
Países Bajos y EE.UU (Rodríguez y Fraga, 1999).

IO
El producto comercial "Azotogen" contiene Azotobacter que se introdujo en

BL
Rusia durante 1937, así mismo el biofertilizante "Azogreen" es usado

BI
comercialmente por los productores de maíz en Francia; en Cuba varios
biofertilizantes esta compuesto por cepas de Azotobacter, Rhizobium,
Azospirillum y Burkholderia que se producen comercialmente y se emplean en
diferentes cultivos (Fages, 1994).
17
Considerando lo anterior, en el presente trabajo se aislaron 12 cepas
bacterianas endofíticas de Solanum pimpinellifolium los cuales se evaluaron las
capacidades de promoción de crecimiento vegetal en la producción de AIA a 24
y 48 horas, efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum, solubilización de
fosfatos, sideróforos, actividad celulolítica y actividad proteolítica a fin de
DO
seleccionar 5 cepas bacterianas endofíticas y evaluar sus efectos sobre la
germinación y el crecimiento de Medicago sativa, lo cual servirá de referente
RA
para posteriores estudios y aplicaciones biotecnológicas.
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
18
OBJETIVO GENERAL
 Determinar el efecto de las bacterias endofíticas aisladas de
Solanum pimpinellifolium sobre el crecimiento de Medicago sativa.
DO
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
RA
 Aislar bacterias endofíticas de hojas, tallos y raíces de la planta
SG
Solanum pimpinellifolium "tomate silvestre”.

PO
Seleccionar y evaluar las bacterias endofíticas aisladas de la planta de
Solanum pimpinellifolium “tomate silvestre” que presenten mejores

DE
capacidades en la producción de Ácido Indol Acético (IAA) a 24 y 48 horas,
efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum, solubilización de fosfatos,

CA
sideróforos, actividad celulolítica y actividad proteolítica para ser utilizadas

TE
como promotores de crecimiento en plantas de alfalfa.

IO
 Evaluar las bacterias endofíticas seleccionadas in vitro su capacidad

BL
promotora de crecimiento en semillas de Medicago sativa “alfalfa”.
 Identificar molecularmente mediante la técnica de 16 S ADN ribosomal las

BI
bacterias con mejores resultados.
19
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Objeto de estudio
Tallos, raíces y hojas de Solanum pimpinellifolium

Cepas de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium
DO
Cultivos de Fusarium oxysporum
Semillas y plántulas germinadas de Medicago sativa
RA
SG
2.2. Población y muestra PO
La población de estudio estuvo compuesta por plantas de
DE
Solanum pimpinellifolium “tomate silvestre” de diferentes puntos dentro de

la localidad de Pedregal - Trujillo. La muestra correspondió a cada una de
CA
las plantas evaluadas durante el proceso de aislamiento de bacterias

endofíticas.
TE
En el Medicago sativa “alfalfa” la población estuvo compuesta por todas la

IO
semillas adquiridas de la tienda comercial Agropecuaria Chimú – Trujillo.

BL
La muestra correspondió a cada una de las semillas utilizadas para la

inducción de crecimiento por parte de las bacterias endofíticas
BI
seleccionadas.
20
2.3. Variables
Variable independiente
 Cepas de bacterias endofìticas aisladas de Solanum pimpinellifolium
Variable dependiente
DO
 Actividades de promoción de crecimiento vegetal: producción de Ácido
RA
Indol Acético (IAA) a 24 y 48 horas, efecto antagónico sobre Fusarium
SG
oxysporum, solubilización de fosfatos, sideróforos, actividad
celulolítica y actividad proteolítica para ser utilizadas como promotores

PO
de crecimiento en plantas de alfalfa.
 Germinación y el crecimiento de Medicago sativa frente a la

DE
inoculación con cepas bacterianas endofiticas seleccionadas.

CA
2.4. Instrumentación
TE
Las fuentes de datos en la recolección de la información fueron notas de

IO
campo, producto de las actividades de observación como técnica de

BL
investigación, textos, revistas especializada tales como artículos

BI
científicos, tesis y otras.
21
2.5. Métodos y técnicas
a. Lugar de toma de muestra
Las plantas de Solanum pimpinellifolium “tomate silvestre” fueron
colectadas durante el mes de mayo del 2015 en el departamento de la
Libertad; en la localidad de Pedregal - Trujillo.
DO
Las plantas seleccionadas fueron aquellas que no presentaron síntomas
RA
de enfermedades y con mejores características morfológicas, tal como
hojas verdes sin decoloración.
SG
Las plantas fueron extraídos del suelo de una profundidad de 30 cm
PO
aproximadamente y se guardaron en bolsas estériles; una vez colectadas
se trasladaron rápidamente al laboratorio para su procesamiento (Fig. 1).

DE
Se registraron los datos de ubicación de las plantas colectadas utilizando

CA
un GPS (Tabla 1) y la representación gráfica obtenida por google earth

TE
(Figura 2).
IO
BL
Tabla 1. Datos de ubicación de la colecta en la localidad de pedregal - Trujillo

BI
NOMBRE LATITUD LONGITUD ALTURA
Solanum
8°00'14.87"S 78°49'36.16"O 397 m
pimpinellifolium
22
Por lo menos 04 ejemplares de la muestra fueron prensados (Figura 3)
para su determinación en el Herbario David Smith de la Universidad
Nacional Santiago Antúnez de Mayolo – Huaraz, y preservación del
voucher respectivo. La determinación botánica se hizo mediante la técnica
de comparación.
DO
b. Lugar de procesamiento de muestras y trabajo de laboratorio
RA
El trabajo experimental se realizó en el Laboratorio de Biología de La
Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Santiago Antúnez de
SG
Mayolo – Huaraz
PO
c. El aislamiento de los microorganismos endofíticos comprende:
DE
Desinfección del área superficial de la planta: Las plantas fueron

CA
lavadas con agua corriente para retirar los residuos de tierra y restos de
TE
hojas secas de su superficie, luego se seleccionaron la raíz, tallo y hojas

IO
que presentaron buenas características morfológicas, las cuales fueron
cortadas en trozos muy pequeños con un bisturí estéril. Estos tejidos se

BL
lavaron con solución de agua jabonosa al 10% (p/v) por 20 minutos y

BI
agitación constante, luego se lavaron 3 veces con agua potable y
agitación constante (Figura 4).
Finalmente se hizo la desinfección con dicloruro de mercurio (HgCl2) al
0,1 % (p/v); en el caso de la raíz 15 minutos, tallo 10 minutos y hojas 5
23
minutos, luego las muestras fueron lavadas con agua destilada estéril por
tres veces en condiciones de asepsia.
Siembra de los microorganismos endofíticos presentes en los tejidos
desinfectados: Los tejidos previamente desinfectados fueron colocados
DO
previamente en viales con Caldo Tripticaso de Soya (TSB) por 3 minutos
para un control de desinfección superficial. Luego los tejidos fueron
RA
trasferidos a un vial con Agar Tripticaso de soya (TSA) suplementado con
SG
Fungizona. Se incubó a 30°C por 48 horas. Luego se evaluó el
crecimiento microbiano en el control desinfección y el medio TSA a los 3

PO
días después de su siembra. Serán considerados como endofíticos los
microbios que hayan crecido en TSA más no en su control en TSB

DE
(Figura 5).
CA
Aislamiento y purificación: Los microorganismos seleccionados como

TE
endofíticos fueron purificados por estrías sucesivas en placas con medio

IO
Tripticaso de soya (TSA) (Figura 6), luego sembrados (Figura 7) y

BL
almacenadas en tubos inclinados con TSA a 4°C por un periodo de 1 mes

BI
(Figura 8).
24
d. Pruebas de promoción de crecimiento a partir de las bacterias
endofíticas aisladas (Figura 8):
 Producción de Ácido Indol Acético (IAA): Para la cuantificación de
Ácido Indol-acético (AIA) se siguió la metodología descrita por Celis y
DO
Gallardo (2008) y algunas modificaciones. Los cultivos bacterianos
endofíticos jóvenes de 16 horas fueron diluidos en solución salina 0,8%
RA
estéril hasta conseguir una turbidez de 0,5 de densidad óptica (DO) a 620
SG
nm de longitud de onda. Esta suspensión bacteriana (SB) a 0,5 de
PO
densidad óptica fue diluida en solución salina (SS) a las proporciones: 5:0
(50 µl SB/ 0 µl SS), 4:1 (40 µl SB/10 µl SS), 3:2 (30 µl SB/20 µl SS), 2:3
DE
(20 µl SB/30 µl SS) y 1:4 (10 µl SB/40 µl SS); para obtener inóculos a
concentraciones de 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 y 0,1 de densidad óptica a 620nm

CA
(DO620).
TE
IO
Se inoculó 50 µl de cada dilución sobre microtubos con 1 ml de Caldo
Tripticaso de soya (TSB) suplementado con L-triptófano a una

BL
concentración de 20 mg/ml y se incubó por 24 y 48 horas. Cumplido el

BI
tiempo, se centrifugó a 13000 rpm durante 2 minutos y se tomó 100 µl del
sobrenadante.
25
Para evidenciar la presencia de AIA se usó el reactivo de salkowsky (35%
HClO4, 1% FeCl3), para lo cual se mezclaron el reactivo y el sobrenadante
en la relación 1:1, se dejó en oscuridad durante 30 minutos (Figura 9).
Para cuantificar la concentración de Ácido Indol Acético (IAA) producido,
DO
se midió la absorbancia a 514nm de longitud de onda usando un
espectrofotómetro. La concentración fue estimada con una curva estándar
RA
de AIA preparada a las mismas condiciones pero usando AIA a diferentes
SG
concentraciones (Figura 10).
PO
 Efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum
DE
Reactivación de Fusarium oxysporum

CA
El hongo Fusarium oxysporum fue donado por el Laboratorio de Biología
de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Santiago Antúnez

TE
de Mayolo el cual fueron reactivado en Medio Agar Papa Dextrosa (PDA)

IO
en tubos inclinados a una temperatura de 28 oC e incubados por 7 días en

BL
condiciones de asepsia.
BI
El Fusarium oxysporum reactivado se sembró por estrías sobre placas con
agar papa dextrosa (PDA) y se incubó por 5 días a 28 oC. Para luego
obtener discos de cultivo de 5 mm de diámetro.
26
Preparación de bacterias endofíticas
Los cultivos bacterianos endofíticos aislados fueron sembrados en tubos
con Agar tripticaso de soya (TSA) e incubados por 24 horas a una
temperatura de 28oC.
DO
Pruebas de antagonismo
Los cultivos bacterianos jóvenes fueron diluidos a 0.08 – 0.1 de densidad
RA
óptica (DO) a 620 nm y con un hisopo se sembraron sobre placas con
SG
medio Agar Papa Dextrosa (PDA) homogéneamente. De inmediato se
PO
colocó en cada cuadrante de la placa 4 discos de agar con micelio del
patógeno Fusarium oxysporum. En una placa se colocó el hongo sin la

DE
bacteria endofítica como prueba control. Todas las placas fueron
incubados a 28oC por 6 días. El antagonismo de las bacterias endofíticas

CA
se comprobó evaluando las variables: diámetro de los halos de inhibición

TE
expresados en porcentaje.
IO
BL
Cálculo del porcentaje de inhibición:

BI
I. Promedio del halo – tamaño del disco (0,5cm) = Tamaño real del halo.
(cuadro 2)
II. I = [(C-T)/C] x 100
Donde I es el porcentaje inhibición (% I), C es el diámetro del micelio
del control y T es el diámetro del micelio del tratamiento por cepa
bacteriana. (Cuadro 3)
27
 Solubilización de fosfatos
La capacidad de las bacterias aisladas para solubilizar el fosfato fue
probado en el medio de cultivo National Botanical Research Institute’s
Phosphate (NBRIP) que contiene: 1% glucosa, 0.5% Ca 5(PO4)3OH, 0.5%
MgCl2.6 H2O, 0,025% MgSO4.7 H2O, 0,02% KCl, 0.01% (NH4)2SO4, 1,5%
DO
agar-agar y pH 7. En la placa conteniendo el medio se colocaron cuatro
RA
discos de papel filtro estériles 0,5 cm de diámetro.
Los cultivos bacterianos jóvenes fueron diluídos a 0.08 – 0.1 de densidad
SG
óptica (DO) a 620nm. Se inoculó 2 µl dos en discos y dos fueron
PO
inoculados con agua como control de contaminación. Se incubaron a 28
oC por 7 días. Se seleccionaron las bacterias endofíticas que hayan
DE
formado halo en el medio NBRIP, porque solubilizaron el fosfato.

CA
 Producción de sideróforos
TE
La producción de sideróforos por diversas cepas bacterianas endofiticas

IO
aisladas del “tomate silvestre” fue determinada con la metodología de

BL
Schwyn y Neilands (1987). Primero se preparó una solución stock de 10

BI
ml hierro III (1 mM FeCl3.6H2O y 10 mM HCl). Luego en un matraz se
mezcló el 0,009g de Chrome Azurol, 0,01 g HDTMA, 1,5 ml solución Stock
de hierro y 1.5% agar agar en un volumen total de 150 ml y posteriormente
se esterilizó en autoclave. En una placa se distribuyó por la mitad el
medio azurol y TSA (Tripticaso de Soya Agar). Los cultivos bacterianos
28
jóvenes fueron diluidos a 0.08 – 0.1 de densidad óptica (DO) a 620nm y se
incubaron a 28 oC por 7 días (Figura 11). Se seleccionaron las bacterias
endofíticas que hayan formado halo en el medio Chrome Azurol,
cambiando de azul a amarillo.
DO
 Actividad celulolítica
RA
Para poder evaluar la actividad celulolítica se preparó un medio con 0,6%
SG
TSB quintos, 1% CMC y 1,5% agar agar. Los cultivos bacterianos jóvenes
fueron diluidos a 0.08 – 0.1

PO de densidad óptica (DO) a 620 nm e
inoculados en medio agar celulosa en discos de papel filtro y fueron

DE
incubados a 28 oC por 2 días.

CA
Luego se procedió a revelar las placas con rojo de Congo durante 15
minutos y posteriormente se lavó con 1 M NaCl en agitación constante

TE
(Figura 12). Se seleccionaron las bacterias endofíticas que hayan formado

IO
halo en el medio celulolítico.

BL
BI
 Actividad proteolítica
Los cultivos bacterianos jóvenes a 0.08 – 0.1 de densidad óptica (DO) a
620 nm fueron inoculados en discos sobre el medio agar leche (0,1%
glucosa, 0,5% Peptona de caseína, 0,25% extracto de levadura, 8 ml
29
leche desnatada y 1,5% agar agar en un volumen total de 100 ml y fueron
incubados a 28°C por 2 días. Se seleccionaron las bacterias endofíticas
que hayan formado halo en el medio agar leche.
e. Inoculación de bacterias endofíticas seleccionadas sobre semillas de
DO
Medicago sativa “alfalfa” comprende:
RA
 Preparación de suspensiones bacterianas
SG
En tubos con medio tripticaso de soya agar (TSA) se sembraron las cepas
PO
bacterianas endofíticas seleccionadas y fueron incubadas por 24 h a 28
DE
°C. Una muestra de cada bacteria aislada fue transferida a un tubo con 5
ml de solución salina para preparar suspensiones bacterianas de 0.08 –

CA
0.1 de densidad óptica (DO) a 620 nm.

TE
IO
 Desinfección de las semillas de alfalfa

BL
Las semillas certificadas de Medicago sativa “alfalfa” fueron compradas en
Agropecuaria Chimu – Trujillo. Luego en sobres estériles de papel filtro se

BI
colocaron muestras de 0,5 g de semillas de alfalfa previamente
seleccionadas de acuerdo a su morfología y apariencia, se agregaron 100
ml de la solución desinfectante HgCl2 (dicloruro de mercurio) por 10
30
minutos y se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril. Toda la
desinfección se llevó a cabo en una cámara de bioseguridad.
 Inoculación de la semilla de alfalfa
En frascos de vidrio estériles se colocaron 0.5 g de semillas de alfalfa
DO
desinfectadas y 5 ml de la suspensión bacteriana a 0.08 – 0.1. de
densidad óptica (DO) a 620nm. Las semillas se mezclaron con la
RA
suspensión bacteriana por 5 min., y con la ayuda de pinzas estériles se
SG
retiraron sobre placas con papel filtro estéril y se dejaron secar a
temperatura ambiental de 22 °C por 1-2 min.

