12/4/2019 Protocolo de validación de métodos analíticos para la cuantificación de fármacos

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Protocolo de validación de métodos analíticos para la
cuantificación de fármacos Google Scholar H5M5 (2017)

Beatriz Castillo Aguilar1 y Rolando González Hernández1 Articulo

1 Licenciado(a) en Química. Aspirante a Investigador(a). Articulo en XML

Referencias del artículo

RESUMEN
Como citar este artículo
Se presenta un resumen de las consideraciones generales para la
confección del protocolo de validación de métodos analíticos utilizados en SciELO Analytics
la determinación cuantitativa de fármacos en forma de materia prima o
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en formulaciones y en estudios de estabilidad. Se describe
detalladamente el proceso de validación que incluye los requisitos Indicadores
exigidos para la utilización de las materias primas, materiales de
referencia, equipamiento, personal y determinación de los parámetros de Links relacionados
linealidad, precisión, exactitud y selectividad (con el procesamiento Compartir
estadístico de los resultados experimentales y criterios de aceptación), así
como la presentación de los resultados en el informe final de la Otros
validación.
Otros
Palabras clave: QUIMICA FARMACEUTICA; ESTABILIDAD DE
MEDICAMENTOS; QUIMICA ANALITICA; TECNOLOGIA FARMACEUTICA. Permalink

INTRODUCCION
Para el desarrollo químico-farmacéutico de un nuevo medicamento es imprescindible la utilización de un
método analítico que permita cuantificar el producto mayoritario en forma de materia prima o como
ingrediente activo de una formulación. Para asegurar confiabilidad, los métodos analíticos se someten a un
proceso de validación.1 Mediante un proceso de validación, ya sea de carácter prospectivo, retrospectivo o de
revalidación, se comprueba si el método es lo suficientemente confiable y si los resultados previstos se
obtienen dentro de las condiciones prefijadas.1,2 La validación de los métodos analíticos se fundamenta en la
determinación de diversos parámetros, que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan.2,3

Para el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio la validación es un requisito imprescindible que está
establecido por agencias regulatorias4,5 y por comisiones de Farmacopeas2,6 para el registro de nuevos
medicamentos. En Cuba el Centro Estatal de Normalización en coordinación con el Ministerio de Salud Pública
(MINSAP) establece una norma7 para el aseguramiento de ciertos niveles de calidad de los productos
farmacéuticos.

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A partir del criterio de que no existe un modelo único para validar y que los parámetros a evaluar cambian de
acuerdo con los requisitos legales de diferentes organizaciones,4,5 el presente trabajo ofrece una guía de
validación para los métodos analíticos que se utilicen en la cuantificación de fármacos como materia prima, como
ingrediente activo de una formulación y en estudios de estabilidad.

CATEGORIA DEL METODO

Según la USP XXII2 los métodos analíticos se clasifican en varias categorías para su validación. Los métodos
que son objeto de estudio en el presente trabajo pertenecen a la categoría I y se clasifican como "métodos
cuantitativos para la determinación del principio activo como materia prima o en formulaciones
farmacéuticas". Los parámetros de validación que se deben considerar varían según los requisitos legales
exigidos por distintas organizaciones. Según la literatura consultada,2,5 para este tipo de métodos deben
evaluarse la linealidad, la sensibilidad, la exactitud, la precisión y la selectividad.

PROCEDIMIENTO DE VALIDACION

PROTOCOLO8
Consiste en un plan experimental que debe contener las siguientes especificaciones:

1. Control de materias primas. Se refiere al control de las materias primas procedentes de casas comerciales
reconocidas que se utilicen en el proceso de validación. Deberán aparecer de forma detallada las especificaciones
de la muestra de ensayo, la preparación y estabilidad de las disoluciones, diluciones, pH y temperatura.

2. Material de referencia. Se utilizarán para la calibración del sistema de medición (por ejemplo disoluciones
tampones para la calibración de potenciómetros o pHmetros) o como patrón de comparación en las
determinaciones del analito. Durante la validación se utilizarán materiales de referencia secundarios o de trabajo9
contrastados contra un material de referencia primario. En caso de no disponer de material de referencia
primario, Rampazoo3 propone la caracterización (mediante métodos especiales que aseguren la evaluación
correcta de los niveles de pureza requeridos) de una parte de un lote industrial para emplearlo como patrón de
trabajo en determinaciones cuantitativas. Las características del material de referencia que se utilizará en la
validación aparecerán como anexo en el protocolo de validación.

