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Guia 2019.microbiología General Farmacia PDF
Guia 2019.microbiología General Farmacia PDF
BÁSICA Y APLICADA
MICROBIOLOGÍA GENERAL
- GUÍA DE PRÁCTICAS -
ELABORADO POR:
2019
INDICE
4 PRESENTACIÓN
74 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75 ANEXO: BIOSEGURIDAD
PRESENTACIÓN
La Microbiología, es una ciencia relativamente nueva con respecto a otras ramas de la
Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie Van
Leewenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis
Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos
como actores de una gran diversidad de procesos.
Esta guía está dirigida a estudiantes que iniciarán sus experiencia en el manejo de los
microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio de la
misma una serie de recomendaciones necesarias con las reglas generales del laboratorio
y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule
en forma adecuada a los microorganismos y garantizar su seguridad como la de sus
compañeros.
En cada práctica se presenta una introducción teórica para facilitar la comprensión del
tema, seguida de los objetivos, materiales necesarios y procedimientos en forma de
instrucciones que se complementan con algunas figuras y esquemas.
Los Autores
INSTRUCCIONES GENERALES
El alumno deberá presentarse a las clases prácticas:
Puntualmente.
Con mandil blanco y limpio
Con malla y mascarilla si así lo requiere la práctica
Si desea usar guantes, deberá luego descartarlos apropiadamente o de lo contrario deberán lavarse
cuando aún están en las manos y luego desinfectarlos antes del re-uso.
Colocar las pipetas y portaobjetos usados en un recipiente con desinfectante. destinado para tal fin.
El material ya utilizado se debe colocar en recipientes especiales rotulados para evitar confusión.
Si se derrama o quiebra un recipiente con material contaminado no tocar nada y avisarle al
responsable del laboratorio.
Está prohibido pipetear con la boca, aún así sea agua.
Cada estudiante antes de abandonar el aula de prácticas está obligado a despejar su mesa de trabajo
de todo material usado y sucio y lavarse las manos. Asegurarse de que todas las llaves de agua y de
gas así como los aparatos eléctricos estén apagados y/o desconectados.
Antes de guardar el microscopio, en las prácticas que requieran su uso, asegurarse que los lentes estén
limpios de aceite de inmersión.
PRÁCTICA: I
Autoclave: Aparato en el que se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullición del agua
por medio de un aumento de presión, funciona a 1,18 kg/cm2 por encima de la presión atmosférica. Al
mantener una temperatura de 121ºC por 15 minutos, se logra la destrucción de toda forma de vida, es
decir se logra la esterilización mediante el vapor de agua.
Fundamento: coagulación de proteínas estructurales y enzimas bacterianas cesando así su función
biológica.
Horno: Es utilizado en operaciones que requieren calor muy intenso, como la desecación y esterilización
de materiales mediante el calor seco, se realiza a una temperatura no menor de 170ºC por dos horas. Se
pueden esterilizar placas Petri; recipientes vacíos de vidrio, porcelana y metal, los recipientes salen secos
a diferencia de la autoclave. Fundamento: Oxidación de proteínas.
Estufa de Incubación: Es utilizada para lograr el crecimiento de los microorganismos en un tiempo más
corto, gracias a que la temperatura es de 37 ºC (temperatura óptima de crecimiento de bacterias).
También se tiene estufas a 42 ºC, 28 ºC, etc.; dependiendo de la temperatura óptima del microorganismo
que estemos utilizando.
Asa de Siembra: Un asa de siembra o asa bacteriológica es un instrumento de laboratorio tipo pinza que
consta de una base de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o
platino que termina en aro o en punta. Se emplea para arrastrar o transportar microorganismos de un
medio a otro para su adecuado desarrollo, así como para la realización del frotis bacteriano.
Placas Petri: La placa de Petri, es un recipiente circular de vidrio o de plástico, de diferentes tamaños (de
acuerdo a su uso). En microbiología, esta placa se utiliza principalmente para incorporar la muestra y/o
cepa objeto de estudio en algún medio de cultivo sólido apropiado. Después de la incubación se observará
si existe crecimiento buscando la presencia de “colonias” aisladas.