PO
DE
Para la evaluación de germinación, estas semillas fueron transferidas a
placas con Agar Agua para posteriormente evaluar el porcentaje de

CA
germinación a un día. El tamaño radicular, tamaño del tallo y presencia de

TE
hojas cotiledonales se evaluaron a 5 días.

IO
Para la evaluación de crecimiento con el mismo procedimiento anterior se

BL
hicieron germinar las semillas y a los cinco días transferidas a solución

BI
Fahraeus conformada por: 0.1 g CaCl2, 0.12g MgSO4.7H2O, 0.1 g
KH2PO4, 0.1 g Na2HPO4, 0.005 g FeCl3.2H2O, 4 g de Phytagel, 1 ml
solución Stock, pH 7 en un volumen total de 1 litro de agua destilada.
31
La solución stock se preparó con 2.86g H3BO3, 2.03 g MnSO4.4H2O, 0,22
g ZnSO4.7H2O, 0.08 g CuSO4.5H2O, 0.14 g Na2MoO4.2H2O y 1 litro de
agua destilada. Se evaluó tamaño radicular, tamaño del tallo y número de
hojas cotiledonales. Luego a los treinta días se evaluó usando el mismo
procedimiento descrito tamaño radicular, tamaño del tallo y presencia de
DO
hojas verdaderas.
RA
SG
f. Análisis de resultados
PO
En el caso del efecto de la bacteria endofítica sobre las semillas de
Medicago sativa “alfalfa” se utilizó el Diseño Estadístico Completamente al

DE
Azar (DCA).
CA
En todas las pruebas excepto el de producción de sideróforos se usó el

TE
análisis de varianza (ANOVA), con un nivel de significancia del 5%; la
comparación entre tratamientos se realizó mediante el uso de la prueba de

IO
comparación de medias Duncan. Se usó el programa estadístico SPSS

BL
Statistics 22.
BI
32
g. Identificación Molecular de la cepa con mejor resultado
Se realizó la extracción del ADN, amplificación del gen 16S ADN
ribosomal mediante PCR, secuenciamiento del gen 16S y análisis de la
secuencia de 16S rDNA
DO
El ADN bacteriano fue extraído y purificado de un cultivo celular mediante
RA
un kit comercial, luego se realizó la amplificación del gen 16S DNAr
SG
usando primers universales según Tamariz (2014). Los productos de PCR
PO
fueron secuenciados en la empresa Macrogen Corea con primers internos
para la secuenciación de ambas cadenas. Las secuencias fueron editadas

DE
y analizadas con softwares Bioinformáticos (Chromas lite, Clustal X, Blast
N, Mega6).
CA
TE
IO
BL
BI
33
3. RESULTADOS
3.1. AISLAMIENTO DE BACTERIAS ENDOFÍTICAS
Se aislaron un total de 12 cepas bacterianas endofíticas provenientes de la raíz,
tallo y hojas de Solanum pimpinellifolium “tomate silvestre”, los cuales fueron
DO
usados para las pruebas de promoción de crecimiento vegetal.
RA
3.2. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOL ACETICO (AIA) A 24 HORAS
SG
De acuerdo a la metodología planteada, de las 12 cepas bacterianas endofíticas
evaluadas solo produjeron AIA las cepas 35, 24, 21, 26 y 29 a diferentes
PO
concentraciones del inoculo.
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 14. Producción de AIA (μg/ml) de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a 24 horas
y a diferentes concentraciones de inóculo. DO:5 corresponde a un inóculo de DO 620 de 0,5;
DO:4 a 0,4; DO:3 a 0,3; DO a 0,2 y DO:1 a 0,1. Los análisis estadísticos corresponden a los
inóculos, y las letras corresponden a los grupos dentro de cada cepa. Las barras corresponden
a las desviaciones estándar de las repeticiones.
34
Los resultados de producción de AIA de las cepas bacterianas endofíticas
aisladas a diferentes concentraciones de inóculo (Figura 14), mostraron
diferencias significativas entre los tratamientos de la cepa 24 (Tabla 3), cepa 21
(Tabla 5), cepa 26 (Tabla 7) y cepa 29 (Tabla 9); mientras que la cepa 35
(Tabla 2) no mostró diferencias significativas a diferentes concentraciones. Sin
DO
embargo, la cepa 35 tuvo una producción mayor de AIA en comparación de las
otras cepas, con un valor de 50.23 μg/ml a una concentración de 0,3 de
RA
densidad óptica a 620nm.
SG
PO
La prueba de comparación de DUNCAN (Tabla 2), a un nivel de significancia de
α = 0.05, nos indica que las cepas 24 (Tabla 4), 21 (Tabla 6), 26 (Tabla 8) y 29
DE
(Tabla 10) presentaron diferencias entre las concentraciones de inóculo. De lo
cual, la cepa 24 a 0,5; 0,4 y 0,2 de DO620 obtuvo la mayor producción de AIA
CA
con valores de 43.56 μg/ml, 42.79 μg/ml y 44.59 μg/ml. La cepa 21 a una DO620
TE
de 0,5 y 0,3 se obtuvo la mayor producción de AIA con valores de 28.69 μg/ml y
25.87 μg/ml. La cepa 26 a un DO620 de 0,4 se obtuvo la mayor producción de

IO
AIA con un valor de 25,62 μg/ml y la cepa 29 de DO620 de 0,3 se obtuvo la

BL
mayor producción de AIA con un valor de 21 μg/ml.

BI
35
3.3. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOL ACETICO (AIA) A 48 HORAS
Los resultados de producción de AIA de las cepas bacterianas endofíticas a
diferentes concentraciones de inóculo evaluada a 48 horas (Figura 15), se
observa diferencias significativas entre los tratamientos en la cepa 35 (Tabla
11), cepa 24 (Tabla 13), cepa 29 (Tabla 17); mientras que las cepas 21 (Tabla
DO
15) y 26 (Tabla 16) no mostraron diferencias significativas respecto a la
concentración del inóculo. Sin embargo la producción de AIA de las cepas 21 y
RA
26 fueron las mejores en comparación a las otras cepas bacterianas.
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 15. Producción de AIA (μg/ml) de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a 48 horas
y diferentes concentraciones de inóculo. DO:5 corresponde a un inóculo de DO 620 de 0,5; DO:4
a 0,4; DO:3 a 0,3; DO a 0,2 y DO:1 a 0,1. Los análisis estadísticos corresponden a la
comparación entre las concentraciones de los inóculos por cepa, y las letras corresponden a los
grupos dentro de cada cepa. Las barras corresponden a las desviaciones estándar de las
repeticiones.
36
La prueba de comparación de DUNCAN, a un nivel de significancia de α = 0.05,
nos indica que las cepas 35 (Tabla 12), 24 (Tabla 14) y 29 (Tabla 18)
presentaron diferencias entre las concentraciones de inóculo. De lo cual, la
cepa 35 a una DO620 de 0,4; 0,3; 0,2 y 0,1 obtuvieron producciones de 30.23
μg/ml, 30.49 μg/ml, 29.21 μg/ml y 28.69 μg/ml respectivamente. La cepa 24 a
DO
una DO620 de 0,5; 0,3; 0,2 y 0,1 se obtuvieron producciones de 25.62 μg/ml,
26.59 μg/ml, 29.21 μg/ml y 34,59 μg/ml. La cepa 29 a una DO620 de 0,5 se
RA
obtuvo una producción de AIA con un valor de 31 μg/ml.
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
37
3.4. EFECTO ANTAGÓNICO DE LAS CEPAS BACTERIANAS
ENDOFÍTICAS AISLADAS SOBRE Fusarium oxysporum A LOS 6 DÍAS
Los resultados mostraron que las cepas bacterianas endofíticas aisladas tienen
efecto antifúngico sobre Fusarium oxysporum.
DO
Los resultados del porcentaje de inhibición del crecimiento de
Fusarium oxysporum por las cepas bacterianas endofíticas Figura 16),
RA
mostraron diferencias significativas entre los tratamientos, como se muestra en
SG
el análisis de varianza (Tabla 19).
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 16. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Fusarium oxysporum por cepas
bacterianas endofíticas aisladas. Los análisis estadísticos corresponden a la comparación de
medias entre las cepas y las letras indican los grupos formados. Las barras corresponden a las
desviaciones estándar de las repeticiones.
38
La prueba de comparación de DUNCAN (Tabla 20), a un nivel de significancia
de α = 0.05, nos indica que un total de 12 cepas bacterianas endofíticas fueron
evaluadas sobre Fusarium oxysporum; de los cuales las cepas 29 y 26 a un
DO620 de 0,1 se destacaron por presentar los mayores porcentajes de
inhibición, mostrando diferencias significativas con el resto de los tratamientos
DO
con valores de 100% y 94.72% de inhibición sobre Fusarium oxysporum.
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
39
C 29
DO
RA
SG
PO
35 24
DE
CA
TE
IO
BL
C 42
BI
Figura 17. Actividad antagónica de las cepas bacterianas aisladas sobre

Fusarium oxysporum a los 6 días.
40
3.5. SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS DE LAS CEPAS BACTERIANAS

ENDOFÍTICAS AISLADAS A LOS 7 DÍAS.
Sólo tres cepas bacterianas endofíticas solubilizaron el fosfato. Los resultados
(Figura 18), mostraron que el nivel de significancia es menor a 0.05, es decir
que hay diferencias significativas entre los tratamientos, como se muestra en el
DO
análisis de varianza (Tabla 21).
RA
SG
PO
DE
CA
TE
Figura 18. Solubilización de fosfatos de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a los 7 días.
Los análisis estadísticos corresponden a la comparación de medias entre las cepas y las letras
IO
indican los grupos formados. Las barras corresponden a las desviaciones estándar de las
repeticiones.
BL

BI
de α = 0.05, nos indica que un total de 12 cepas bacterianas endofíticas
aisladas como promotoras de crecimiento vegetal fueron evaluadas para
solubilización de fosfatos de los cuales las cepas 26, 35 y 21 a un DO620 de 0,1
produjeron halos de solubilización de 0.35 cm, 0.3 cm y 0.25 cm.
41
C 26
DO
RA
SG
PO
DE
CA
35 21
TE
IO
BL
BI
Figura 19. Confirmación de solubilización de fosfatos por la formación de un halo transparente

alrededor del disco correspondiente a las cepas 35, cepa 26 y cepa 21 con respecto a su
control negativo a los 7 días.
42
3.6. EVALUACIÓN DE SIDERÓFOROS DE LAS CEPAS BACTERIANAS

ENDOFÍTICAS AISLADAS A LOS 7 DÍAS
Los resultados de producción de sideróforos para hierro de las cepas
bacterianas endofíticas (Tabla 23), mostraron que las cepas 32, 23, 20, 29, 24 y
26 dieron positivo ante esta prueba.
DO
RA
Tabla 23. Evaluación de sideróforos de las cepas bacterianas endofíticas
aisladas según su desempeño a los 7 días
SG
No CEPAS PRODUCCIÓN DE SIDERÓFOROS a
PO
Cepa 29 +
Cepa 26 +
DE
Cepa 35 -
Cepa 21 -
CA
Cepa 24 +
Cepa 32 +
TE
Cepa 23 +
Cepa 9 -
IO
Cepa 20 +
BL
Cepa 42 -
Cepa 31 -
BI
Cepa 27 -
Control -
a Producción de sideróforos (+); sin producción (-)
43
C
29
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
26 24
BI
44
20 32
DO
RA
SG
PO
DE
CA
23
TE
IO
BL
BI
Figura 20. Confirmación de producción de sideróforos por el cambio de coloración de azul a

amarillo alrededor del disco correspondiente a las cepas 32, 23, 20, 29, 24 y 26 con respecto a
su control negativo a los 7 días
45
3.7. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CELULOLÍTICA DE LAS CEPAS

BACTERIANAS ENDOFÍTICAS AISLADAS A 48 HORAS
Los resultados mostraron que pocas cepas bacterianas aisladas degradan la
celulosa. Eso nos da a entender que estas bacterias no presentan gran afinidad
por la celulosa.
DO
RA
Los resultados de la actividad celulolítica de las cepas bacterianas endofíticas
SG
aisladas (Figura 21), mostraron que el nivel de significancia es menor a 0.05,
eso quiere decir que hay diferencias significativas entre los tratamientos, como
PO
se muestra en el análisis de variancia (Tabla 24).
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 21. Evaluación de la actividad celulolítica de las cepas bacterianas endofíticas a los 2
días. Los análisis estadísticos corresponden a la comparación de medias entre las cepas y las
letras indican los grupos formados. Las barras corresponden a las desviaciones estándar de las
repeticiones.
46
de α = 0.05, nos indica que un total de 12 bacterias aisladas como promotores
de crecimiento vegetal fueron evaluadas para actividad celulolítica; de los
cuales las cepas 35, 24 y 29 a un DO620 de 0,1 dieron valores de 2.45 cm, 1.1
cm y 0.6 cm de halo degradativo.
DO
RA
SG
C 35
PO
DE
CA
TE
IO
24 29
BL
BI
Figura 22. Confirmación de actividad celulolítica por la formación de un halo amarrillo alrededor
del disco correspondiente a las cepas 35, cepa 24 y cepa 29 con respecto a su control negativo
a los dos días.
47
3.8. EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LAS CEPAS

BACTERIANAS ENDOFÍTICAS AISLADAS A 48 HORAS
Los resultados mostraron que las cepas bacterianas endofíticas aisladas
degradan la caseína presente en el medio Agar leche. Eso nos da a entender
que estas bacterias presentan actividad proteolítica.
DO
RA
Los resultados de la actividad proteolítica de las cepas bacterianas endofíticas
SG
aisladas (Figura 23), mostraron que el nivel de significancia es menor a 0.05,
eso quiere decir que hay diferencias significativas entre los tratamientos, como
PO
se muestra en el análisis de varianza (Tabla 26).
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 23. Confirmación de la actividad proteolítica por la formación de un halo

transparente alrededor del disco correspondiente a la cepa 20, cepa 31, cepa 21, cepa 24 y
cepa 35 con respecto a su control negativo a los dos días. Los análisis estadísticos
corresponden a la comparación de medias entre las cepas y las letras indican los grupos
formados. Las barras corresponden a las desviaciones estándar de las repeticiones.
48
de α = 0.05, nos indica que un total de 12 cepas bacterianas endofíticas
aisladas como promotoras de crecimiento vegetal fueron evaluadas para
actividad proteolítica; de los cuales las cepas 20, 31, 21, 24 y 35 a un DO 620 de
0,1 se destacaron por presentar la mayor actividad proteolítica sobre Agar leche
DO
con valores de 1.55 cm, 1.05 cm, 1 cm, 0.9 cm y 0.8 cm mostrando diferencias
significativas con las cepas 42, 29 y 27 a un DO 620 de 0,1 los cuales tuvieron un
RA
menor rendimiento.
SG
PO
DE
CA
31
TE
C 20 21
20
IO
BL
BI
49
DO
35
24
RA
SG
PO
DE
Figura 24. Confirmación de actividad proteolítica por la formación de un halo transparente

alrededor del disco correspondiente a las cepas 20, 31, 21, 24 y 35 con respecto a su control
CA
negativo a los dos días. Cepas con actividad proteolítica alta.