3. Verificación, calibración y control del equipamiento. En las Farmacopeas2,10,11 aparecen reportados los
métodos para realizar la calibración y/o control de espectrofotómetros, pHmetros, etcétera, pero no se incluyen
los métodos para equipos de tecnología avanzada (como sistemas de adquisición de datos, densitómetros,
detectores cromatográficos, etcétera). En la actualidad la mayoría de los productores desarrollan la validación de
los equipos analíticos para satisfacer los requisitos internacionales que permitan su utilización en el control de
calidad en diferentes industrias incluyendo la industria farmacéutica y aun cuando en los manuales del usuario
aparezcan especificaciones de precisión y exactitud del equipo, por lo general el usuario debe desarrollar su
propio procedimiento para la comprobación del buen funcionamiento del instrumento o seguir las
recomendaciones del fabricante. Cuando el equipo está verificado se realiza un simple control de rutina. DeSain8
recomienda un procedimiento especial para las columnas que se utilizan frecuentemente en muestras diferentes
para análisis por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR).

4. Entrenamiento del personal. El personal encargado de realizar los ensayos analíticos estará entrenando
específicamente en este tipo de trabajo y su entrenamiento estará rigurosamente documentado.

5. Procedimiento normalizado de operación del método. Refleja el procedimiento exacto de ejecución del método
analítico y estará anexado al protocolo de validación.

VALIDACION
1. Linealidad. Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales a la
concentración o cantidad del analito en un rango definido.2 Se determina mediante el tratamiento matemático
de los resultados obtenidos en el análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La selección
del rango y del número de puntos experimentales está estrictamente relacionado con la aplicación del
método.

Así, Comellas12 recomienda en la validación de métodos por CLAR para la cuantificación de un principio activo en
forma de materia prima de 80,0 hasta 120,0 % del valor teórico y de 3 a 5 puntos experimentales, mientras que

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para su aplicación en la determinación del analito como ingrediente activo de una formulación recomienda un
ran-go desde 50,0 hasta 150,0 % y con 5 ó 7 puntos experimentales.

Rampazoo3 especifica que cuando el método se aplica para determinaciones del analito en estudios de estabilidad
se utilizará un rango más amplio desde 0,0 hasta 120,0 %. El estudio de linealidad se realiza durante 3 ó 4
días.13,14 La curva de regresión se determina sobre los puntos individuales sin promediar por el método de los
mínimos cuadrados. En el eje de las "x" aparecerá la cantidad o la concentración del analito y en el eje "y", la
respuesta analítica (absorbancia para métodos espectrofotométricos, área o altura para métodos
cromatográficos, cantidad de agente valorante gastado en el caso de métodos titrimétricos, etcétera). Los
estimadores de regresión para un nivel de significación (a ) dado (en la mayoría de trabajos químicos a = 0,05 [5
%])15 son:

a) Coeficiente de correlación (r). Muchos autores plantean9,13,14 que para que el método se considere lineal, el
coeficiente de correlación debe ser mayor que 0,999. Sin embargo, Quattrocchi et al.16 consideran que la mejor
forma de indicar la linealidad del método estudiado será realizar una prueba estadística de t (t de Student), en la
cual se calculará la correlación lineal significativa (tr) a partir de la hipótesis nula de no correlación entre las
magnitudes estudiadas ("x" y "y"). Para ello se empleará la ecuación siguiente:

?r?Ö (n - 2) tr = ------------ (1) Ö (1 - r2)

donde: r es el coeficiente de correlación, r2 es el coeficiente de determinación y n es el número de réplicas. El

valor de tr obtenido se compara con el valor tabulado de t para el nivel de significación utilizado y con n-2
grados de libertad (donde n corresponde al número total de determinaciones de "y").

b) Pendiente (conocida también como coeficiente de regresión). Indica la sensibilidad de calibración o del método
y se expresa en unidades de respuesta sobre unidades de concentración o cantidad del analito. La sensibilidad
analítica relaciona la aleatoriedad de la respuesta con la aleatoriedad debida a la variación de la concentración, es
inversamente proporcional a la capacidad de detectar pequeñas diferencias en la concentración del analito, y se
obtiene dividiendo la pendiente de la curva de calibración por la desviación estándar de las respuestas en cada
punto o concentración. Se considera que a mayor pendiente, mayor sensibilidad y que mientras más pequeño sea
el coeficiente de variación de la pendiente mayor será la linealidad (coeficientes de variación de la pendiente
mayores que el 5,0 % indican falta de linealidad).