ESTERILIZACIÓN
Proceso por el cual se elimina todo agente microbiano en su forma vegetativa o esporulada.
La esterilización se puede conseguir por agentes físicos, químicos o mecánicos.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Realice el dibujo de la manera de envolver pipetas de vidrio.
Los medios de cultivo son soluciones acuosas de sustancias nutritivas orgánicas e inorgánicas y de
principios activos, que en condiciones adecuadas de temperatura, humedad, tensión de oxígeno, CO 2, pH,
potencial redox, favorecen el crecimiento de microorganismos para el estudio de sus propiedades
morfológicas y bioquímicas. Los medios de cultivo pueden contener sustratos nutritivos como fuente de
carbono, nitrógeno, y energía, factores de crecimiento, agente gelificante (agar), sustancias inhibidoras e
indicadores de pH.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias
necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios
desarrollados hasta ahora.
Todos los medios de cultivo deben cumplir los siguientes requisitos:
Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se
siembra.
Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.
Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayoría
de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua o la esterilización.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
B) Por su composición:
1.-Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de
microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las
concentraciones exactas de cada uno de ellos. Por ejemplo medios que tienen extracto de carne o
levadura.
2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos químicos
puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio definido que permita el
desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. coli, debería contener sales
inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl.
C) Por su utilización:
1.- Medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con
distintos requerimientos nutricionales.
2.- Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un agente
selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc.
3.- Medios diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir
de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen
de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, el Agar
Sangre es un medio nutritivo enriquecido y es a la vez un medio diferencial, ya que permite reconocer
aquellos microorganismos capaces de producir hemólisis.
OBJETIVO
Conocer y aprender la preparación de los diferentes medios de cultivo.
PROCEDIMIENTO
Medio sólido:
La preparación de un medio sólido se puede hacer de dos maneras: Preparar el caldo y añadir agar-agar al
15 g/L o bien utilizar un medio de cultivo sólido comercial.
Una vez pesado el medio de cultivo deshidratado para un volumen determinado de agua, se reconstituye
con agua destilada, dejamos hidratar el polvo y agitamos hasta disolver los componentes, calentando la
mezcla hasta ebullición. No olvidar regular el pH, de acuerdo a lo indicado en la fórmula o en el frasco de
medio de cultivo. El medio preparado se distribuye en tubos de vidrio o en frascos, luego se taponan estos
y se cubren con papel Kraft para llevar a esterilizar. La esterilización de los medios de cultivo se realiza
en autoclave a 121ºC, 15 libras de presión/pulg2 por 15 minutos.
Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser
inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición adopte la
forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra.
Si se desea preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz
o frasco y, una vez atemperado (45 – 50 °C), se verterá en placas vacías estériles en un ambiente aséptico,
como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar.
Medio semisólido:
Pesar el medio Infusión Cerebro-Corazón (BHI) y agar-agar a la concentración de 2,5 g/L, en cantidad
suficiente para el volumen deseado. Adicionar agua destilada, mezclar y calentar hasta disolver (a 100
ºC), medir el pH y repartir en tubos, acondicionar y autoclavar. Opcionalmente se puede usar el medio
MIO (Movilidad Indol Ornitina)
Caldo:
Pesar la cantidad suficiente del medio Caldo Tripticasa de Soya (TSB) para el volumen deseado,
adicionar agua destilada y disolver completamente, verificar el pH, repartir en tubos y autoclavar.
Para balancear el pH, se utiliza NaOH 0,1 N ó HCl 0,1 N.
☺Sabías que…
Si se han de incorporar al medio compuestos
termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se
esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio
de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una
vez que este se haya atemperado. En todos los casos se
han de seguir las instrucciones del fabricante.