TE
IO
BL
BI
C 42
50
DO
29 27
29
RA
SG
PO
Figura 25. Confirmación de actividad proteolítica por la formación de un halo transparente
DE
alrededor del disco correspondiente a las cepas 42, 29 y 27 con respecto a su control negativo.
Cepas con actividad proteolítica media.
CA
TE
IO
BL
BI
51
3.9. Selección de las cepas promotoras de crecimiento para la evaluación

de su efecto sobre Medicago sativa
Tabla 41. Pruebas de promoción de crecimiento realizadas para las cepas bacterianas
endofíticas aisladas.
PRUEBAS DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTOa
DO
CEPAS
BACTERIANAS Producción Antagonismo Solubilización Sideróforos Actividad Actividad
AIA F. oxyporum fosfatos celulolítica proteolítica
Cepa 29
RA
+ + - + + +
Cepa 26 + + + + - -
SG
Cepa 35 + + + - + +
Cepa 21 + + PO + - - +
Cepa 24 + + - + + +
Cepa 32 - + - + - -
DE
Cepa 23 - + - + - -
CA
Cepa 9 - - - - - -
Cepa 20 - - - + - +
TE
Cepa 42 - - - - - +
IO
Cepa 31 - - - - - +
Cepa 27 - - - - - +
BL
Control - - - - - -
BI
a Efecto positivo ( + ); Efecto negativo (-)
52
Para seleccionar las cepas que serían evaluadas en la germinación y

crecimiento de Medicago sativa, después de evaluar las diversas actividades de
promoción de crecimiento de las cepas aisladas del Solanum pimpinellifolium
“tomate silvestre”, se consideraron como prioritarias las cepas que producían
AIA como la cepa 29, cepa 26, cepa 35, cepa 21 y cepa 24. Además se pudo
observar que las cepas también han dado resultados positivos en por lo menos
tres pruebas más sobre capacidades en la promoción de crecimiento.
DO
Por ejemplo la Cepa 24 y 29 presentó efecto antagónico sobre
RA
Fusarium oxysporum, produce sideróforos, tiene actividad celulolítica y
proteolítica. La Cepa 26 presentó efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum,
SG
solubiliza fosfatos, produce sideróforos y tiene actividad proteolítica. La Cepa 35
PO
presentó efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum, solubiliza fosfatos, tiene
actividad celulolítica y proteolítica. La Cepa 21 presentó efecto antagónico
sobre Fusarium oxysporum, solubiliza fosfatos y tiene actividad proteolítica.
DE
CA
TE
IO
BL
BI
53
3.10. PORCENTAJE DE GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE ALFALFA

INOCULADAS CON CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS
SELECCIONADAS A 24 HORAS
indujeron la germinación en las semillas de alfalfa a las 24 horas (Figura 26).
DO
De acuerdo al análisis estadístico se encontró que el nivel de significancia fue
RA
menor a 0.05, es decir hubo diferencias significativas entre los tratamientos,
como se muestra en el análisis de varianza (Tabla 28).
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 26. Porcentaje de germinación de semillas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas
endofíticas seleccionadas luego de 24 horas. Los análisis estadísticos corresponden a la
comparación de medias entre las cepas y las letras indican los grupos formados. Las barras
corresponden a las desviaciones estándar de las repeticiones.
54
de α = 0.05, nos indica que las 5 cepas bacterianas endofíticas seleccionadas
como promotores de crecimiento vegetal indujeron la germinación en semillas
de alfalfa a las 24 horas de ser inoculadas; de los cuales las cepas 29, 26, 21,
35 y 24 a un DO620 de 0,1 obtuvieron valores altos en porcentaje de
DO
germinación de 90%, 80%, 75%, 75% y 70% pero no se encontró diferencias
significativas entre los tratamientos sin embargo si lo hubo con el control que
RA
consistió en semillas sin ningún inóculo.
SG
C 29
PO
DE
CA
TE
IO
31 26
BL
BI
55
23 21
DO
RA
SG
PO
35 24
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 27. Germinación de semillas de alfalfa a las 24 horas después de ser inoculadas con las
cepas 29, 31, 26, 23, 21, 35 y 24.
56
3.11. EVALUACIÓN DEL TAMAÑO RADICULAR DE LAS PLANTULAS DE

ALFALFA INOCULADAS CON CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS
SELECCIONADAS LUEGO DE 5 DÍAS
Los resultados del tamaño radicular después de ser inoculadas con las cepas
bacterianas endofíticas seleccionadas a los 5 días (Figura 28), mostraron que
el nivel de significancia es mayor a 0.05, eso quiere decir que no hay
DO
diferencias significativas entre los tratamientos, como se muestra en el análisis
RA
de varianza (Tabla 30).
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 28. Tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas
endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber germinado las semillas de alfalfa. Los
análisis estadísticos corresponden a la comparación de medias entre las cepas y las letras
repeticiones.
57
Los resultados encontrados después de la inoculación a los 5 días con las
cepas bacterianas endofíticas seleccionadas demuestran que las cepas a un
DO620 de 0,1 no tuvieron efecto sobre el tamaño radicular con respecto al
control, obteniéndose un valor promedio de 1.3 a 1.4 cm entre las raíces
inoculadas y no inoculadas con las cepas bacterianas.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
Figura 29. Evaluando el tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas
BL
bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber germinado las semillas de

BI
alfalfa.
58
3.12. EVALUACIÓN DEL TAMAÑO DEL TALLO DE LAS PLANTULAS DE

Los resultados del tamaño del tallo después de ser inoculadas con las cepas
DO
el nivel de significancia es menor a 0.05, eso quiere decir que hay diferencias
RA
significativas entre los tratamientos, como se muestra en el análisis de varianza
(Tabla 31).
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 30. Tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas con las cepas bacterianas
repeticiones.
59
como promotores de crecimiento vegetal indujeron el crecimiento del tallo en
semillas de alfalfa a los 5 días de ser inoculadas; de los cuales las cepas 35 y
21 a un DO620 de 0,1 obtuvieron valores altos de 2.3 cm y 2.2 cm pero en
DO
comparación con el control de valor 2.7 cm no fue significativo.
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 31. Evaluando el tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas
alfalfa.
60
3.13. EVALUACIÓN DEL NÚMERO DE HOJAS COTILEDONALES DE LAS

PLANTULAS DE ALFALFA INOCULADAS CON CEPAS
BACTERIANAS ENDOFÍTICAS SELECCIONADAS LUEGO DE 5 DÍAS.
promovieron la formación de las hojas cotiledonales en alfalfa a los 5 días de
ser inoculadas.
DO
Los resultados del tamaño del tallo después de ser inoculadas con las cepas
RA
SG

PO
(Tabla 33).
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 32. Número de hojas cotiledonales en plántulas de alfalfa después de ser inoculadas
con las cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 5 días de haber germinado las
semillas de alfalfa. Los análisis estadísticos corresponden a la comparación de medias entre las
cepas y las letras indican los grupos formados. Las barras corresponden a las desviaciones
estándar de las repeticiones.
61
La prueba de comparación de DUNCAN (Tabla 34) a un nivel de significancia
como promotores de crecimiento vegetal indujeron la formación de hojas
cotiledonales en alfalfa a los 5 días de ser inoculadas; de los cuales las cepas
29 y 26 a un DO620 de 0,1 obtuvieron valores altos en la formación de hojas
DO
cotiledonales con valores de 10 y 8 plántulas con hojas cotiledonales, seguidos
de las cepas 24 y 35; mientras que en la cepa 21 a un DO 620 de 0,1 la
RA
formación de hojas cotiledonales fue igual al control.
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 33. Evaluando el número de hojas cotiledonales de las plántulas de alfalfa inoculadas
con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber germinado las
semillas de alfalfa..
62
3.14. EVALUACIÓN DEL TAMAÑO RADICULAR DE LAS PLANTULAS DE

promovieron el crecimiento radicular de las plántulas de alfalfa a los 30 días de
ser inoculadas.
DO
Los resultados del tamaño radicular después de ser inoculadas con las cepas
RA
SG

PO
(Tabla 35).
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 34. Tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas
repeticiones.
63
como promotores de crecimiento vegetal indujeron el crecimiento radicular en
semillas de alfalfa a los 30 días de ser inoculadas; de lo cual la cepa 35 a un
DO620 de 0,1 obtuvo el valor de 15.8 cm como mejor tratamiento en
DO
comparación con las otras cepas bacterianas. Las cepas 24 a un DO620 de 0,1
tuvo un valor de 14.9 cm. La cepa 26, 21 y 29 a un DO 620 de 0,1 no hubo
RA
diferencias significativas entre ellos pero si con el control, de lo cual sus valores
SG
son 11.8 cm, 13.1 cm y 13.8 cm.
C 21 24
PO 26 29 35
C C C C C
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 35. Evaluando el tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas
alfalfa.
64
3.15. EVALUACIÓN DE LA LONGITUD DEL TALLO DE LAS PLANTULAS DE

SELECCIONADAS LUEGO DE 30 DÍAS.
promovieron el crecimiento del tallo en las plántulas de alfalfa a los 30 días de
ser inoculadas.
DO
Los resultados de la longitud del tallo después de ser inoculadas con las cepas
RA
SG

PO
(Tabla 37).
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 36. Tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas
análisis estadísticos corresponden a los inóculos, y las letras corresponden al grupo dentro de
cada cepa. Las barras corresponden a las desviaciones estándar de las repeticiones.
65
de α = 0.05, nos indica que las 5 cepas bacterianas endofiticas seleccionadas
indujeron el crecimiento del tallo en semillas de alfalfa a los 30 días de ser
inoculadas; de lo cual la cepa 21 a un DO620 de 0,1 obtuvo el valor de 6.19 cm
como mejor tratamiento en comparación con las otras cepas bacterianas (Tabla
DO
16). Las cepas 26, 29 y 35 a un DO620 de 0,1 no hubo diferencias significativas
entre ellos pero si con el control, de lo cual sus valores son 5.91 cm, 5.18 cm y
RA
5.41 cm. La cepa 24 a un DO620 de 0,1y el control sus valores fueron los
SG
menores con especto a las demas cepas.
PO
26
DE
29
21 35
24
CA
C
TE
IO
BL
BI
Figura 37. Evaluando el tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas
alfalfa..
66
3.16. EVALUACIÓN DEL NÚMERO DE HOJAS VERDADERAS DE LAS

PLANTULAS DE ALFALFA INOCULADAS CON CEPAS
BACTERIANAS ENDOFÍTICAS SELECCIONADAS LUEGO DE 30 DÍAS.
promovieron la formación de hojas verdaderas en las semillas de alfalfa a los 30
días de ser inoculadas.
DO
Los resultados del número de hojas verdaderas después de ser inoculadas con
RA
las cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 días (Figura 38),
SG
mostraron que el nivel de significancia es menor a 0.05, eso quiere decir que
hay diferencias significativas entre los tratamientos, como se muestra en el

PO
análisis de varianza (Tabla 39).
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 38. Número de hojas verdaderas en plántulas de alfalfa después de ser inoculadas con
cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 de haber germinado las semillas de
alfalfa. Los análisis estadísticos corresponden a los inóculos, y las letras corresponden al grupo
dentro de cada cepa. Las barras corresponden a las desviaciones estándar de las repeticiones.
67
La prueba de comparación de DUNCAN (Tabla 40) a un nivel de significancia
como promotores de crecimiento vegetal indujeron la formación de hojas
verdaderas en alfalfa a los 30 días de ser inoculadas; de los cuales la cepa 26 a
un DO620 de 0,1 obtuvo un valor de 3.9 plántulas con hojas verdaderas.
DO
Mientras las otras cepas bacterianas 35, 24. 21 y 29 a un DO 620 de 0,1 sus
valores no fueron significativos con respecto al control.
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
C 21 24 26 29 35
BL
BI
Figura 39. Número de hojas verdaderas en plántulas de alfalfa después de ser inoculadas con
cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 días de haber germinado las semillas de
alfalfa..
68
3.17. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS CEPAS BACTERIANAS
ENDOFÍTICAS SELECCIONADAS
Se aislaron 12 cepas bacterianas endofíticas provenientes de hojas, tallos y
raíces de Solanum pimpinellifolium “tomate silvestre”. En la selección se
DO
priorizaron las cepas bacterianas que produjeron AIA pero también se observó
RA
su efecto antagónico sobre F. oxysporum, Solubilización de Fosfatos,
sideróforos, Actividad Proteolítica y Celulolítica; luego se realizó la
SG
identificación molecular siguiendo la siguiente secuencia: extracción del ADN,
PO
amplificación del gen 16S ADN ribosomal mediante PCR, secuenciamiento del
gen 16S y análisis de la secuencia de 16S rDNA. La comparación de las

DE
secuencias del gen ribosómico 16S permite establecer relaciones filogenéticas

CA
entre los organismos, ya que contienen varias regiones altamente conservadas
que resultan útiles para obtener alineamientos de secuencia y al mismo tiempo

TE
una variabilidad suficiente en otras regiones de la molécula para servir como

IO
cronómetros evolutivos.
BL
BI
EL análisis de BLASTN para las secuencias de bacterias corresponde a un
alineamiento local que conduce a identificaciones putativas. Por lo tanto, para
tener mayor confiabilidad en la identificación se realizó un análisis filogenético
con secuencias de referencia depositadas en GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
69
Con las secuencias de ADN de cada uno de las bacterias seleccionadas, se
realizó un análisis de los microorganismos para conocer la relación filogenética
entre éstos, así como la posición que ocupan con respecto a las especies de
bacterias descritas hasta el momento. Inicialmente se utilizó el programa
CLUSTAL X, con el que se alinearon las secuencias y se observaron las
DO
diferencias puntuales presentes entre ellas. Con el programa informático MEGA
6, se calcularon las distancias evolutivas de las secuencias y se construyeron
RA
los árboles filogenéticos. El programa permite el análisis de los datos
SG
empleando varios métodos y algoritmos distintos, pudiendo así comparar los
PO
árboles obtenidos y determinar si la topología presentada es estable.
DE
CA
TE
IO
BL
BI
70
Identificación molecular de la Cepa 21
El análisis filogenético de la cepa 21 (secuencia 1) se realizó con base en 1391
pb de la región 16S del ADNr e incluyó además las secuencias 18 secuencias
representativas de diferentes especies obtenidas BLASTN y permitió definir que
la Cepa 21 corresponde al género Yokenella sp.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 40. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas endofíticas
identificadas taxonómicamente similares basados en las secuencias del gen 16S rDNA .
Número de acceso al GenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de
endófitos están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa 21.
71
El análisis filogenético de la cepa 24 (secuencia 2) se realizó con base en 1421
pb de la región 16S del ADNr e incluyó además 15 secuencias representativas
de diferentes especies obtenidas BLASTN. Se pudo establecer que la Cepa 24
corresponde a la especie Bacillus subtilis.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Número de acceso al GenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de
72
El análisis filogenético de la cepa 26 (Secuencia 3) se realizó con base en 851
de diferentes especies obtenidas BLASTN. Se pudo confirmar que la Cepa 26
pertenece al género Paenibacillus sp.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Número de acceso TheGenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de
73
El análisis filogenético de la cepa 29 (Secuencia 4) se realizó con base en 1421
de diferentes especies obtenidas BLASTN. Se pudo confirmar que la Cepa 29
corresponde a una cepa de la especie Serratia liquefaciens.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
74
El análisis filogenético de la cepa 35 (Secuencia 35) se realizó con base en
1376 pb de la región 16S del ADNr e incluyó además 20 secuencias
representativas de diferentes especies obtenidas BLASTN. Se pudo encontrar
que la Cepa 35 corresponde a la especie Bacillus subtilis.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
75
4. DISCUSIÓN
El análisis de la producción de AIA sobre las 12 cepas bacterianas endofíticas a
24 horas; de lo cual su producción de AIA de la cepas 35 (Bacillus subtilis) y 24
(Bacillus subtilis) fueron las mejores en comparación con las cepas 21
DO
(Yokenella sp.), 26 (Paenibacillus sp.) y 29 (Serratia liquefaciens) con valores
promedios de 50.23 µg/ml y 44.59 µg/ml. Según Garcia et al. (2005), las
RA
bacterias endofíticas pueden influenciar el crecimiento de las plantas
SG
contribuyendo con la producción de Auxinas en las que se encuentra el Ácido
PO
Indol Acético el cual influyen en la fisiología y desarrollo de la planta a
concentraciones bajas.
DE
CA
También se analizó la producción de AIA de las 12 cepas bacterianas
endofíticas a 48 horas, de lo cual su producción de AIA de las cepas 21

TE
(Yokenella sp.) y 26 (Paenibacillus sp.) fueron las mejores (Figura 15) en

IO
comparación a las otras cepas bacterianas como la cepa 35 (Bacillus subtilis),

BL
cepa 24 (Bacillus subtilis) y cepa 29 (Serratia sp.) con valores de 28.69 µg/ml a
BI
36.9 µg/ml. Es importante anotar, que aunque las investigaciones sobre
evaluación de la producción de AIA arrojen valores altos o bajos si se comparan
entre sí, está demostrado que bajas concentraciones de fitohormona son
capaces de estimular el desarrollo vegetal y altas concentraciones inhiben y
reducen la zona de alargamiento (Rodríguez y Fraga, 1999; Hernández, 2011);
76
teniendo en cuenta que los microorganismos nativos están adaptados a
condiciones y ambientes propios, sólo realizando bioensayos “in vitro” se podrá
encontrar la dosis adecuada y comprobar el efecto ejercido sobre los cultivos a
aplicar.
DO
El género Bacillus no es generalmente un gran productor de AIA, no obstante
RA
se han reportado algunas cepas capaces de producir hasta 16 μg/ml (Tejera et
SG
al., 2011) y 55 μg/ml. Las otras cepas bacterianas aisladas como la cepa 24
(Bacillus subtilis), cepa 21 (Yokenella sp.), cepa 26 (Paenibacillus sp.) y cepa