c) Intercepto. Es el estimador que se relaciona con la presencia de interferencias o errores sistemáticos. El

intervalo de confianza del intercepto debe incluir al cero para cumplir con el requisito de proporcionalidad (como
se exige para el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en los métodos espectrofotométricos). Según Camacho
et al.13 se determinará la prueba de proporcionalidad mediante una prueba t considerando como hipótesis nula
que el intercepto tiene que ser cero. El valor de t se calculará mediante la siguiente ecuación:
a texp = -- (2) Sa

donde: a es el valor del intercepto, Sa es la desviación estándar del intercepto y deberá ser menor que el
valor tabulado de t para el nivel de significación dado y n-2 grados de libertad.

2. Precisión. Refleja la medida en que los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan
sobre una muestra homogénea son semejantes entre sí.1 Aunque la USP XXII2 expresa que la precisión es la
expresión del grado de la reproducibilidad, Calpena1 incluye dentro de este acápite la repetibilidad, la
reproducibilidad y la robustez del método analítico, mientras que la Norma Británica17 incluye sólo la repetibilidad
y la reproducibilidad.

a) Repetibilidad. Refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando
la misma muestra, analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos
y durante una misma sesión de trabajo en un período corto.1

El parámetro estadístico que caracteriza a este estudio es la desviación estándar17 o preferiblemente el

coeficiente de variación (desviación estándar relativa).3 Este parámetro permite evaluar la incertidumbre en la
estimación de la media, es decir, el error aleatorio que se corresponde con la dispersión de los datos alrededor de
la media.

Según Hoffman F.-La Roche,18 este parámetro se determina mediante uno de los siguientes métodos:

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-Realizando varias determinaciones a una muestra homogénea.

- Realizando varias determinaciones a muestras de cantidades o concentraciones diferentes. Se
selecciona la cantidad o concentración inferior, media y superior del rango lineal definido. En este caso
se recomienda realizar una prueba g (Prueba de Cochran) de homogeneidad de varianza y si se
demuestra que las varianzas son homogéneas, entonces se puede afirmar que el factor cantidad o
concentración de la muestra no influye en la determinación. Este método generalmente se utiliza cuando
se cuenta con poca cantidad de muestra.

Cuando el número de muestras es pequeño (menor que 30), el intervalo de confianza del valor de la media
(rango en el cual se incluye el valor real con la probabilidad indicada) se calcula mediante la distribución t de
Student.15

Un aspecto importante será seleccionar la cantidad o concentración de muestra que se analiza. Kolthoff19 plantea
que el error en el porcentaje del componente hallado no deberá ser mayor que un valor aproximado. Según la
teoría de Hortwitz,20 el coeficiente de variación disminuye con la disminución de la concentración en que se
encuentre el analito en la muestra. Así:

CV (%) = 2 (1- 0,5 log C) (3)

donde: C es la concentración de la muestra expresada como potencia de 10 (1 ppb = 10-9, 1 ppm = 10-6, 1 % =
=10-2, 10 % = 10-1, etc.). De acuerdo a las teorías de Kolthoff y Hortwitz se reportan tablas que establecen el
coeficiente de variación máximo aceptable de un método analítico en función del por ciento del analito en la
muestra (tabla).13

TABLA. Coeficientes de variación máximos (CVmáx) de aceptación en dependencia del por ciento del analito en la
muestra (% A), según las teorías de Kolthoff (I) y Hortwitz (II)

%A CVmáx (I), % CVmáx (II), %

100 0,1-0,3 2

50 0,3 2,2

10 1 2,8

1 2-5 4

0,1 5-10 5,7

0,01-0,001 10 8-11,3

0,0001 - 16
El coeficiente de variación máximo aceptable en función de los límites de aceptación y del número de réplicas
o el número necesario de repeticiones para un cierto nivel de aceptación también pueden calcularse a partir
de la ecuación siguiente:13

?x - 100?Ö n CV (%) = ------------ (4) t.01

donde: x es límite del nivel de aceptación superior o inferior (según USP XXII2 entre 98,0 y 102,0 % para
materias primas y según Comellas12 entre 95,0 y 105,0 % para formulaciones), n es el número de
repeticiones y t.01 es el valor tabulado de la t de Student para un nivel de confiabilidad menor que el 99 % e
infinitos grados de libertad (t.01 = 2,58).