La siembra de microorganismos consiste en poner en contacto los microorganismos (en cantidades muy
pequeñas) o la muestra conteniendo los microorganismos problemas, con un medio de cultivo estéril
fresco, para que en las condiciones de laboratorio (temperatura, humedad, etc.) se desarrollen y se
multipliquen “in-vitro” y se pueda aislar el microorganismo en cultivo puro para su estudio e
identificación; o cuando se tratan de microorganismos aislados, ponerlos en contacto con medio de
cultivo “fresco” y estéril para su conservación (“repicar un cultivo”).
☺Sabías que…
Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un mango que permite
manipularlas. El alambre puede ser de diferente material, (fierro níquel, nicromo,
platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,) depende de la necesidad.
Después de la siembra incubar los medios de cultivo en la estufa a la temperatura de 37 ºC para las
bacterias durante 18 – 24 horas y a 25 – 28 ºC para los hongos y levaduras durante 48 horas o más.
En medio sólido (agar inclinado) se observará el aspecto general del medio y la aparición de crecimiento
sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios
facultativos. Además, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a temperaturas
de 4ºC.
En el medio sólido, si es necesario con ayuda de una lupa, observar en la placa de Petri, las características
de las “colonias” aisladas:
OBJETIVO
Emplear las diferentes técnicas de cultivo de microorganismos, para favorecer su crecimiento.
MATERIALES
Asa de siembra
Mechero de Bunsen
Tubos de 13 x 100
Placa Petri.
Solución salina fisiológica (SSF)
MEDIOS
Caldo tripticasa de soya (TSB)
Agar tripticasa de soya (TSA)
Medio semisólido
CEPAS
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Bacillus cereus
PROCEDIMIENTO
Siembra en medio liquido
Siembra en medio semisólido
Siembra en medio sólido
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
TSA
TSB
Semisólido
TSA
TSB
Semisólido
TSA
PRÁCTICA: III
TINCIONES MICROBIANAS
Preparación del frotis bacteriano.
Coloración por tinción simple y tinción diferencial Gram.
Coloración de bacterias ácido resistentes.
Tinción de estructuras microbianas: cápsula, pared celular y esporas.
La mayoría de las bacterias son transparentes, por lo que resulta difícil su observación con el microscopio
óptico. El uso de colorantes nos permite aumentar artificialmente el contraste entre las células bacterianas
y el medio circundante.
Los colorantes nos permiten observar la morfología de los microorganismos, permitiendo distinguir los
diferentes tipos de célula, además de revelar la presencia de ciertas estructuras celulares como flagelos,
cápsulas, esporas, pared celular e inclusiones.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los
materiales celulares. Los colorantes pueden dividirse en tres grupos:
Ácidos o aniónicos: Colorantes de moléculas cargadas negativamente y por lo tanto se combina con
estructuras celulares cargadas positivamente, como las proteínas. Estos colorantes no tiñen a la célula
y se usan sobre todo para teñir el fondo de la lámina o para contraste. Dentro de estos colorantes
tenemos a la eosina, fucsina ácida, rojo congo, ácido pícrico y verde malaquita
Básicos o catiónicos: Son moléculas cargadas positivamente y se combinan con intensidad con los
constituyentes cargados negativamente, como los ácidos nucleicos, polisacáridos ácidos. Dentro de
estas sustancias tenemos al azul de metileno, safranina, fucsina básica, violeta de metilo, rojo neutro
y tionina.
Neutros: Como Giemsa, Wright y Leishman
☺Sabias que ….
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un
colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; él cual se combina con un constituyente celular y lo altera
de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Un mordiente habitual es el ácido tánìco.
Las tinciones simples son las que usan un solo colorante. Mientras que las tinciones diferenciales son
capaces de diferenciar estructuras o incluso microorganismos que poseen características distintas. En este
tipo de tinciones se requieren el empleo de más de un colorante. Las tinciones estructurales sirven para
identificar determinadas estructuras que pueden estar presentes en ciertos microorganismos. Con esta
técnica se evidencian cápsulas, endosporas, flagelos y pared celular.