PO
29 (Serratia liquefaciens) produjeron un rango variable de AIA en un intervalo
de 14.9 a 13.1 μg/ml a 24 horas de ser inoculadas a diferentes concentraciones

DE
del inoculo.
CA
TE
Valores reportados por Wahyudi et al. (2011), quienes caracterizaron seis

IO
aislados rizosféricos del género Bacillus, por su capacidad para promover el

BL
crecimiento de plántulas de soya (Glycine max Merr.); tales microorganismos

BI
producían AIA en concentraciones desde 3.02 hasta 5.45 mg l -1. Según Tairi
(2014) reportó la producción de AIA por parte de Serratia sp. quien fue las más
representativa en el medio TSB como prueba cualitativa. Demostrando que los
Bacillus sp. y Serratia sp. son productores de AIA.
77
La producción máxima de AIA obtenida fue similar al valor reportado en un
trabajo 32,200 μg/ml, realizado en la zona de Espinal (Tolima, Colombia)
utilizando microorganismos nativos de igual género (Bernal et al., 2000); se
observó que los microorganismos de la zona del Valle del Sinu Medio se
extienden en un rango similar en producción de la auxina. En los trabajos
DO
realizados sobre la microbiota nativa de la caña de azúcar (Rodríguez et al.,
2013), se evaluaron aislados provenientes del interior de este cultivo, en la
RA
producción del AIA; se obtuvo como resultado que 6 de ellos, produjeron la
SG
auxina en el rango de 1,7 a 2,5 (μg/ml).
PO
Los resultados reportados por Lara (2011), demostró que el 67,66% de las
DE
plantas inoculadas con la cepa nativa, presentaron un mayor promedio de las

CA
alturas del tallo, longitud de hojas y un notable desarrollo vegetativo de la planta
demostrando que las bacterias endofíticas promueven el crecimiento en

TE
especies vegetales; el parámetro biométrico, longitud de hoja, fue

IO
estadísticamente significativa (P<0,0041) a una concentración bacteriana de

BL
1x108 UFC y altura del tallo (P<0,0071) a una concentración de 1x10 6 UFC.
BI
El AIA es la auxina más ampliamente distribuida en las plantas; los efectos
demostrados en investigaciones llevadas a cabo, contemplan, entre otras, la
elongación, aumento en la respiración celular, promoción del crecimiento en
78
raíces o incremento en la división celular, factores que favorecen el desarrollo
vegetal (Hernández, 2011).
La utilización de microorganismos con potencial biofertilizante productores de
AIA ha demostrado ser eficientes gracias a que pueden aumentar los
DO
rendimientos y la calidad de las cosechas; así lo han demostrado los trabajos
RA
en campo realizado en Colombia (Moreno et al., 2006), en los cuales se reporta
rendimientos en pastos de un 80% con respecto al testigo, aplicando
SG
biofertilizantes a partir de microorganismos nativos y a las condiciones propias
PO
de la zona.
DE
Las bacterias endofíticas productoras de AIA evaluadas en esta investigación

CA
contribuyen al conocimiento de microorganismos autóctonos, con potencial en
la producción de la fitohormona AIA; se espera que a futuro, éstas bacterias

TE
pueden ser utilizados en la preparación de productos biofertilizantes, para

IO
mejorar la productividad de los cultivos, especialmente pasturas, acorde con las

BL
necesidades del sector agropecuario, sustituyendo ó minimizando la utilización

BI
de productos químicos para recuperar la fertilidad del suelo y conservando el
ambiente (García et al, 2005).
De las 12 bacterias evaluadas sobre Fusarium oxysporum; las cepas 24
(Bacillus subtilis), 21 (Yokenella sp.), 35 (Bacillus subtilis), 26 (Paenibacillus sp.)
79
y 29 (Serratia sp.) destacaron por presentar los mayores porcentajes de
inhibición a los 6 días (Figura 16). Las conclusiones de previas investigaciones
como la de Vanegas et al (2005), señalan que existen cepas bacterianas
silvestres del género Bacillus que son capaces de inhibir el crecimiento in vitro
de cepas patógenas de F. solani y F. oxysporum” argumento que demuestra
DO
que las cepas silvestres del género Bacillus sp. aislados de la rizósfera de
plantas son capaces de generar un efecto antagónico en el crecimiento y
RA
desarrollo de este patógeno, además de no presentar efectos adversos en la
SG
viabilidad de las plantas en estudio. Este efecto, se realiza a través de
PO
mecanismos naturales entre los que se destaca de manera importante la
producción de péptidos antimicrobianos como la Gramicidina, el Iturin A y el

DE
Fengycin (Liu et al., 2005).

CA
TE
Los reportes presentados por Ribeiro (2014), además el autor menciona que
dentro de las 20 bacterias que produjeron auxinas y solubilizaban fosfatos, no

IO
se observaron actividad antimicrobiana sobre A. niger, pero 14 cepas (70%)

BL
tubo actividad sobre F. Oxyporum y 8 cepas (40%) tuvieron actividad sobre

BI
Colletotrichum sp.
Gutiérrez (2013), reportó que las ocho cepas inhibieron el crecimiento del hongo
Fusarium oxysporum in vitro en cultivos duales a los 10 días de incubación. Las
80
cepas fueron clasificadas en 3 grupos según su capacidad de inhibir a Fusarium
oxysporum. El grupo A incluyó las cepas 50T de R. terrigena, 70T y 79S de
Pseudomonas sp. que presentaron la mayor capacidad de inhibición (61 %), el
grupo B las cepas 10R y 59T que presentaron una capacidad media de
inhibición (46 %), y el grupo C las cepas 55T, 87S y 32R que presentaron la
DO
menor capacidad de control del crecimiento del hongo (23 %). Esta clasificación
es similar a la planteada en este proyecto para poder clasificar la tasa de
RA
rendimiento de cada cepa evaluada.
SG
PO
La capacidad antagónica de Bacillus subtilis está dada por la producción de
DE
diversos metabolitos, entre los que se incluyen la Iturina A y fengicina, ambas
son lipopéptidos que tiene un enorme potencial dentro del control biológico ya
CA
que pueden inhibir un rango amplio de patógenos de plantas (Ragazzo, 2011);

TE
además se destaca la producción de diversas enzimas que actúan
fundamentalmente sobre hongos como Fusarium stilboides, F. oxysporum,

IO
F.xylarioides y Rhizoctonia solani entre esas enzimas se destacan lipasas,

BL
proteasas y β-1,3 –glucanasas (Tejera et al., 2011). La actividad antifúngica

BI
realizada por Yokenella sp. y Paenobacillus sp. no han sido reportadas por
otros autores, los cuales no se pudo hacer la comparación debida.
A pesar de que la antibiosis sea el mecanismo antagónico más utilizado por los
microorganismos biocontroladores para inhibir al fitopatógeno no es el único, de
81
hecho los antagonistas no tienen un solo modo de acción y esto les brinda una
característica importante para ser usados como agentes de control biológico
(Cook, 1983). Por esta razón, se han descrito varios mecanismos antagónicos
empleados por microorganismos que controlan el desarrollo de patógenos;
“Algunos de estos son competencia por espacio o por nutrimentos,
DO
interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis enzimática) e
inducción de resistencia” (Cook, 1983).
RA
SG
Distintos mecanismos de biocontrol pueden ser llevados a cabo por las
PO
bacterias que resultan beneficiosos para las plantas. Una de las formas es la
producción de aleloquímicos, como por ejemplo la producción de quitinasas

DE
extracelulares por Paenibacillus sp. y Streptomyces sp. que suprimen el

CA
crecimiento de Fusarium oxysporum (Compant et al., 2005).

TE
A su vez, se han reportado cepas de Pseudomonas como biocontroladoras de
dicho hongo mediante competencia por el ion Fe y mediante la degradación del

IO
ácido fusárico, toxina producida por F. oxysporum (Utsumi et al., 1991).

BL
BI
La solubilización de fosfatos es otra prueba común considerada como
promotora de crecimiento en plantas, el cual nos indica que un total de 12
cepas bacterianas aisladas fueron evaluadas; de los cuales las cepas 26
(Paenibacillus sp.), 35 (Bacillus subtilis) y 21(Yokenella sp.) fueron las únicas
82
que tuvieron la capacidad de solubilizar el fosforo inorgánico (Tabla 21) con
valores de 0.35 cm, 0.3 cm y 0.25 cm. Rodriguez (2013), reportó que
Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis y Bacillus pumilus solubilizaron
fosfatos evidenciándose un cambio de color entre verde y amarillo. La
metodología empleada fue diferente a la utilizada en esta investigación pero se
DO
corrobora la información por parte de los Bacillus sp.
RA
SG
Según Martinez (2013), Bacillus megaterium Jz11y Bacillus megaterium EJH-7
tuvieron la mayor capacidad en solubilización de fosfatos, lo cual se detectó

PO
56.0 y 34.8 mg L-1 de fósforo soluble (P-PO4), a pesar que la metodologia
DE
empleada es diferente a la utilizada en esta investigación pero se corrobora la
información por parte de los Bacillus sp. Dicha capacidad es comparable a la

CA
obtenida por otras bacterias rizosféricas aisladas de maíz por Alam et al. (2002)
TE
y de arroz Oryza sativa L. por Thakuria et al. (2004).

IO
BL
El género Bacillus es uno de los más estudiados respecto a la capacidad de

BI
solubilizar fosfatos, dentro de él se destacan las especies B. megaterium y B.
subtilis que pueden producir ácidos orgánicos como principal mecanismo de
solubilización, aunque también pueden actuar enzimas como las fitasas que se
excretan al medio (Tejera et al., 2011).
83
Luego del nitrógeno, el fósforo es el segundo macronutriente en importancia
para el crecimiento de las plantas. Su concentración en el suelo puede ser alta
pero no está en formas disponibles para los vegetales (Calderón et al., 2009).
Sin embargo, existen bacterias rizosféricas y endofíticas que mediante la
liberación de enzimas o producción de ácidos orgánicos, solubilizan el fosfato
DO
haciéndolo disponible para las plantas (Rodríguez et al., 2006).
RA
Los resultados (Figura 18) evidencian que si bien es una característica fácil de
SG
detectar in vitro, es a su vez muy variable por la incidencia de factores
PO
biológicos y ambientales. La observación de que el 64% de las cepas
estudiadas conservan un nivel de solubilización invariable luego de sucesivos

DE
repiques en medio rico, indicaría que es una característica intrínseca de las
cepas y no solamente el producto de una respuesta ambiental. Por lo tanto, se

CA
destaca que la solubilización de fosfato no es una característica común de las

TE
cepas endófitas estudiadas en este trabajo y que es estable en las condiciones
de cultivo utilizadas. Sin duda, queda por saber si es una característica

IO
funcional en otras condiciones ambientales. Las investigaciones cuyo principal

BL
objetivo es detectar bacterias solubilizadoras de fosfato son numerosas en la

BI
bibliografía (Adesemoye y Kloepper, 2009).
En Argentina, se recomienda la inoculación de trigo con una cepa de
Pseudomonas sp. solubilizadora de fosfato para obtener mejores rendimientos
en el cultivo (Ventimiglia et al., 2008). Para maíz existen en Argentina
84
formulaciones comerciales con cepas de Pseudomonas sp. que muestran
incrementos en el rendimiento de hasta el 17% comparado con plantas sin
inocular (Carrasco y Zamora, 2002).
La inoculación en arroz y trigo con bacterias solubilizadoras de fosfato mostró
DO
un efecto sinérgico sobre la promoción del crecimiento vegetal (Gyaneshwar et
al., 2002). La solubilización de P en bacterias endófitas puede aumentar la
RA
disponibilidad de P durante las etapas iniciales de la colonización (Kuklinsky-
SG
Sobral et al., 2004). Nuestros resultados y los de la bibliografía resaltan el
PO
interés real en continuar con la selección de bacterias que solubilicen fosfatos,
reduciendo la aplicación de fertilizantes en cultivos de importancia para la

DE
alimentación humana y animal.

CA
Los resultados (Tabla 23) de la evaluación de sideróforos de las cepas

TE
bacterianas endofíticas aisladas mostraron que las cepas 32, 23, 20, 29
(Serratia sp.), 24 (Bacillus subtilis) y 26 (Paenibacillus sp.) dieron positivo ante

IO
esta prueba. Según Venner y Martin (2013), dentro de las cepas Gram
BL
negativas las mejores fueron O5 (Pseudomonas fluorescens), O181

BI
(Pseudomonas fluorescens), y O24 (Bacillus sp.), las cuales comparadas con
el control P. fluorescens, tuvieron una mejor producción de estos metabolitos.
Dentro de los bacilos Gram positivos esporulados, las mejores cepas fueron
OS3 y OS17, que comparadas con el control P. fluorescens están por debajo de
85
su producción, pero comparadas con el control B. subtilis hubo diferencias
significativas entre estos, siendo muy superiores en su producción.
Mercado et al. (2001), los sideróforos son uno de los mecanismos indirectos
usados por las pruebas de promoción de crecimiento vegetal para captar hierro,
DO
sin embargo estos solo se producen cuando los microorganismos se
RA
encuentran en condiciones hipoférricas. El suelo solo provee 10-18M de este
metal, esta condición hace que las rizobacterias, entre otro tipo de
SG
microorganismos, generen estos compuestos para asegurar su supervivencia.
PO
Las bacterias pertenecientes al género Bacillus no se caracterizan por producir
DE
altas concentraciones de sideróforos. Se ha reportado que bacterias de este

CA
género producen un sideróforo denominado bacillibactina, perteneciente a la
familia de los catecolatos; este fue aislado inicialmente de B. subtilis (Wilson et

TE
al., 2006). También se ha encontrado que B. cereus produce un sideróforo de

IO
citrato, denominado petrobactina el cual estaba asociado únicamente a B.

BL
antrhacis, pero que gracias a estudios posteriores está relacionado además de

BI
estas dos especies a B. thuringiensis (Wilson et al., 2006).
Los sideróforos y la capacidad antagonista están relacionados, ya que la
capacidad de producir estos metabolitos es una ventaja competitiva de las
bacterias promotoras de crecimiento frente a microorganismos que no son
86
capaces de producirlos, inhibiendo el crecimiento de patógenos en condiciones
limitantes de hierro. En la literatura se observa que en las pruebas de
antagonismo para estimular la producción de sideróforos y así identificar a los
posibles antagonistas, la técnica de enfrentamiento en placa es montada en un
medio en donde las concentraciones de hierro son limitantes, asegurando de
DO
esta forma la secreción de estos metabolitos. Con este fin se usa generalmente
el medio King B para este tipo de pruebas (Adesina et al., 2007), también agar
RA
Martin desferrizado (Kurek y Jaroszuk, 2003). De esta forma se asume que se
SG
podrán obtener resultados directamente relacionados con la producción de
PO
sideróforos, ya que como se sabe el medio PDA es complejo y puede traer
consigo trazas de hierro que inhiban la producción de los mismos.

DE
CA
De acuerdo a la evaluación (Tabla 25) de actividad celulolítica nos indica que
un total de 12 cepas bacterianas aisladas como promotores de crecimiento

TE
vegetal fueron evaluadas; de los cuales las cepas 35 (Bacillus subtilis), 24

IO
(Bacillus subtilis) y 29 (Serratia sp.) fueron las únicas que dieron positivo ante
BL
esta prueba con valores de 2.45 cm, 1.1 cm y 0.6 cm de halo degradativo y
BI
Según Gutiérrez (2013), reporto que de las 8 cepas en estudio evidenciaron que
las cepas en medio solido hidrolizaron un 0.25% del CMC. Estas cepas
presentaron capacidad similar de hidrolisis de CMC en el medio sólido, sin
mostrar diferencias significativas. Los halos de degradación de CMC
87
presentados por las cepas seleccionadas fueron de 3 mm; el cual este autor
obtuvo un halo degradativo menor al presentado en este trabajo (2.45 mm).
Según Gutierrez (2013), sus ocho cepas como Raoutella terrígena,
DO
Ochrobactrum sp, Enterobacter sp. y Pseudomonas sp. evidenciaron la
capacidad de hidrolizar la celulosa con un 0.25% de CMC como valor
RA
intermedio.
SG
PO
Las celulasas han sido implicadas en los mecanismos de entrada de los
microorganismos a los tejidos internos de las plantas. Hallman et al. (1997), han
DE
propuesto que las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias endófitas
CA
contribuyen a los procesos de infección en las plantas.