Si se tiene duda acerca de la presencia de un dato erróneo, Rampazoo3 propone dos métodos para comprobarlo,
uno para cuando existan 10 determinaciones y otro para menos de 10.

Para los métodos cromatográficos, Rampazoo3 recomienda estimar también la repetibilidad instrumental, la cual
se calcula a partir de una serie de inyecciones de la misma muestra. Estos valores ofrecen información acerca de
la resolución límite del equipo. Según el criterio de Martin-Smith y Rudd,9 considerando que la mayoría de las
formulaciones farmacéuticas contienen entre 1 y 10-3 de principio activo, el coeficiente de variación en el estudio
de repetibilidad para los resultados obtenidos mediante un método por CLAR debe ser menor que el 1,0 %.

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b) Reproducibilidad. Es la medida de la precisión de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra
homogénea, pero ejecutados por diferentes analistas en días diferentes1 y se expresa con los mismos parámetros
matemáticos que la repetibilidad. El coeficiente de variación en el estudio de la reproducibilidad debe ser igual o
mayor que el obtenido en el estudio de repetibilidad para la misma cantidad o concentración debido a la mayor
fuente de error que existe en la reproducibilidad. De un estudio de reproducibilidad interlaboratorios, Hortwitz20
estableció que el coeficiente de los coeficientes de variación del estudio de repetibilidad y reproducibilidad debe
tener un valor comprendido entre 1,5 y 2,3, relacionando valores mayores que 2,3 a un método muy personal y
valores menores que 1,5 a una pobre repetibilidad de algún analista. DeSain, Martin-Smith y Rudd8,9 plantean
que para la mayoría de los métodos analíticos el coeficiente de variación de la reproducibilidad debe ser menor
que un 2,0 %.

c) Robustez (tolerancia). Es el grado de reproducibilidad de los resultados obtenidos mediante la ejecución del
método sobre una misma muestra variando algunas condiciones operacionales como, por ejemplo, diferentes
laboratorios, reactivos, analistas, equipos, temperaturas de ensayo, etcétera.2 Se determina como una función de
las variables seleccionadas en la ejecución y los resultados se comparan con los resultados del estudio de
reproducibilidad del método para obtener una medida de la tolerancia del método analítico. Según Hoffman F.-La
Roche,18 el resultado más real es el que se obtiene en las pruebas interlaboratorios, sin embargo, éstos resultan
muy costosos y consumen una gran cantidad de tiempo. Para la determinación de este parámetro en los métodos
por CLAR, Martin-Smith y Rudd9 proponen cambiar la composición de la fase móvil adicionando disoluciones
tampones, variar el flujo, cambiar la columna, manteniendo la temperatura y utilizando el modo isocrático.

3. Exactitud. Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al valor
verdadero.1,2 A diferencia de la precisión, que refleja el error aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o
la tendencia a él.7 Cuando existen interferencias en el método por falta de selectividad (desviación por exceso en
los resultados), o cuando se trata de métodos analíticos muy laboriosos, con varias etapas, como extracciones,
purificaciones, etcétera (desviación por defecto en los resultados), el método se considera no exacto o biasado.1
Para asegurar una buena exactitud, según Martin-Smith y Rudd,9 es necesario eliminar los errores que no están
sujetos a tratamiento estadístico (calibración o control incorrectos de equipos), los errores inherentes a blancos
(errores constantes) y los que dependen de la cantidad del analito presente (errores proporcionales). Ellos opinan
que la mejor manera de identificar estos errores será realizando una prueba interlaboratorio.

Generalmente se utilizan los datos experimentales de la linealidad correspondientes a la concentración inferior,

media y superior del intervalo lineal establecido. Hoffman F.-La Roche18 presenta 2 métodos para analizar los
resultados:

a) Comparar el valor medio obtenido por el método propuesto para la determinación del analito contra el valor
medio obtenido por un método ya validado o el valor teórico (100 %). Para ello se realizará una prueba t de
acuerdo con la siguiente ecuación:

?m-_?Ö n ?100-R?Ö n texp = -------- = ---------- (5) S CV

donde: texp es el valor experimental de t, m es el valor real, _ es el valor medio, n es el número de

determinaciones, S es la desviación estándar, R es el por ciento de recobrado y CV el coeficiente de variación.