En este tipo de coloración se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
tiñen con la misma tonalidad. Nos permite observar la morfología y tamaño de la célula bacteriana y
el tipo de agrupamiento.
Entre los colorantes usados están: fucsina básica, azul de metileno, safranina y cristal violeta, todas
en soluciones acuosas.
Esta coloración permite diferenciar los microorganismos Gram (+) y Gram (-). Consiste que el
preparado fijado por calor se trate en primer lugar con el cristal violeta, luego se agrega la solución
de lugol como solución mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se agrega un
colorante de contraste que puede ser fucsina o safranina.
Fundamento
☺Sabias que…
El paso crítico de esta técnica es la decoloración, ya que si se prolonga demasiado
resultarán decoloradas las bacterias incluso las Gram (+).
Además que las bacterias Gram (+) en fase estacionaria pueden aparecer como Gram (-)
debido a procesos de degradación y autólisis de su capa de peptidoglicano.
La mayoría de las células procariotas del dominio Bacteria se pueden clasificar en función del
resultado de la tinción Gram, como Gram(+) o Gram(-). Pero determinadas bacterias como las
Corineformes, Nocardia y en especial Mycobacterium, presentan una pared celular muy compleja,
con abundancia de lípidos. Estas bacterias no se tiñen con los colorantes normales, pero una vez que
se han teñido con fucsina (forzando mediante calentamiento de la preparación), tienen resistencia a
decolorarse por una mezcla de ácido clorhídrico al 3% en etanol de 96º. Por ello se denominan
bacterias ácido – alcohol resistentes.
Fundamento
La ácido-alcohol resistencia se correlaciona con el alto contenido en lípidos de la pared celular y con
la presencia de un tipo específico de ácidos grasos llamados ácidos micólicos. Los cuales confieren a
la célula una alta hidrofobicidad y la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después
de la tinción con colorantes básicos.
Para poner de manifiesto la acido-alcohol resistencia, la tinción de Ziehl Neelsen requiere el empleo
sucesivo de 3 soluciones:
Tras el tratamiento con fucsina y fenol las bacterias se tiñen de rosa-rojo. Pero al agregar el
decolorante, las bacterias ácido-alcohol resistentes no cambian de color mientras que el resto de
bacterias se decoloran y podrán tomar posteriormente el colorante de contraste. En consecuencia las
células de Mycobacterium quedarán teñidas y las bacterias ácido alcohol sensibles aparecerán de
color azul.
Procedimiento
El frotis se tiñe con Carbofucsina fecnicada aplicando calor suave hasta emitir vapores (evitando
que el frotis se seque por la evaporación del colorante) y luego lavar el exceso de colorante con
agua.
Decolorar con la solución acido - alcohol y lavar con agua.
Teñir durante 30-60 segundos con Azul de Metileno (otra alternativa es el verde de malaquita),
lavar y proceder a secar
Proceder a observar con el microscopio óptico con el objetivo de inmersión.
CÁPSULA
☺Sabias que…
a. La exposición previa a los anticuerpos específicos (reacción de Quellung) aumenta la refractividad e impide su retracción
lo cual favorece la tinción
b. El tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real por lo tanto no se debe utilizar para la
medición de microorganismos
c. Para distinguir bien la cápsula del resto de la célula se debe aumentar el contraste cerrando el diafragma del condensador.
En estas condiciones, la cápsula aparecerá como un halo transparente alrededor de la célula, que se verá de color
grisáceo.
PARED CELULAR
El espesor de la pared celular en las bacterias Gram positivas oscila entre 0.150um y 0.50um y hasta
0.8um en algunas cepas de Lactobacillus acidophilus. En las bacterias Gram negativas la pared
celular (membrana externa de la envoltura celular) mide aprox 0.015.um de espesor. La pared celular
se colorea con colorantes derivados del trifenilmetano en solución de pH 7.0 y por lo general se
utilizan mordientes (ácido tánico, ácido fosfomolíbdico). La pared celular se tiñe de color azul sobre
un fondo amarillento.