TE
Por otro lado, las enzimas como celulasas también son producidas por
microorganismos patógenos, por lo que es necesario un mayor conocimiento de

IO
la regulación y expresión de estas enzimas (Verma et al., 2001). Según Zdor y

BL
Anderson (1992), es de suponer que en el proceso de colonización microbiana

BI
al penetrar y dañar los tejidos de las plantas activa sus genes de defensa para
protegerse de los endófitos. De hecho, varios estudios demuestran que cuando
las plantas son inoculadas con organismos promotores de crecimiento
aumentan su resistencia, provocando cambios fisicoquímicos.
88
De acuerdo a la evaluación (Tabla 27) de actividad proteolítica nos indica que
un total de 12 cepas bacterianas aisladas fueron evaluadas como promotores
de crecimiento vegetal; de los cuales las cepas 20, 31, 21 (Yokenella sp.), 24
(Bacillus subtilis) y 35 (Bacillus subtilis) se destacaron por presentar la mayor
DO
actividad proteolítica sobre Agar leche. Según Vinchira (2014), reporto que las
RA
tres cepas (7.1, A20 y 5.1) en estudio muestran actividad proteolítica. Estas
características facilitarían a estos microorganismos (particularmente a 7.1 por
SG
presencia actividad celulolítica) colonizar endofíticamente los tejidos vegetales
de las plantas.
PO
DE
CA
Las 5 cepas bacterianas endofíticas seleccionadas como promotores de

TE
crecimiento vegetal indujeron la germinación en semillas de alfalfa a las 24

IO
horas de ser inoculadas (Tabla 29); de los cuales las cepas 29 (Serratia sp.),
BL
26 (Paenibacillus sp.), 21 (Yokenella sp.), 35 (Bacillus subtilis) y 24 (Bacillus

BI
subtilis) obtuvieron valores altos en porcentaje de germinación de 90%,
80%,75%, 75% y 70% mostrando diferencias significativas con su control,
aumentando en más del 35% la germinación. Según Luna (2013), Reportó
resultados obtenidos por la inoculación de semillas de tomate mostraron que las
89
cepas Bacillus sp y Bacillus megaterium aumentaron la germinación en 5.0 y
6.0 % con respecto al control.
Tambien Luna (2013), reportó que en las semillas de pimiento se encontró que
la inoculación con la cepa Bacillus megaterium mejoró su germinación en 7.0 %,
DO
porcentaje similar al obtenido por Reyes et al. (2008) quienes mediante
RA
inoculación con cepas de los géneros Azospirillum y Rhizobium, mejoraron la
germinación de la especie en 5.0 y 11.0 %, respectivamente.
SG
PO
La germinación depende de la viabilidad del embrión y de la ruptura del letargo
DE
generado por las condiciones ambientales, en este último las bacterias
promotoras del crecimiento vegetal reducen en niveles de etileno por efecto de

CA
la actividad ACC deaminasa en la semilla, aumentando su germinación, junto

TE
con la producción de AIA que estimularía la división celular, para así favorecer
IO
el inicio del crecimiento del embrión (Jalili et al., 2009). En semillas de tomate,
BL
Lagunas et al. (2001) reportaron que la inoculación con Bacillus firmus aumentó
su germinación en 6.0 %, efecto de magnitud similar al encontrado en este

BI
ensayo.
Las 5 cepas bacterianas endofíticas seleccionadas como promotores de
crecimiento vegetal indujeron el crecimiento de plántulas de alfalfa a las 5 días
90
de ser inoculadas; de los cuales las cepas 29 (Serratia sp.), 26 (Paenibacillus
sp.), 21 (Yokenella sp.), 35 (Bacillus subtilis) y 24 (Bacillus subtilis) obtuvieron
valores altos en crecimiento del tallo (Tabla 32) y hojas cotiledonales (Tabla 34)
con respecto al control. Pero con respecto a crecimiento radicular (Tabla 30),
no hubo diferencias en las evaluaciones por cada cepa bacteriana. Luego se
DO
volvió a evaluar las 5 cepas bacterianas endofíticas seleccionadas como
promotores de crecimiento vegetal en el crecimiento de las plántulas de alfalfa a
RA
las 30 días de ser inoculadas; de los cuales las cepas 29 (Serratia sp.), 26
SG
(Paenibacillus sp.), 21 (Yokenella sp.), 35 (Bacillus subtilis) y 24 (Bacillus
PO
subtilis) obtuvieron valores altos en crecimiento del tallo (Tabla 38), crecimiento
radicular (Tabla 36) y numero de hojas verdaderas (Tabla 40) con respecto al
DE
control. Según Rodriguez (2013), registro que el proceso de inoculación de las
plantas de tomate con Bacillus subtilis incide en el incremento de las longitudes

CA
del tallo y raíz, así como los pesos del tallo y la raíz.
TE
Según Luna (2013), encontró que a los 30 días de haberse iniciado el ensayo,
IO
cada una de las cepas había tenido un efecto positivo en al menos una de las
BL
variables evaluadas. Las cepas Bacillus megaterium y Bacillus subtilis

BI
aumentaron de manera significativa el diámetro del tallo y el peso fresco y seco
del vástago, lo que se reflejó en aumentos de biomasa de 17.0 y 20.0 % en tallo
y vástago, respectivamente. La cepa Bacillus megaterium solo mejoró el peso
seco del vástago y la biomasa en 12.0 %. Pero ninguna cepa tuvo efecto
significativo en el peso de la raíz.
91
Estos resultados coinciden con los reportados por otros autores que inocularon
plántulas de tomate con diferentes cepas de Bacillus (Lagunas et al., 2001),
Rhizobium (Santillana et al., 2005) y Ralstonia (Baston et al., 2008). En tales
experimentos se mejoró de manera significativa el peso seco del vástago, pero
DO
también en el peso seco de la raíz. En nuestro estudio, la altura de las plántulas
RA
se incrementó en 14.0 % sólo con la inoculación de la cepa MA06. Para esta
misma variable, Ribaudo et al. 2006 encontraron efectos similares en plántulas
SG
de tomate inoculadas con una cepa de Azospirillum brasilense, al registrar un
incremento de 20 %.
PO
DE
Según Luna (2013), en el crecimiento de las plántulas de pimiento, la cepa

CA
Bacillus subtilis indujo incrementos en todas las variables consideradas, que se

TE
reflejaron en un aumento de 37.0 % en la biomasa de la planta. En cambio, la

IO
cepa Bacillus megaterium mejoró solamente el peso fresco del vástago de

BL
modo que la biomasa aumentó en 16.0 %. Existen pocos trabajos sobre la
aplicación de bacterias promotoras del crecimiento en pimiento. Reyes et al.

BI
(2008), inocularon pimiento con cepas de Azotobacter, Azospirillum y
Rhizobium y en tres meses lograron un aumento de 100 % en el peso seco del
vástago.
92
Bacillus subtilis ha sido reportado como promotor de crecimiento vegetal
efectivo cuando ha sido inoculado en plantas de calabacita (Maldonado et al.,
2008), tomate, pimentón y cebolla (Izzeddin y Medina, 2011), esto debido a los
diversos mecanismos que puede utilizar como la solubilización de fosfatos y el
antagonismo frente a fitopatógenos que afectan el desarrollo de las plantas,
DO
sumado a eso , en este trabajo se verificó que Bacillus subtilis, puede producir
AIA como otro mecanismo para estimular el desarrollo vegetal.
RA
SG
Izzeddin y Medina (2011), reportaron que Bacillus subtilis podía producir un
PO
aumento estadísticamente significativo en la germinación de semillas
DE
inoculadas con respecto a un tratamiento control de semillas de tomate, aunque
si bien en este estudio no se vio tal efecto, no obstante la inoculación de las

CA
semillas si fue determinante para reducir la mortalidad de las plantas inoculadas
con respecto al control, esto puede ser debido a la capacidad que tiene Bacillus
TE
subtilis de inducir un aumento en la resistencia sistémica de la planta, contra

IO
diversos agentes fitopatógenos que incluyen hongos, bacterias, nematodos y

BL
virus (Maldonado et al., 2008).

BI
Rodríguez (2013), llevó a cabo un ensayo preliminar con la bacteria que mostró
la mejor producción de auxina y que correspondió a la Azotobacter A14 de la
zona de San Carlos (44,276 ppm); se probaron las diferentes concentraciones
93
de inóculo (1x106; 1x107; 1x108 UFC/mL) y se midió longitud del tallo y longitud
de hojas de las plantas muestreadas. Los resultados demostraron que el
67,66% de las plantas inoculadas con la cepa nativa, presentaron un mayor
promedio de las alturas del tallo, longitud de hojas y un notable desarrollo
vegetativo de la planta; el parámetro biométrico, longitud de hoja, fue
DO
estadísticamente significativa (P<0,0041) a una concentración bacteriana de
1x108 UFC y altura del tallo (P<0,0071) a una concentración de 1x10 6 UFC.
RA
SG
El AIA absorbido por las semillas y las raíces de las plantas también podría
PO
estimular la actividad de la enzima ACC sintetasa, la cual está involucrada en la
síntesis del etileno. Se ha encontrado que bajas concentraciones de etileno pro-

DE
mueven el crecimiento de los pelos radicales de las plantas inoculadas, y así
aumentan el área superficial de la raíz para una mayor absorción de nutrientes.

CA
Las bacterias promotoras del crecimiento evitan las altas concentraciones de

TE
etileno, las cuales tienen efectos inhibitorios en el desarrollo de las plantas. La
concentración de etileno en plantas inoculadas puede ser el resultado del

IO
balance entre la síntesis estimulada por los altos niveles de AIA y la actividad
BL
ACC deaminasa (Saleem et al., 2007).

BI
La utilización de microorganismos con potencial biofertilizante productores de
AIA ha demostrado ser eficientes gracias a que pueden aumentar los
rendimientos y la calidad de las cosechas; así lo han demostrados los trabajos
en campo realizado en Colombia (Moreno et al., 2006), en los cuales se reporta
94
rendimientos en pastos de un 80% con respecto al testigo, aplicando
biofertilizantes a partir de microorganismos nativos y a las condiciones propias
de la zona.
La obtención y caracterización de nuevas cepas bacterianas promotoras del
DO
crecimiento vegetal adaptadas a las condiciones ambientales de la región en
estudio representa una alternativa tecnológica para su uso como biofertilizantes
RA
en la producción de cultivos de interés hortícola.
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
95
5. CONCLUSIONES
 De los 12 cepas de bacterias endofíticas aisladas a partir de los tallos,
raíces y hojas de Solanum pimpinellifolium. 5 cepas produjeron AIA, 7
cepas mostraron actividad antagónica sobre Fusarium oxyporum, 3 cepas
DO
solubilizaron fosfato, 6 cepas liberaron sideróforos, 3 y 8 cepas mostraron
RA
actividad celulolítica y proteolítica respectivamente; dejando evidencia que
SG
Solanum pimpinellifolium se encuentra asociada a bacterias endofíticas
promotoras de crecimiento. PO
DE
 Cinco cepas productoras de AIA y con por lo menos tres propiedades de

CA
promoción de crecimiento vegetal: cepa 29 (Serratia liquefaciens), cepa 26
(Paenibacillus sp.), cepa 21 (Yokenella sp.), cepa 24 (Bacillus subtilis) y

TE
cepa 35 (Bacillus subtilis), fueron evaluadas en el efecto sobre el

IO
crecimiento de Medicago sativa las cuales aceleraron el proceso de

BL
germinación en 24 horas y la aparición de hojas cotiledonales a 5 días; así

BI
mismo mejoraron el crecimiento de Medicago sativa incrementando el
tamaño radicular, tamaño de tallo y en el número de hojas verdaderas en
las plántulas de 30 días.
96
6. RECOMENDACIONES Y PROPUESTAS
 En las pruebas de antagonismo se sugiere el uso de un medio con un
contenido de hierro mínimo para que de esta forma, se induzca la
producción de sideróforos. De esta forma se observará si la inhibición está
DO
relacionada con la producción de estos metabolitos.
RA
 También se recomienda realizar otras pruebas para la selección de los
SG
organismos promotores de crecimiento como producción de enzimas líticas
PO
como quitinasas, glucanasas y la medición de la producción de ácido
salicílico, ya que todos estos son mecanismos usados por estas bacterias
DE
endofíticas para promover el crecimiento de las plantas.

CA
 La evidencia de la presencia de bacterias endófitas con características de

TE
promotores de crecimiento pone de manifiesto la importancia de estos

IO
microorganismos durante la propagación de diferentes especies forestales y

BL
el potencial biotecnológico en el desarrollo de estrategias para promover su

BI
actividad sobre la planta y su colonización en diferentes tejidos vegetales,
así como su establecimiento como endófito y su transmisión vertical, por lo
que el seguimiento de su colonización mediante marcadores moleculares
permitiría entender de mejor modo el proceso de establecimiento o no de
los microorganismos en las plantas.
97
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adesina, M., Lembke, A., Costa, R., Speksnijder, A., Smalla, K. 2007. Screening
of bacterial isolates from various European soils for in vitro antagonistic activity
towards Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum: Site-dependent
DO
composition and diversity revealed. Soil Biology & Biochemistry. Pág. 2818–
2828.
RA
SG
Adesemoye, A. y Kloepper, J. 2009. Plant-microbes interactions in enhanced
PO
fertilizeruse efficiency. Applied microbiology and biotechnology, Pág. 1-12.
DE
Alam, S., Khalil, N., Ayub, Rashid M. 2002. In vitro solubilization of inorganic
phosphate by phosphate solubilizing microorganisms (PSM) from maize

CA
rhizosphere. Int. J. Agric. Biol. Pág.454-458.

TE
IO
Al Azawi, A., Nawar, H., y Abdulla, M. 2012. Biocontrol of Fusarium oxysporum

BL
f. sp. lycopersici by plant growth promoting bacteria on Tomato plant. Paper

BI
presented at the Second Scientific Conference the Collage of Agriculture.
Araújo, W., Marcon, J., Maccheroni, W., Van, J., Vuurde, J. y Azevedo, J. 2002.
Diversity on endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella
fastidiosa in Citrus plants. Appl Environ Microbiol. Pág. 4906-4914.
98
Arcand, M. y Schneider, K. 2006. Plant and microbial-based mechanisms to
improve the agronomic solubilitation of phosphate rock: a review. En: Anais da
Academia Brasileira de Ciencias, Pág. 791-807.
Baston, B., Magela, P. y Ampélio, R. 2008. Bactérias endofíticas como agentes
DO
promotores do crescimento de plantas de tomateiro e de inibicao in vitro de
Ralstonia solanacearum. Cien. Agrotecnol. Pág. 731-739.
RA
SG
Bernal, J., Valencia, P. y Guineth, S. 2000. Isolation of Enterobacteria,
PO
Azotobacter sp.and Pseudomonas sp., Producers of Indole-3-Acetic Acid and
Siderophores, from Colombian Rice Rhizosphere. Revista Latinoamericana de

DE
Microbiología. Pág. 171-176.

CA
Bhattacharyya, P. y Jha, D. 2012. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR):
emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol, Pág. 1327- 1350.

TE
IO
Bobadilla, C. y Rincón, S. 2008. Aislamiento y producción de bacterias fosfatos

BL
Solubilizadoras a partir de compost obtenido de residuos de plaza. Microbiólogo

BI
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Pág. 16.
Burbano, H. 1989. El suelo: Una Visión sobre sus Componentes Bio orgánicos.
Serie de Investigaciones N°1. Universidad de Nariño. Pasto Colombia. Pág.
337-356.
99
Calderón, C., Alatorre, F., Simpson, J., y Herrera, L. 2009. Handbook of Maize:
Its Biology. En, Bennetzen, J. L. and Hake, S. C. (eds), Handbook of Maize: Its
Biology. Springer New York, NY, Pág. 381-404.
DO
Carrasco, N. y Zamora, M. 2002. Evaluación de inoculantes con bacterias
solubilizadoras de fósforo en maíz. INTA, Tres Arroyos. Web:
RA
http://www.inta.gov.ar/barrow/info/documentos/agricultura/Maiz/informe_inocul_
SG
solubiliza.pdf
PO
Celis, L. y Gallardo, I. 2008. Estandarización de métodos de detección para
DE
promotores de crecimiento vegetal (Ácido Indol-acético y Giberelinas) en
cultivos microbianos. Carrera de Microbiología Agrícola y Veterinaria, Facultad

CA
de ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá.