El valor de texp debe ser menor que el valor tabulado de t para poder afirmar que ambos valores no difieren
significativamente para el nivel de significación seleccionado.

b) Analizar cantidades conocidas del analito (para materias primas) o cantidades conocidas del analito añadidas a
sistemas placebo (para formulaciones) para calcular el recobrado por comparación de las cantidades teóricas con
los valores determinados. Para ello se grafica la masa encontrada en el eje "x" contra la masa agregada en el "y".
La ecuación de la línea de regresión y sus estimadores se determina por el método de los mínimos cuadrados. El
coeficiente de correlación debe ser mayor que 0,997.8 Para descartar cualquier error de tendencia constante, el
intervalo de confianza del intercepto debe incluir al cero y para descartar cualquier error proporcional el intervalo
de confianza de la pendiente debe incluir el 1.16,18 Según Camacho et al.13 si se observa un error proporcional el
método es válido siempre que se utilice la curva de calibración previamente calculada.

4. Selectividad (especificidad). Se define como la capacidad de un método analítico para medir exacta y
específicamente el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación o excipientes que pueden
estar presentes en la muestra.1 Se expresa como el grado de inexactitud del método.2 La evaluación de este
parámetro es especialmente importante en el caso de los métodos analíticos diseñados para la cuantificación del
analito en formulaciones y en estudios de estabilidad.3

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Aunque la especificidad y la selectividad se consideran términos equivalente,1-3 algunos autores8 los diferencian,
considerando la selectividad como la capacidad de detectar simultánea o separadamente sustancias químicas
diferentes presentes en una misma muestra y a la especificidad como la capacidad de detectar el analito sin
interferencias de otro compuesto. La selectividad se determina comparando los resultados del análisis de
muestras con los resultados del análisis de las muestras en presencia de productos relacionados.1 Rampazoo3
recomienda el análisis de muestras del analito sometidas a condiciones de degradación artificial hasta el 20 % de
degradación, lo cual constituye un criterio de especial interés cuando se desconocen los productos de
degradación.

Según Martin-Smith y Rudd9 los métodos cromatográficos se consideran selectivos, si se demuestra que los picos
(en la CLAR y en cromatografía gaseosa) o que las manchas (en la cromatografía de capa fina), son homogéneas
y corresponden a un solo compuesto, mediante una buena separación de analito y productos relacionados y
utilizando técnicas de detección como UV con arreglo de diodos, espectrometría de masas, etcétera.

Los métodos espectroscópicos (UV, IR, colorimetría, etcétera) frecuentemente adolecen de selectividad.1 Sin
embargo, Murrillo et al.22 han demostrado que la utilización de la espectrofotometría UV de derivadas incrementa
consideradamente la selectividad del método, permitiendo la determinación cuantitativa simultánea de varios
productos que posean un máximo de absorción en la misma zona espectral.

INFORME FINAL
Incluirá las referencias de la calibración y verificación de los equipos utilizados, los resultados primarios y
estadísticos de cada parámetro, la discusión de los resultados y las conclusiones de la validación.

Concluido el procedimiento de validación el personal de aseguramiento de calidad emitirá un certificado de

validación, que unido al protocolo y el informe final se archivarán durante el tiempo de vida del producto.

Este protocolo ha sido verificado en la práctica y los resultados que se han obtenido aseguran una alta
confiabilidad en 5 métodos analíticos propuestos para control de calidad, un estudio de estabilidad de materia
prima y un ensayo de formulación.

SUMMARY
A summary of the general considerations fot the formulation of a validation protocol of the analytical methods
used in drug quantitative determination in a raw material form, or in formulations and firmness studies. The
validation process is fully described; it includes the necessary requirements for the usage of raw materials,
reference materials, supplying, personnel, and determination of linearity, preciseness, exactness, and
selectiveness (with the statistical processing of experimental results, and acceptance criteria), as well as the
presentation of outcomes in the validation final report.

Key words: CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; DRUG STABILITY; CHEMISTRY, ANALYTICAL; TECHNOLOGY,

PHARMACEUTICAL.

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Recibido: 26 de mayo de 1995. Aprobado: 13 de diciembre de 1995.

Lic. Beatriz Castillo Aguilar. Centro de Química Farmacéutica. Ave 200 y 21, Atabey, municipio Playa, Ciudad de
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