ESPORAS
Las bacterias que forman esporas pertenecen principalmente a los géneros Streptomyces, Clostridium
y Bacillus. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma
vegetativa. Algunas de las bacterias productoras de esporas son patógenas para el hombre, por lo que
su estudio y observación son de enorme interés.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, mientras que
las formas vegetativas si lo harán, y quedarán teñidas con el segundo colorante.
Procedimiento
Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 ml de SSF
Añadir 1 ml de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la
mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
Con la ayuda del asa de siembra colocar la muestra en un portaobjetos. Añadir una solución
acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de
óvalo.
Dejar secar y observar con objetivo de inmersión
Procedimiento
Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol, encendiendo y
dejando apagar.
Cubrir el preparado con solución de ácido crómico al 5% durante 5 minutos para sensibilizar.
Lavar y cubrir luego con solución de fucsina fenicada en caliente durante 10 minutos (calentar
pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisión de vapores y volver a calentar
ocasionalmente para mantener la temperatura).
Lavar con agua corriente.
Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la decoloración
con alcohol.
Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.
Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
PARTE EXPERIMENTAL
1. TINCIÓN SIMPLE
Objetivos:
Observar microorganismos al microscopio.
Estudiar su morfología (coco, bacilo) y agrupación (racimos, cadenas, etc).
Materiales:
Cultivos bacterianos en medios líquidos y sólidos.
Asa de siembra.
Láminas portaobjetos limpias y sin grasa.
Microscopio óptico con lente de inmersión.
Colorantes: azul de metileno o safranina
Procedimiento:
1. Se coloca el frotis bacteriano sobre un puente de coloración, y agregamos una gota de azul de
metileno o safranina.
2. Se deja por un minuto y luego se procede a lavar el exceso de colorante con la piceta o con agua
de caño (chorro fino).
3. Se seca la lámina cerca (no directa) de la llama del mechero o a temperatura ambiente.
4. Agregar aceite de inmersión y proceder a observar en el microscopio con el objetivo 100X.
Materiales:
Cultivos bacterianos en medios líquidos y sólidos.
Asa de siembra
Colorantes:
Solución de Cristal violeta.
Solución de Lugol.
Solución de Alcohol – acetona.
Solución de Safranina
Láminas portaobjetos limpios y sin grasa.
Microscopio óptico con lente de inmersión
Procedimiento
1. Sobre el frotis bacteriano se agrega la solución de cristal violeta, y se deja fijar a temperatura
ambiente por 1min o con ayuda de calor, luego se lleva a un puente de coloración y se lava el
exceso de colorante con agua destilada.
2. Agregar la solución de lugol. Dejar por 1min y proceder a lavar el exceso.
3. Luego se procede a decolorar con I-II gotas de alcohol-acetona, e inmediatamente se lava.
4. Agregar I o II gotas de safranina por 30 segundos, y luego lavar
5. Se seca la lámina cerca de la llama del mechero o a temperatura ambiente.
6. Agregar aceite de inmersión y proceder a observar en el microscopio con el objetivo 100X..
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Anotar y dibujar las estructuras que observe en microscopio óptico tanto en la tinción simple como la
tinción Gram.
PRÁCTICA: IV
RECUENTO MICROBIANO
Preparación y dilución de las muestras.
Recuento por métodos de incorporación y superficie.
Los métodos utilizados para el aislamiento y recuento de los microorganismos presentes en diferentes
muestras como alimentos, requieren el tratamiento previo de la muestra para liberar en un medio fluido
aquellos microorganismos que pueden estar aprisionados en el interior de la muestra o e las superficies
secas o gelatinosas. El procedimiento muchas veces requiere de ciertos aparatos electrónicos, con la
precaución de la formación de aerosoles, sobre todo cuando se sospecha la presencia de gérmenes
patógenos, pero otras veces, para una adecuada homogenización, basta con una agitación enérgica. De
esta forma, se prepara una suspensión homogénea de muestra y microorganismos que permite la
preparación de las oportunas diluciones que posteriormente podrán ser utilizadas en diversos métodos de
recuento o enumeración.