TE
IO
Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C. y Barba, E. 2005. Use of Plant
BL
Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles,

BI
Mechanisms of Action, and Future Prospects. Applied and environmental
microbiology. Pág. 4951–4959.
100
Compant, S., Clément, C. y Sessitsch, A. 2010. Plant growth-promoting bacteria
in the rhizo- and endosphere of plants: their role, colonization, mechanisms
involved and prospects for utilization. Soil. Biol. Biochem. Pág. 669-678.
Compant, S., Reiter, B., Sessitsch, A., Nowak, J., Clément, C. y Ait Barka, E.
DO
2005. Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by plant growth-promoting
RA
bacterium Burkholderia sp. Appl Environ Microbiol. Pág.1685-1693.
SG
Conrath, U., Beckers, G., Flors, V., García, P., Jakab, G., Mauch, F., Newman,
PO
M., Pieterse, C., Poinssot, B., Pozo, M., Pugin, A., Schaffrath, U., Ton, J.,
Wendehenne, D., Zimmerli, L. y Mauch, B. 2006. Priming: getting ready for

DE
battle. Mol Plant Microbe Interact. Pág. 62-71.

CA
TE
Cook, R. y Baker, F. 1983. The nature and practice of biological control of plant
pathogens. The American Phytopathological Society, St.Paul. Pág. 539.

IO
BL
Fages, J. 1994. Azospirillum inoculants and field experiments. In: Okon, Y.

BI
(Ed.), Azospirillum/Plant Associations. CRC Press, Boca Raton, Pág. 87 - 109.
Faraldo, J, y Sansom, M. 2003. Acquistion of siderophores in Gram
negativebacteria. Nature Reviews Molecular Cell Biology. Pág. 105-116
101
Farrar, R. y Kennedy, G. 1991. Insect and mite resistance in tomato. En:
Genetic Improvement of tomato. Monographs on Theoretical and Applied
Genetics. Editor: Kalloo, G. Ed. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. Vol. 14, Pág.
122-141.
DO
Fernández, L., Zalba, P., Gómez, M. y Sagardoy, A. 2005. Bacterias
solubilizadoras de fosfato inorgánico aisladas de suelos de la región sojera. En:
RA
CI. Suelo (Argentina). Pág. 31-37.
SG
PO
Foolad, M. y Panthee, D. 2012. Marker-Assisted Selection in Tomato Breeding.
Critical Reviews Plant Sciences. vol. 31, ISSN: 0735-2689. Pág. 93-123.
DE
CA
Garcia, I., Hynes, R. y Nelson, L. 2005. Role of cytokinins in plant growth by
rhizosphere bacteria. PGPR: Biocontrol and fertilization. Pág 173-195.

TE
IO
Gangadara, B., Saifulla, R. y Basavaraja, M. 2010. Biological control of

BL
Fusarium oxysporum f. sp. vanillae, the causal agent of stem rot of vanilla in
BI
vitro. International Journal of Science and Nature. Pág. 259-261.
Gyaneshwar, P., James, E., Mathan, N., Reddy, P. y Ladha, J. 2001.
Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratia marcescens.
J Bacteriol. Pág. 2634-2645.
102
Gyaneshwar, P., Kumar, G., Parekh, L., y Poole, P. 2002. Role of soil
microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant and soil, Pág, 83-92.
DO
González, G. 1974. Estudio sobre marchitez del tomate causada por Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici, en el valle de Culiacán, Sinaloa. Tesis de Maestría
RA
en Ciencias. Colegio de Postgraduados. Chapingo, Edo. De México. Pág. 64.
SG
PO
Gutierrez, P. 2013. Efecto de la inoculación con bacterias diazotrofas en plantas
de maíz (Zea mays L.) de distintas variedades. Laboratorio de microbiología

DE
vegetal, Dpto biología vegetal, facultad de agronomía, UDELAR. Pág. 1-80.

CA
Hameeda, B., Harini, O., Rupela, S., Wani,, y Gopal, R. 2008. Growth promotion
TE
of maize by phosphate solubilizing bacteria isolated from composts and

IO
macrofauna. Microbiol. Pág. 234-242.

BL
BI
Hans, M., Walter, J. y Heldt, t. 1997. Plant Biochemestry &Molecular Biology.
Oxford University. Pág. 395-413.
Hantke, K. 2001. Iron and metal regulation in bacteria. Current Opinion in
Microbiology. Pág.172–177.
103
Hardoim, P,. Overbeek, L,. Van, J. y Elsas. D. 2008. Properties of bacterial
endophytes and their proposed role in plant growth. Trends Microbiol. Pág. 463-
471.
DO
Hernández, S. 2011. Producción de tomate en diferentes granulometrías de
RA
“tezontle”. Tesis de Maestría. Colegio de Postgraduados “Campus Montecillo”,
Texcoco, Estado de México. Pág. 107.
SG
PO
Hofmockel, K., Fierer, B., Colman D. y Jackson, R. 2010. Amino acid
abundance and proteolytic potential in North American soils. Oecol. Pág.1069-

DE
1078.
CA
TE
Izzeddin, N. y Medina, L. 2011. Efecto del control biológico por antagonistas
sobre fitopatógenos en vegetales de consumo humano. Salus online.

IO
Antagonistas y fitopatógenos en vegetales. Pág. 8-18.

BL
BI
Jalili, F,. Khavazi, E., Pazira, A., Nejati, H., Rahmani, H., Sadaghiani, M. y
Miransari, N. 2009. Isolation and characterization of ACC deaminase-producing
fluorescent pseudomonads, to alleviate salinity stress on canola (Brassica
napus L.) growth. J. Plant Physiol. Pág. 667-674.
104
Ju, R., Zhao, Y., Li, J., Jiang, H., Liu, P., Yang, T. y Liu, X. 2014. Identification
and evaluation of a potential biocontrol agent, Bacillus subtilis, against Fusarium
sp. in apple seedlings. Annals of Microbiology, Pág. 377-383.
DO
Kapulnik, Y. 2002. Plant Growth Promoting by Rhizosphera Bacteria. Plant
Roots The Hidden Half. Ed Marcel Dekker. Nueva York. Estados Unidos de
RA
América. Pág. 869-887.
SG
Karkachi, N., Gharbi, S., Kihal, M. y Henni, J. 2010. Biological Control of
PO
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici Isolated from Algerian Tomato by
DE
Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus, Serratia marcescens and
Trichoderma harzianum. Research Journal of Agronomy. Pág. 31-34.

CA
TE
Kim, Y., Leveau, J., McSpadden, R. Gardener, B., Pierson, A., Pierson, L., y
Ryu, C. 2011. The multifactorial basis for plant health promotion by plant-
IO
associated bacteria. Appl Environ Microbiol. Pág. 1548-1555.

BL
BI
Kurek, E., Jaroszuk, J. 2003. Rye (Secale cereale) growth promotion by
Pseudomonas fluorescens strains and their interactions with Fusarium
culmorum under various soil conditions. Biological Control. Pág. 48–56.
105
Kuklinsky, J., Araújo, W., Mendes, R., Geraldi, I., Pizzirani-Kleiner, A., y
Azevedo, J. 2004. Isolation and characterization of soybean-associated bacteria
and their potential for plant growth promotion. Environmental microbiology, Pág.
1244-51.
DO
Lagunas, J., Zavaleta, K., Osada, O., Aranda, R., Luna, H. y Vaquera, H. 2001.
Bacillus firmus como agente de control biológico de Phytophthora capsici Leo.
RA
en jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.). Rev. Mex. Fitopat. Pág. 57-65.
SG
PO
Labate, J. Grandillo, S., Fulton, T., Muños, S., Caicedo, A., Peralta, I., Ji, Y.,
Chetelat, R., Scott, J. y Gonzalo, M. 2007. En: Genome Mapping and Molecular
DE
Breeding in Plants. Editor: Chittaranjan Kole, Ed. Springer-Verlag
BerlinHeidelberg. ISBN: 13 978-3-540-34535-0. vol. 5, vegetables. Pág. 1-95.

CA
TE
Lambrecht, M., Okon, Y., Van de Broek, A., y Vanderleyden, J. 2000. Indole-3-
IO
cetic acid: a reciprocal signalling molecule in bacteria-plant interactions. Trends

BL
in microbiology. Pág. 298-300.

BI
Lara, C., Oviedo, L. y Betancur, C. 2011. Bacterias nativas con potencial en la
producción de ácido indolacético para mejorar los pastos. Zootecnia Trop.,
29(2): 187-194.
106
Lathe, R. 1985. Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid
sequence data. Theoretical and practical considerations. Pág.11–12.
Liang, Y., Zhu, Y., Smith, F. y Lambers, H. 2010. Soil-plant interactions and
DO
sustainability of ecoagriculture in arid region: a crucially important topic to
address. Plant Soil. Pág. 1-2.
RA
SG
Li, J., Wang, E. y Chen, W. 2008. Genetic diversity and potential promotion of
PO
plant growth detected in nodule endophytic bacteria of soybean grown in
Heilongjiang province of China. Soil Biol Biochem. Pág. 238 – 246.

DE
Liu, J., Liu, M., Wang, J., Yao, J., Pan, R. y Yu, Z. 2005. Enhancement of the
CA
Gibberella zeae growth inhibitory lipopeptides from a Bacillus subtilis mutant by

TE
ion beam implantation. Appl Microbiol Biotechnol.

IO
BL
López, L., Carbonell, T. y Gómez, S. 2002. Degradation of insect cuticle by

BI
Paecilomyces farinosus proteases. Mycological Progress. Pág. 249-256.
Luna, L. et al. 2013. Caracterización de rizobacterias aisladas de tomate y su
efecto en el crecimiento de tomate y pimiento. Rev. Fitotec. Mex. Vol. 36 Pág.
63 - 69
107
Maldonado, E., Ochoa, L. y Tlapal, B. 2008. Efecto del ácido acetil salicílico y
Bacillus subtilis en la infección causada por Cucumber mosaic virus en
calabacita. Revista Chapingo Serie Horticultura. Pág. 55-59.
DO
Martin, A. 1980. Introducción a la microbiología del suelo. AGT EDITOR, S.A.
Pág. 1 – 491.
RA
SG
Martínez, L., Martínez, R., Hernández, M., Arvizu, S. y Pacheco, J. 2013.
Caracterización De Rizobacterias Aisladas De Tomate y Su Efecto En

PO El
Crecimiento De Tomate Y Pimiento. Rev. Fitotec. Mex. Pág. 63 – 69.

DE
Matson, A., Parton, G., Power, M. y Swift, J. 1997. Agricultural Intensification

CA
and Ecosystem Properties. Sci., 25. Pág. 504-509.

TE
Mehta, S. y Nautiyal, S. 2001. An efficient Method for qualitative screening of

IO
phosphate-solubilizing bacteria. Current Microbiology. Pág. 51-56.

BL
BI
Mendes, R., Pizzirani, A., Welington, L. y Raaijmakers, J. 2007. Diversity of
Cultivated Endophytic Bacteria from Sugarcane: Genetic and Biochemical
Characterization of Burkholderia cepacia Complex Isolates. Appl Environ
Microbiol. Pág. 7259–7267.
108
Mercado, J., Drift, K., Olsson, P., Thomas, J., Loon, L. y Bakker, P. 2001.
Analysis of the pmsCEAB Gene Cluster Involved in Biosynthesis of Salicylic
Acid and the Siderophore Pseudomonine in the Biocontrol Strain Pseudomonas
fluorescens WCS374. Journal of Bacteriology. Pág. 1909–1920.
DO
Miethke, M. y Marahiel, M. 2007. Siderophore-Based Iron Acquisition and
RA
Pathogen Control. Microbiology and Molecular Biology Reviews 71(3): 413–451
Mirleau, P., L. Philippot, T. Corberand y P. Lemanceau. 2001. Involvement of
SG
nitrate reductase and pyoverdine in competitiveness of Pseudomonas
PO
fluorescens strain c7r12 in soil. Appl. Environ. Microbiol. Pág. 67.
DE
Montie, T. 1998. Biotechnology Handbooks 10. Pseudomonas. Editorial Plenum
Press. New York, USA. Pág. 201-230.

CA
TE
Moreno, F., Malgón, C., Rodríguez, D. y Vanegas, J. 2006. Introducción
prácticas de laboratorio y Planta Piloto. Evaluación de la producción de AIA.

IO
Curso internacional. Producción de biofertilizantes desde el laboratorio al

BL
campo. Memorias. Universidad Nacional de Colombia, COLCIENICAS-

BI
CABBIO-BIOCULTIVOS. Instituto de Biotecnología (IBUN). Santa Fé de
Bogotá.
Moreno, F., Malgón, D., Rodríguez, C. y Vanegas, J. 2006. Introducción
prácticas de laboratorio y Planta Piloto. Evaluación de la producción de AIA.
109
Curso internacional. Producción de Biofertilizantes desde el laboratorio al
campo. Memorias. Universidad Nacional de Colombia, COLCIENICAS-
CABBIO-BIOCULTIVOS. Instituto de Biotecnología (IBUN). Santa Fé de
Bogotá.
DO
Mostacero, J. y Mejía, F. 2002. “Taxonomía de las Fanerógamas Útiles del
Perú”. 2° Edición: Trujillo. Pág. 784.
RA
SG
Nair, D. y Padmavathy, S. 2014. Impact of endophytic microorganisms on
PO
plants, environment and humans. Scientific World Journal 250693, doi:
10.1155/2014/250693.
DE
Nandhini, S., Sendhilvel, V., y Babu, S. 2012. Endophytic bacteria from tomato
CA
and their efficacy against Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, the wilt
pathogen. Journal of Biopesticides, Pág. 178-185.

TE
IO
Nalini, S., y Parthasarathi, R. 2014. Production and characterization of

BL
rhamnolipids produced by Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state

BI
fermentation and its application as biocontrol agent. Bioresource Technology,
Pág. 231-238.
110
Patten, L. y Glick, B. 2002. Role of Pseudomonas putida Indoleacetic Acid in
Development of the Host Plant Root System. Applied and environmental
microbiology, Pág. 3795–380.
Pérez, F., Alías, C., Bellogín, R., Espuny, M., Jiménez, I., López, F., Ollero, F. y
DO
Cubo, T. 2014. Plant growth promotion in cereal and leguminous agricultural
important plants: from microorganism capacities to crop production. Microbiol
RA
Res 169. Pág. 325-336.
SG
PO
Perez, S., Cabirol, N., George, R., Zamudio, S. y Fernández, F. 2007. O-CAS, a
fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological

DE
Methods. Pág. 127–131

CA
TE
Petrini, O. 1986. Taxonomy of endophytic fungi in aerial plant tissues.
Microbiology of the phyllosphere. Cambrige, UK, Cambrige University. Pág. 175-

IO
187.
BL
BI
Rademaker, J., Aarts, J. y Vinuesa, P. 2005. Molecular typing of environmental
isolates. In: Mark Osborn and Cindy Smith (eds) Molecular Microbial Ecology.
Chap. Pág. 97–134.
111
Ragazzo, J., Robles, A., Lomelí, L., Luna, G. y Calderón, M. 2011. Selección de
cepas de Bacillus spp. Productoras de antibióticos aisladas de frutos tropicales.
Revista Chapingo Serie Horticultura. Pág. 5-11.
Ramírez, V. 1998. Enfermedades de la raíz en tomate. pp. 29-49. En: O.J. Cruz,
DO
R. García E. y A. Carrillo F. (eds.). Enfermedades de las Hortalizas. Universidad
RA
Autónoma de Sinaloa. Culiacán, Sinaloa, México. Pág. 255.
SG
Ramyabharathi, S. y Raguchander, T. 2014. Mode of action of Bacillus subtilis
PO
epco16 against tomato Fusarium wilt. Biochemical and Cellular Archives, Pág.
DE
47-50.
CA
Registeri, R., Taghavi, S. y Banihashemi, Z. 2012. Effect of Root Colonizing
Bacteria on Plant Growth and Fusarium Wilt in Cucumis melo. Journal of

TE
Agricultural Science and Technology, Pág. 1121-1131.

IO
BL
Reinhold, B., y Hurek, T. 1998. Life in grasses: Diazotrophic endophytes. Trends

BI
Microbiol. Pág. 139-144.
Reinhold, B. y Hurek, T. 2011. Living inside plants: Bacterial endophytes. Curr.
Opin. Plant Biol. Pág. 435-443.
112
Reyes, I., Alvares, L., Ayoubi, H. y Valery, A. 2008. Selección y evaluación de
rizobacterias promotoras del crecimiento en pimentón y maíz. Bioagro vol 20(1).
Pág. 37- 48.
Reyes I, L Alvarez, H E Ayoubi, A Valery. 2008. Selección y evaluación de
DO
rizobacterias promotoras del crecimiento en pimentón y maíz. Bioagro Pág. 37-
48.
RA
SG
Ribaudo, C. Krumpholz, E., Cassán, D., Bottini, R., Cantore, M. y Curá, A. 2006.
PO
Azospirillum sp. promotes root hair development in tomato plants through a
mechanism that involves ethylene. J. Plant Growth Reg. Pág. 175-185.

DE
Rivieros, J. 2008. Evaluacion de microorganismos con potencial en

CA
biofertilizacion para un cultivo de uchuva (Physalis peruviana L.) en etapas de

TE
semillero y vivero. Ingeniero Agrónomo. Universidad Nacional de Colombia.
Facultad de Agronomía. Pág. 11 – 12.

IO
BL
Ribeiro M., Martins J., Marques N., Da silva D., Ferreira O., Azevedo J., Araujo
BI
J. y Souza G. 2014. Plant growh promoting potential of endophytic bacteria
isolated from cashew leaves. Academicjournals. Pág. 1-6.
113
Robertson, G. y Groffman, P. 2007. Nitrogen transformations. En: E.A. Paul,
editor, Soil microbiology, ecology and Biochemistry. Elsevier, Amsterdam,
Holanda. Pág. 341-364.
Rocha, D. y Moura, A. 2013. Controle biológico da murcha do tomateiro
DO
causada por Ralstonia solanacearum e Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
RA
por rizobactérias. Tropical Plant Pathology, Pág. 423-430.
SG
Rodriguez, C. 2013. Evaluación de microorganismos promotores de crecimiento
PO
vegetal en tomate (Solanum lycopersicum) variedad santa clara, aislados de
residuos lignocelulósicos de higuerilla (Ricinus communis). Trabajo para optar el

DE
título de microbiólogo industrial. UNIVERSIDAD CATÓLICA DE MANIZALES.
Pág 1 – 66.
CA
TE
IO
Rodríguez, H., Fraga, R., Gonzalez, T., y Bashan, Y. 2006. Genetics of

BL
phosphate solubilization and its potential applications for improving plant growth-
promoting bacteria. Plant and soil, Pág. 15-21.

BI
Rodríguez, H. y Fraga, R. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in
plant growth promotion. En: Biotechnology Advances, Pág. 1319-339.
114
Rosenblueth, M. y Martínez, E. 2006. Bacterial endophytes and their
Interactions with hosts. Ame Phylopathol Soci. Pág. 827- 837.
Ryan, P., Dessaux, S., Thomashow, Y. y Weller, D. 2009. Rhizosphere
engineering and management for sustainable agriculture. Plant Soil Pág. 363-
DO
383.
RA
Saidi, N., Kouki, S., M‟Hiri, F., Hajlaoui, M., Mahrouk, M., Ouzari, H. y Hassen,
SG
A. 2009. Characterization and selection ofBacillus sp. strains, effective
PO
biocontrol agent’s againstFusarium oxysporum f. sp.radicis-lycopersici, the
causal agent of Fusarium crown and root rot in tomato. Annals of Microbiology,
DE
Pág. 191-198
CA
Saleem, M., Arshad, S., Hussain, A. y Bhatti, S. 2007. Perspective of plant

TE
growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress

IO
agriculture. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. Pág. 635-648.

BL
BI
Santillana, N., Arellano, C. y Zúñiga, D. 2005. Capacidad del Rhizobium de
promover el crecimiento en plantas de tomate (Lycopersicum esculentum
Miller). Ecol. Aplic. Pág. 47-51.
115
Schwyn, B. y Neilands, J. 1987. Universal chemical assay for the detection and
determination of siderophores. Anal Biochem. enero; Pág. 47-56.
Sessitsch, A., Howieson, J., Perret, X., Antoun, H. y Romero, E. 2002.
Advances in Rhizobium research. Crit Rev Plant Sci. Pág 323-378.
DO
RA
Shulz, B. y Boyle, C. 2006. What are endophytes? Microbial root endophytes.
Berlin-Heidelberg. Soil Biology. Pág. 1-13.
SG
PO
Soberón, J., Quiroga, E., Sampietro, A. y Vattoure M. 2005. Auxinas. Argentina,
Hipertextos del Área de Biología.

DE
CA
Stackebrandt, E., Frederiksen. W., Garrity, G., Grimont, P., Kämpfer, P.,
TE
Maiden, M., Nesme, X., Rosselló, R., Swings, J., Trüper, H., Vauterin, L., Ward,
A. y Whitman, W. 2002. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of

IO
the species definition in bacteriology. Evol Microbiol. Pág. 1043-1047.

BL
BI
Tairi, D. 2014. Evaluación y selección de bacterias promotoras de crecimiento
vegetal y su capacidad de antagonismo frente Rhizoctonia solani. Titulación de
bioquímico farmacéutico en la Universidad Técnica particular de Loja. Pág. 1 -
61.
116
Tamariz, C. 2014. Diversidad de bacterias termotolerantes celulolíticas y
xilanolíticas aisladas de fuentes termales del Callejón de Huaylas. Tesis para
optar el grado de Doctora de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Pag. 1 – 142.
DO
Thakuria, D., Talukdar, C., Goswani, S., Hazarika, R., Boro, M. y Khan, R. 2004.
Characterization and screening of bacteria from rhizosphere of rice grown in
RA
acidic soils of Assam. Curr. Sci. Pág. 978-985.
SG
PO
Tejera, B., Rojas, M. y Heydrich, M. 2011.Potencialidades del género Bacillus
en la promoción del crecimiento vegetal y el control biológico de hongos

DE
fitopatógenos. Revista CENIC Ciencias Biológicas. Pág. 131-138.

CA
TE
Tilman, D., Cassman, K., Matson, P., Naylor, R., y Polasky, S. 2002. Agricultural
sustainability and intensive production practices. Pág. 671-677.

IO
BL
BI
Mattoo, A. 2007. Tomato and other Lycopersicon species to insect and mite
pests. En: Genetic improvement of Solanaceous crops. Eds. Razdan, Science
Publ, Enfield, NH, USA. Vol. 2, Pág. 488-519.
117
Tudzinski, B. y Sharon, A. 2002. Byosinthesis, biological role and application of
fungal phytohormones. The mycota. Pág. 183-205
Utsumi, R., Yagi, T., Katayama, S., Katsuragi, K., Tachibana, K., Toyoda, H.,
Ouchi, S., Obata, K., Shibano, y. y Noda, M. 1991. Molecular cloning and
DO
characterization of the fusaric acid-resistance gene from Pseudomonas cepacia.
Agric. Biol. Chem. Pág. 1913-1918.
RA
SG
Vacheron, J., Desbrosses, G., Bouffaud, M., Touraine, B., Moënne, Y., Muller,
PO
D., Legendre, L., WisniewskiDyé, F. y Prigent, C. 2013. Plant growth-promoting
rhizobacteria and root system functioning. Front Plant Sci. Pág. 356.
DE
CA
Valencia, E., et al. 2005. INHIBICIÓN DE Fusarium oxysporum POR CEPAS

TE
MUTANTES DE Pseudomonas fluorescens ZUM80 INCAPACES DE
PRODUCIR SIDERÓFOROS. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo, A.C.

IO
Chapingo, México. Terra Latinoamericana, vol. 23, núm. 1, enero-marzo, 2005,

BL
Pág. 81-88.
BI
Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., De Vos, P., Kersters, K. y Swings, J. 1996.
Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol.
Rev. 60, Pág. 407-438.
118
Vassilev, N., Vassileva, M. y Nikolaeva, I. 2006. Simultaneous P-solubilizing and
biocontrol activity of microorganisms: potentials and future trends. En: Appl
Microbiol Biotechnol, Pág. 137-144.
DO
Venegas, E., Ciampi, L., Collado, L., Costa, M., Fuentes, R., Nissen, J.,
Schobitz, R. y Schoebitz, M. 2005. Aislamiento e identificación de bacterias
RA
nativas del género bacillus cohn antagonistas de cepas patógenas de fusarium
SG
link. en cala. Agro sur. [en línea]. Vol.33, no.2, Pág.1-12.
PO
Venner, C. y Martin, M. 2013. Aislamiento y selección de rizobacterias
DE
promotoras de crecimiento vegetal en cultivos de uchuva (Physalis peruviana

CA
L.) con capacidad antagónica frente A Fusarium sp. Título de microbiólogo
agrícola y veterinario y microbiólogo industrial. Pontificia Universidad Javeriana.

TE
Carrera de Microbiologia industrial. Pág. 1 – 61.

IO
BL
Ventimiglia, L., Torrens Baudrix, L., y Camarasa, J. 2008. Uso de fertilizantes y

BI
promotores de crecimiento en trigo. INTA, Buenos Aires. Web:
http://www.jogagro.com.ar/experiencia_trigo_2007_08.pdf
VESSEY, J. 2003. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant
and Soil, Pág. 571–586.
119
Vinchira, D. 2014. Evaluación de tres aislamientos bacterianos como
potenciales promotores de crecimiento vegetal en plantas de arroz (Oryza
sativa). Universidad Nacional de Colombia. Facultad de ciencias, Posgrado
Interfacultades en Microbiología. Bogotá, Colombia. Pág. 1 – 126.
DO
RA
Wang, T., Tan, Z., Guo, W., Duran, R., Boll, G., Romero, E. 2006. Diverse
endophytic bacteria isolated from a leguminous tree Conzattia multiflora grown
SG
in Mexico. Arch Microbiol, Pág. 251-259.
PO
Wahyudi, A., Astuti, R., Widyawati, A., Meryandini, A. y Nawangsih, A. 2011.
DE
Characterization of Bacillus sp. strains isolated from rhizosphere of soybean

CA
plants for their use as potential plant growth for promoting rhizobacteria. J.
Microbiol. Antimicrobials Pág. 34-40.

TE
IO
Waisel, Y., Eshel, A. y Kafkaki, U. 2002. Plant Roots. The Hidden Half. 3rd
BL
Edition. Pág. 1120.

BI
Wilson, M., Abergel, R., Raymond, K., Arceneaux, J. y Byers, B. 2006.
derophores of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis.
Biochemical and Biophysical Research Communication. Pág. 320–325.
120
Woese, C. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev.51. Pág. 221-271.
Yasmin, S., Hafeez, F. Y., & Rasul, G. 2014. Evaluation of Pseudomonas
aeruginosa Z5 for biocontrol of cotton seedling disease caused by Fusarium
oxysporum. Biocontrol Science & Technology, Pág. 1227.
DO
RA
SG
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
121
8. ANEXOS
DO
RA
SG
PO
Figura 1. Colectando las muestras de tomate silvestre en la localidad de
DE
pedregal – Trujillo.
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 2. Lugar de colecta Solanum pimpinellifolium en la provincia de Trujillo
localidad de pedregal.
122
DO
RA
SG
PO
Figura 3. Prensando el material biológico para su posterior identificación.
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 4. Selección, corte y desinfección de raíz, tallo y hojas de
Solanum pimpinellifolium
123
21 C
DO
RA
SG
Figura 5. Cepas bacterianas endofíticas presentes en los tejidos desinfectados.
PO
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 6. Aislamiento de cepas bacterianas endofíticas por siembra en estrías
en placas con TSA
124
DO
RA
SG
PO
Figura 7. Siembra de cepas bacterianas endofíticas en tubos inclinados.
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 8. Almacenamiento de cepas bacterianas endofíticas en tubos
inclinados.
125
DO
RA
SG
PO
Figura 9. Realizando las pruebas promotoras de crecimiento.
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 10. Realizando pruebas de producción de AIA.
126
DO
RA
SG
PO
Figura 11. Curva estándar de producción de AIA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 12. Realizando pruebas de sideróforos.
127
DO
RA
SG
PO
Figura 13. Revelación de actividad celulolítica en las cepas bacterianas
endofíticas aisladas.
DE
CA
TE
Tabla 2. Análisis de varianza de la producción de AIA (μg/mL) de la cepa 35 a

IO
las 24 horas.
BL
ANOVA
AIA
BI
Suma de Media
cuadrados Gl cuadrática F Sig.
Entre
168.637 4 42.159 .864 .518
grupos
Dentro de
grupos 487.713 10 48.771
Total 656.351 14
128
la cepa 24 a las 24 horas.
ANOVA
AIA
Suma de Media
Gl F Sig.
cuadrados cuadrática
DO
Entre
198.563 4 49.641 17.964 .000
grupos
Dentro de
RA
27.633 10 2.763
grupos
Total 226.195 14
SG
PO
DE
AIA
CA
Duncana
TE
Subconjunto para alfa = 0.05

IO
EP24 N c b a
DO:1
BL
3 34.5900
DO:3 3 39.4600
BI
DO:4 3 42.7967
DO:5 3 43.5667
DO:2 3 44.5933
Sig. 1.000 1.000 .235
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos
homogéneos.
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 3.000.
129
ANOVA
AIA
Suma de Media
Entre
DO
293.056 4 73.264 21.097 .000
grupos
Dentro de
34.727 10 3.473
grupos
RA
Total 327.783 14
SG
PO

DE
AIA
Duncana
CA
Subconjunto para alfa =

0.05
TE
EP21 N b a
DO:4 3 16.8933
IO
DO:2 3 19.2033
BL
DO:1 3 19.9733
DO:3 3 25.8733
BI
DO:5 3 28.6900
Sig. .082 .094
homogéneos.
130
ANOVA
AIA
Suma de Media
DO
Entre
65.299 4 16.325 1.760 .213
grupos
Dentro de
RA
grupos 92.765 10 9.276
Total 158.064 14
SG
PO
DE

CA
AIA
Duncana
TE

0.05
IO
EP26 N b a
BL
DO:5 3 19.4600
DO:1 3 20.7433 20.7433
BI
DO:2 3 21.0000 21.0000

DO:3 3 21.7700 21.7700
DO:4 3 25.6167
Sig. .406 .098
homogéneos.
131
ANOVA
AIA
Suma de Media
DO
Entre
15.653 4 3.913 4.125 .031
grupos
Dentro de
RA
grupos 9.486 10 .949
Total 25.139 14
SG
PO
DE

CA
AIA
TE
Duncana
0.05
IO
EP29 N b a
BL
DO:4 3 17.9200
DO:2 3 18.9467
BI
DO:1 3 18.9467
DO:5 3 19.7167 19.7167
DO:3 3 21.0000
Sig. .061 .138
homogéneos.
132
ANOVA
AIA
Suma de Media
cuadrados gl cuadrática F Sig.
Entre
DO
155.594 4 38.898 24.003 .000
grupos
Dentro de
16.206 10 1.621
grupos
RA
Total 171.800 14
SG
PO
DE

CA
AIA
Duncana
TE

0.05
IO
EP35 N b a
DO:5
BL
3 21.7700
DO:1 3 28.6900
BI
DO:2 3 29.2033
DO:4 3 30.2300
DO:3 3 30.4867
Sig. 1.000 .138
homogéneos.
133
ANOVA
AIA
Suma de Media
DO
Entre
645.083 4 161.271 6.268 .009
grupos
Dentro de
257.293 10 25.729
RA
grupos
Total 902.376 14
SG
PO
DE

CA
AIA
Duncana
TE

0.05
IO
EP24 N b a
BL
DO:4 3 14.5900
DO:5 3 25.6167
BI
DO:3 3 26.8967
DO:2 3 29.2033
DO:1 3 34.5900
Sig. 1.000 .071
homogéneos.
134
ANOVA
AIA
Suma de Media
DO
Entre
47.153 4 11.788 .491 .743
grupos
Dentro de
240.276 10 24.028
RA
grupos
Total 287.429 14
SG
PO
DE

CA

TE
ANOVA
AIA
IO
Suma de Media
BL
Entre
39.335 4 9.834 2.397 .120
grupos
BI
Dentro de
grupos 41.026 10 4.103
Total 80.360 14
135
ANOVA
AIA
Suma de Media
DO
Entre
206.044 4 51.511 13.298 .001
grupos
Dentro de
RA
grupos 38.736 10 3.874
Total 244.780 14
SG
PO
DE
AIA
CA
Duncana
TE

IO
EP29 N b a
DO:1 3 21.2567
BL
DO:4 3 21.7700
BI
DO:2 3 21.7700
DO:3 3 22.2833
DO:5 3 31.0000
Sig. .564 1.000
homogéneos.
136
Tabla 19. Análisis de varianza del porcentaje de inhibición de las cepas
bacterianas endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días
ANOVA
PORCENTAJE DE INHIBICIÓN
Suma de Media
Entre grupos 42879.077 12 3573.256 405.108 .000
DO
Dentro de
344.000 39 8.821
grupos
RA
Total 43223.077 51
SG
Tabla 20. Prueba de DUNCAN del porcentaje de inhibición de las cepas
PO
bacterianas endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días
PORCENTAJE DE INHIBICIÓN
DE
Duncana
Subconjunto para alfa = .05

CA
CEPA N h g f e d c b a
CONTROL 4 0.00
TE
CEPA27 4 28.25
CEPA31 4 35.25
CEPA42 4 38.25
IO
CEPA20 4 46.25
BL
CEPA9 4 46.50
CEPA23 4 71.75
CEPA32 4 73.25
BI
CEPA24 4 82.25
CEPA21 4 84.50
CEPA35 4 85.75
CEPA26 4 95.00
CEPA29 4 100.00
Sig. 1.000 1.000 .161 .906 .479 .123 1.000 1.000
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.