Los dos métodos más utilizados para el recuento de la flora aerobia mesófila son:
a) El método de recuento estándar en placa, también denominado método de recuento en placa de
microorganismos aerobios o método de recuento en placa por incorporación o recuento en placa
por siembra en todo el medio.
b) El método de recuento en placa de siembra por extensión en superficie.
Ó 1 ml de
muestra en 9ml
de diluyente
ml de
Preparar la muestra con el diluyente apropiado y proceder por cualquiera de los dos métodos para el
respectivo recuento.
MATERIALES:
Tubos con 9ml de diluyente
Frasco con 90 ml de diluyente
Pipetas de 1ml estériles
Balanza
Placas petri estériles
Placas con agar plate count
Agar Plate Count fundido a 45ºC
Espátula de drigalski
Estufa de incubación
PROCEDIMIENTOS
PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES:
1. Recuerde que todo el trabajo siempre se realiza cerca al mechero. Si la muestra es sólida, disgregarla
en un mortero estéril o con ayuda de una espátula. Luego pesar 10g de muestra e incorporarlo en los
90 ml del diluyente. Si la muestra es líquida, medir 10 ml directamente sobre el diluyente. Esta es la
dilución 10-1.
2. Agitar vigorosamente hasta una adecuada homogenización.
3. Proceder a realizar las sucesivas diluciones de la siguiente manera: pasar 1 ml del frasco a un tubo
conteniendo 9ml de diluyente. De este modo se obtiene la dilución 10 -2.
4. Agitar vigorosamente o con ayuda de vórtex.
5. La siguiente dilución se realizará tomando 1 ml de la dilución 10 -2 a un tubo conteniendo 9ml de
diluyente, de esta manera se obtiene la dilución 10-3.
6. Repetir esta operación para preparar las diluciones siguientes.
1. Elegir las dos placas correspondientes a una dilución que presenten entre 30-300 colonias.
2. Contar todas las colonias de cada placa.
3. Hallar la media aritmética de los dos valores.
4. Multiplicar dicho resultado por el factor de dilución (la inversa de la dilución cuyas placas han sido
seleccionadas).
5. Dar el valor obtenido como el recuento estándar en placa.
RESULTADOS:
PROMEDIO FACTOR DE
DILUCIÓN PLACA 1 PLACA 2 RESULTADO
ARITMÉTICO DILUCIÓN
PRÁCTICA: V
GENÉTICA MICROBIANA
Obtención de mutantes resistentes a antibióticos.
Obtención de mutantes resistentes a la luz ultravioleta.
ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS
Enfrentar microorganismos a la acción de desinfectantes
Enfrentar microorganismos a la acción de antisépticos.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas
absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente fotoproductos. Éstos
fotoproductos originan la inactivación de macromoléculas, aunque el ADN dispone de mecanismos para
paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. La inactivación del único cromosoma de la
bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de
acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).
El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene poco poder
penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada por el cristal y penetra poco en los
líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de
desinfección en salas de hospitales y de laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz
UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantes
correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases genéticas).
OBJETIVO
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
Aplicar 0,1 mL de la suspensión bacteriana en la placa de TSA y hacer una extensión con una
espátula de vidrio.
Dividir las placas en cuadrantes con ayuda del marcador.
Exponer las placas destapadas a la luz UV; manteniendo constante la distancia de 50 cm a los
tiempos de 0, 5, 10 y 15 minutos.
Hacer el experimento por duplicado y a una de las placas envolverla con papel Kraft antes de
incubar.
Llevar a incubar las placas a 37 ºC por 24 horas.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Comparar el número de colonias sobrevivientes en los diferentes tiempos de exposición; así como en la
placa cubierta con papel Kraft y en la placa normal.