137
Tabla 21. Análisis de varianza de solubilización de fosfatos de las cepas

bacterianas endofíticas aisladas a los 7 días
ANOVA
SOLUBILIZACIÓN FOSFATOS
Suma de Media
DO
Entre grupos .425 12 .035 46.083 .000
Dentro de grupos
.010 13 .001
RA
Total .435 25
SG
Tabla 22. Prueba de DUNCAN aplicado a solubilización de fosfatos de las
PO
cepas bacterianas endofíticas aisladas a los 7 días
SOLUBILIZACIÓN FOSFATOS
DE
Duncana
CA
CEPAS N c b a
CONTROL 2 0.00
CEPA20 2 0.00
TE
CEPA42 2 0.00
CEPA27 2 0.00
IO
CEPA24 2 0.00
CEPA29 2 0.00
BL
CEPA31 2 0.00
CEPA9 2 0.00
BI
CEPA32 2 0.00
CEPA23 2 0.00
CEPA21 2 0.25
CEPA35 2 0.30 0.30
CEPA26 2 0.35
Sig. 1.0 0.095 0.095
138
Tabla 24. Análisis de varianza de la actividad celulolítica de las cepas

bacterianas endofíticas aisladas a los dos días.
ANOVA
ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
Suma de Media
Entre grupos 12.495 12 1.041 208.256 .000
DO
Dentro de grupos .065 13 .005
Total 12.560 25
RA
Tabla 25. Prueba de DUNCAN aplicado a la actividad Celulolítica de las cepas
SG
PO
ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
Duncana
DE

CEPA N d c b a
CA
CONTROL 2 0.00
CEPA20 2 0.00
TE
CEPA42 2 0.00
CEPA27 2 0.00
IO
CEPA23 2 0.00
CEPA21 2 0.00
BL
CEPA31 2 0.00
BI
CEPA9 2 0.00
CEPA32 2 0.00
CEPA26 2 0.00
CEPA29 2 0.60
CEPA24 2 1.10
CEPA35 2 2.45
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000
139
Tabla 26. Análisis de varianza de la actividad proteolítica de las cepas bacterias

endofíticas aisladas a los dos días.
ANOVA
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
Suma de Media
DO
Entre grupos 6.405 12 .534 49.560 .000
Dentro de grupos .140 13 .011
RA
Total 6.545 25
SG
Tabla 27. Prueba de DUNCAN aplicado a la actividad proteolítica de las cepas
PO
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
DE
Duncana

CA
CEPA N g f e d c b a
CONTROL 2 0.00
CEPA9 2 0.00
TE
CEPA32 2 0.00
CEPA23 2 0.00
IO
CEPA26 2 0.00
CEPA27 2 0.50
BL
CEPA29 2 0.65 0.65

CEPA42 2 0.75 0.75
BI
CEPA35 2 0.80 0.80 0.80

CEPA24 2 0.90 0.90 0.90
CEPA21 2 1.00 1.00
CEPA31 2 1.05
CEPA20 2 1.55
Sig. 1.000 0.172 0.192 0.192 0.089 0.192 1.000

140
Tabla 28. Análisis de varianza del porcentaje de germinación de semillas de

alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 24
horas
ANOVA
PORCENTAJE DE GERMINACIÓN
DO
Suma de Media
Entre grupos 4243.750 7 606.250 8.818 .003
RA
Dentro de
550.000 8 68.750
grupos
SG
Total 4793.750 15
PO
Tabla 29. Prueba de DUNCAN al porcentaje de germinación de semillas de
DE

horas
CA
PORCENTAJE DE GERMINACIÓN
Duncana
TE

CEPA N b a
IO
CONTROL 2 35.00
BL
CEPA24 2 70.00
CEPA35 2 75.00
BI
CEPA21 2 75.00
CEPA26 2 80.00
CEPA29 2 90.00
Sig. 1.000 0.058
141
inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días
ANOVA
T.RADICULAR
Suma de Media
DO
Entre grupos .170 5 .034 .416 .837
Dentro de grupos 7.660 94 .081
RA
Total 7.829 99
SG
PO
DE
CA
inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días.

TE
ANOVA
T.TALLO
IO
Suma de Media
BL

Entre grupos 4.495 5 .899 1.467 .208
BI

Total 62.110 99
142
Tabla 32. Prueba de DUNCAN del tamaño tallo de las plántulas de alfalfa
T.TALLO
Duncana,b
DO
CEPA N b a
CEPA26 20 2.0500
CEPA29 20 2.0550
RA
CEPA24 20 2.0750
CEPA21 20 2.1500 2.1500
SG
CEPA35 20 2.2867 2.2867
CONTROL 20PO 2.6667
Sig. .449 .076
homogéneos.
DE
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica =

16.489.
CA
TE
Tabla 33. Análisis de varianza del número de hojas cotiledonales en alfalfa

IO

BL
ANOVA
BI
HOJAS COTILEDONALES
Suma de Media
Entre grupos 82.000 7 11.714 13.388 .001
Total 89.000 15
143
Tabla 34. Prueba de DUNCAN del número de hojas cotiledonales en alfalfa

HOJAS COTILEDONALES
Duncana
DO
CEPA N c b a
CONTROL 2 3.50
RA
CEPA21 2 3.50
CEPA35 2 6.00
SG
CEPA24 2 6.00
CEPA26 2 8.00 8.00
CEPA29 2 PO 10.00
Sig. 1.000 .080 .080
DE
homogéneos.
CA
TE
IO

BL
ANOVA
TAM.RAIZ
BI
Suma de Media
Entre grupos 290.241 6 48.374 2.260 .050
Dentro de
1198.534 56 21.402
grupos
Total 1488.776 62
144
Tabla 36. Prueba de DUNCAN del tamaño radicular de las plántulas de alfalfa
TAMAÑO RADICULAR
Duncana,b
CEPAS N c b a
DO
CONTROL 10 9.333
CEPA26 10 11.820 11.820 11.820
CEPA21 10 13.100 13.100 13.100
RA
CEPA29 10 13.844 13.844 13.844
CEPA24 10 14.930 14.930
SG
CEPA35 10 15.825
Sig. PO .070 .082 .108
homogéneos.
DE

CA
TE

IO
ANOVA
BL
LONG.TALLO
BI
Suma de Media
Entre grupos 23.922 6 3.987 1.897 .097
Dentro de
117.707 56 2.102
grupos
Total 141.629 62
145
Tabla 38. Prueba de DUNCAN del tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa
LONG.TALLO
Duncana,b
CEPAS N b a
CEPA24 10 4.590
DO
CONTROL 10 4.611
CEPA29 10 4.900 4.900
RA
CEPA35 10 5.413 5.413
CEPA26 10 5.910 5.910
SG
CEPA21 10 6.322
Sig. .097 .068
PO
homogéneos.
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica =
DE
8.936.
CA
Tabla 39. Análisis de varianza del número de hojas verdaderas por plántulas de
TE
días.
IO
ANOVA
HOJAS.VERD
BL
Suma de Media
BI

Entre grupos 2.231 6 .372 1.230 .306
Dentro de
16.327 54 .302
grupos
Total 18.557 60
146
Tabla 40. Prueba de DUNCAN del número de hojas verdaderas por plántulas
de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de
30 días.
HOJAS.VERD
Duncana,b
DO
CEPAS N b a
RA
CONTROL 10 3.222
CEPA29 10 3.500 3.500
SG
CEPA35 10 3.571 3.571
CEPA21 10 3.667 3.667
CEPA24 10
PO 3.727 3.727
CEPA26 10 3.875
Sig. .101 .225
DE

CA
TE
IO
BL
BI
147
Secuencia 1: gen 16s rRNA de Yokenella sp. Cepa 21
GCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTA
GCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT
GTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTA
ATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGC
CATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCAC
DO
CTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA
CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTT
RA
CGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATACGGTTAATAACC
GTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAG
SG
CAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGT
AAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCA
ACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGACAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGG PO
TAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCG
GTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGG
TGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATG
DE
TCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTT
AAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATT
CA
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG
CGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGAT
TGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTC
TE
GTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCT
TTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAA
IO
CTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGG
GCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGA
BL
GCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACT
CGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGG
BI
TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTG
GGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTT
TGTGATTCATGACTGGGGT
148
Secuencia 2: gen 16s rRNA de Bacillus subtilis Cepa 24
CAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGA
TGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG
TAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG
GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTAC
CACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCT
DO
CACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG
GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT
CCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGT
RA
TTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAAT
AGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG
SG
CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGG
GCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGG
CTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGG PO
AGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAC
ACCAGTGGCGAAGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA
GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG
DE
ATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACG
CATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGG
CA
AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC
AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGAT
AGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA
TE
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG
ATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGAC
IO
AAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACC
TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCG
BL
AGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCA
ACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG
BI
CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA
GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCG
AAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGA
149
Secuencia 3: gen 16s rRNA de Paenibacillus sp. Cepa 26
GCGGCTGTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCTGGGGCTCAACCCNGGNGTGCG
CACTGGAAACTGGGCANCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACG
TGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG
ACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC
DO
AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTT
AGGGGTTTCNATACCCTTGGTGCCNAAGTTAACACATTAAGCATTCCGC
CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACC
RA
CGCACAAGCCGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTT
ACCAGGGCTTGACATCCCCCTGACCGGCCCAGAGATGTGCCTTTCCTTCG
GGACAGGGGAGACCGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG
SG
ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACTTTAGTTGCCAGC
AAGTAAGGTTGGGCACTCTAGAGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG
GTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACCACGTA
PO
CTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAACGAGCGATCTGGAGCGAATCC
TATAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAGTC
GGAATTGCTAGTAATCGCGGATCACATGCCGCGGTGAATACGTTCCGGGT
DE
CTTGTACACCCGCCCGTCACCCACGAGAGTTTCAACCCCGAAGTCGGTGA
GGAACC
CA
TE
IO
BL
BI
150
Secuencia 4: gen 16s rRNA de Serratia liquefaciens Cepa 29
CTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCG
GTAGCACAGGGAGCTTGCTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTA
TGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCT
AATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATG
CCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCA
CCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
DO
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCT
TCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGGTTCAGTGTTAATAGC
ACTGTTCATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCA
RA
GCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG
TAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTT
AACGTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGG
SG
GTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACC
GGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAC
GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGAT
PO
GTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGT
TAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAAT
TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAAC
DE
GCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTCGCTAGAGATAGC
TTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCT
CGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCC
CA
TTTGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATA
AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTA
GGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGAACTCGCGA
TE
GAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAA
CTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTAC
GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGGA
IO
GTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCA
CTTTGTGATTCATGACTGGGGT
BL
BI
151
Secuencia 5: gen 16s rRNA de Bacillus subtilis Cepa 35
GGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGA
CAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACG
TGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAAT
ACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGG
CTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC
DO
GGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCC
ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA
TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA
RA
AGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTC
GAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA
SG
CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA
TTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCC
CCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAA PO
GAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG
GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAG
CGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT
DE
AAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGC
TAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTC
CA
AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC
GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTA
GAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGT
TE
CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC
CCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCG
IO
GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA
TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAA
BL
CCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGT
CTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCA
BI
TGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA
CGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGC
CGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAA
152

Vega Portalatino Edwin Jorge

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Vega Portalatino Edwin Jorge

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

AUTOR : Br. EDWIN JORGE VEGA PORTALATINO

ASESORA: Dra. CARMEN DEL ROSARIO TAMARIZ ANGELES

Dra. Bertha Soriano Bernilla

Dra. Carmen Del Rosario Tamariz Angeles

A Dios por ser mi creador, el motor de

brindado, por guiar mi camino y estar

A Benjamín, mi padre, porque desde

pequeño ha sido para mí un gran

por ser ejemplo de perseverancia y

Gracias a ustedes por guiar mi vida

con energía, esto ha hecho que sea

Infinitas gracias a Dios, mi fortaleza y soporte, por permitirme concluir este

A mi colega Dr. Olivera Gonzales Percy Eduardo por apoyarme durante la

A la Ing. Rosales Cuentas Miriam Marleni, por su inmensa colaboración en todo

el proceso de la ejecución de mi tesis y siempre estar alentándome día a día.

Al laboratorio de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional

A todos muchas gracias.

DEDICATORIA ............................................................................................... III

INDICE DE FIGURAS ..................................................................................... XIV

Objetivo general .................................................................................. 19

Objetivo específico .............................................................................. 19

2.1. Objeto de estudio ......................................................................... 20

2.2. Población y muestra..................................................................... 20

2.4. Instrumentación ............................................................................ 21

2.5. Métodos y Técnicas...................................................................... 22

a. Lugar de toma de muestra ........................................................ 22

b. Lugar de Procesamiento de muestras y trabajo laboratorio ...... 23

c. Aislamiento de los microorganismos endofíticos ....................... 23

d. Pruebas de promoción de crecimiento a partir de las bacterias

endofíticas aisladas .................................................................. 25

Producción de Ácido Indol Acético............................................ 25

Efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum ......................... 26

Solubilización de fosfatos ......................................................... 28

Actividad celulolítica .................................................................. 29

semillas de Medicago sativa “alfalfa” ......................................

Preparación de suspensiones bacterianas ............................... 30

Desinfección de las semillas de alfalfa ..................................... 30

Inoculación de las semillas de alfalfa ........................................ 31

f. Análisis de resultados ............................................................. 32

g. Identificación Molecular de la cepa con mejores resultados 33

3.1. Aislamiento de bacterias endofíticas .............................................. 34

3.2. Producción de Ácido Indol Acético a 24 horas ............................... 34

3.3. Producción de Ácido Indol Acético a 48 horas ............................... 36

3.4. Efecto Antagónico de las cepas bacterianas endofíticas aisladas sobre

Fusarium oxysporum a los 6 días ................................................. 38

3.5. Solubilización de fosfatos de las cepas bacterianas endofíticas aisladas

a los 7 días .................................................................................... 41

3.6. Evaluación de Sideróforos de las cepas bacterianas endofíticas

aisladas a los 7 días ...................................................................... 43

3.7. Evaluación de la Actividad Celulolítica de las cepas bacterianas

endofíticas aisladas a 48 horas ..................................................... 46

3.8. Evaluación de Actividad Proteolítica de las cepas bacterianas

3.9. Selección de las cepas promotoras de crecimiento para la evaluación

3.11. Evaluación del Tamaño Radicular de las Semillas de Alfalfa

Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de

con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días 59

3.13. Evaluación del Número de Hojas Cotiledonales de las Semillas de

Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas

3.14. Evaluación del Tamaño Radicular de las Semillas de Alfalfa

Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de

con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días 65

3.16. Evaluación del Número de Hojas Cotiledonales de las Semillas de