UFC (INCUBACIÓN
UFC (INCUBACIÓN SIN
TIEMPO DE EXPOSICIÓN ENVOLVIENDO LA
ENVOLVER)
PLACA)
5 MINUTOS
10 MINUTOS
15 MINUTOS
COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
Las bacterias presentan algunas características biológicas que les facilita la adquisición de resistencia a
antibióticos. En primer lugar tienen una alta velocidad de duplicación: muchas de las bacterias patógenas
de humanos pueden duplicar su población en apenas 30 minutos en medios de cultivo adecuados. Sin
embargo, su sistema de reparación de ADN no está tan desarrollado como en eucariotas superiores y,
como consecuencia, presentan una alta tasa de mutaciones espontáneas. Si debido al azar, una de esas
mutaciones les permite sobrevivir en presencia de un antibiótico, la misma presión selectiva de éste (mata
a todas las sensibles) va a favorecer la aparición de una población bacteriana resistente.
Los mecanismos mediante los cuales las bacterias resisten la acción de un antibiótico son complejos, pero
se pueden clasificar en dos grandes grupos:
OBJETIVO
MATERIALES Y MEDIOS
PROCEDIMIENTO
Sembrar en toda la superficie de la placa el cultivo de E. coli con ayuda del hisopo estéril
Con ayuda de las pinzas colocar separadamente cuatro discos de diferentes antibióticos.
Llevar a incubar a 37 ºC por 24 h.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Leer las placas después de la incubación e interpretar los resultados.
MÉTODO ALTERNATIVO
MATERIALES
Tubo con caldo tripticasa soya (TSB)
Tubos patrón de turbidez de SO4Ba estándar (Mc Farland)
Placas Petri con 25 mL de Agar Mueller Hinton para placa de 90 mm
Torundas estériles
Pinzas estériles
Viales con alcohol
Viales con discos de antimicrobianos
Tubos con solución salina
PROCEDIMIENTO
1. Usar solamente cultivos identificados y puros
2. Seleccionar 4 o 5 colonias de similares características y suspender en 5 ml de TSB
3. Incubar el cultivo a 35 ºC x 2 a 8 h. Verificar turbidez.
4. Comparar la turbidez con el del patrón de SO4Ba. Este estándar debe colocarse en un tubo del
mismo calibre del medio del cultivo reemplazado cada mes.
5. Diluir la turbidez del cultivo con solución salina estéril hasta igualar la densidad del patrón.
6. Secar las placas Petri conteniendo el Agar Mueller Hinton 30 minutos antes de inocular.
7. Sumergir la torunda en el cultivo y eliminar el exceso de humedad escurriendo por las paredes del
tubo previamente para la siembra.
8. Con la torunda estriar la placa en 3 direcciones con el objeto de obtener un crecimiento uniforme y
confluente.
9. Después esperar 3 a 15 minutos a temperatura ambiente.
10. Seleccionar apropiadamente los discos de acuerdo a la bacteria
11. Colocar los discos con pinza estéril, apretar el centro suavemente para asegurar un buen contacto
con la superficie del Agar Mueller Hinton. Tener cuidado de guardar cierta distancia entre disco y
disco y del borde de la placa. Solamente se debe colocar 7 discos para la placa de 90 mm
12. Las placas deben incubarse a 37 ºC, enseguida o dentro de los 30 minutos después de la aplicación
de los discos.
13. La lectura de las placas se hace entre las 18 y 24 h., con regla milimetrada.
14. Medir solamente las zonas que muestren completa inhibición.
AGENTES FÍSICOS
Temperatura
Desecación
Radiaciones (ionizantes y no ionizantes)
Luz visible
Ondas sonoras
Presión osmótica
pH.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Fundamento
Los microorganismos tienen una temperatura mínima, una óptima y una máxima para su
crecimiento. Temperaturas por debajo de la mínima usualmente tienen acciones paralizantes en los
microorganismos. Éstas inhiben el crecimiento microbiano por un enlentecimiento del metabolismo, sin
embargo no es necesaria para matarlos. Las temperaturas por encima de la máxima tienen acción letal o
subletal, dado que desnaturalizan enzimas microbianas y otras proteínas. Si el tratamiento es corto en
duración y se efectúa a una temperatura no excesivamente alta, los daños que la bacteria sufre son
reparables y, por eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es más fuerte, en temperatura
o en duración, los daños se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad de
formar colonias, se habla entonces de efecto letal.
La temperatura es una manera muy común y efectiva de controlar a los microorganismos.
ALTAS TEMPERATURAS
CALOR HÚMEDO
1. Autoclavado
2. Agua hirviendo
CALOR SECO
PASTEURIZACIÓN
Las bajas temperaturas inhiben el crecimiento microbiano por disminución del metabolismo microbiano.
Los ejemplos incluyen refrigeración y congelamiento. Refrigeración a 5ºC disminuye el crecimiento de
microorganismos y mantiene los alimentos frescos por unos pocos días. El congelamiento a -10ºC detiene
el crecimiento microbiano, pero generalmente no los destruye y mantiene los alimento frescos por varias
semanas.
OBJETIVO
Observar el comportamiento de las cepas de estudio, bajo los efectos de la ebullición.
MATERIALES
Asa de Kohle
Mechero de Bunsen
Tubos con suspensión de Bacillus subtilis, Escherichia coli
Placa Petri con Agar Tripticasa de Soya (TSA)
PROCEDIMIENTO
Se dispondrá de un tubo con un cultivo Bacillus subtilis, Escherichia coli y de una placa Petri con TSA:
1. Separar la placa en cuatro partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con el
tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 10, 20, y 30 minutos.
2. Tomar, con una asada del cultivo y extenderlos sobre la parte de la superficie de la placa
correspondiente al tiempo t = 0.
3. Luego, colocar el tubo en el baño de agua que este en ebullición. Repetir el paso 2 a t = 5, 10, y 30
minutos (el tiempo es acumulativo).
4. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.
5. Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos
tipos de efectos diferentes:
Bacteriostáticos: Cuando impiden el crecimiento bacteriano.
Bactericidas: Cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, cuando nos referimos no sólo a las bacterias sino a cualquier tipo de microorganismos,
hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma
sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro microbicida depende
muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa.
AGENTES ESTERILIZANTES
Son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana, es decir, su
“muerte” o la pérdida irreversible de su viabilidad. (También existen agentes físicos esterilizantes,
como ya se vio en capítulos anteriores).
AGENTES ANTISÉPTICOS
Son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales
vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican.
QUIMIOTERÁPICOS
Son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad
suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos fluidos
corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hacen
eficaces como antimicrobianos dentro del organismo.
Todos los días usamos agentes químicos para controlar el crecimiento microbiano: detergentes y jabones
para el cuerpo y la ropa, cloración de las aguas potables, antisépticos para la piel y el tratamiento de
heridas, desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios, etc.
Tanto en los laboratorios como en industrias alimentarias es necesario a menudo tratar superficies inertes
(mesas, suelos, paredes, maquinaria) con desinfectantes (sanitizantes), de ser posible con efecto
microbicida. Por ejemplo se pueden usar sales cuaternarias de amonio como el cloruro de benzalconio. El
formaldehido es un agente alquilante que en solución al 3-8% sirve bien para tratar superficies.
MATERIALES Y REACTIVOS
PROCEDIMIENTO
1. Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con el
antiséptico o desinfectante a estudiar
2. Tomar 0,1 mL de una suspensión bacteriana, y colocarla en el centro de la placa con TSA.
3. Luego proceder a esparcirla en toda la superficie de la placa con la ayuda de una espátula de
Drigalsky, y sembrar en 3 direcciones; horizontal, vertical y oblicua
4. Luego con la ayuda de una pinza previamente flameada se toma un “disco” y se embebe (cada
disco) con cada uno de los desinfectantes o antisépticos escogidos. Eliminar el exceso del líquido
en la pared del frasco.
5. Se coloca el disco en el área designada para tal fin.
6. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.
7. Interpretar el efecto de cada una de las sustancias utilizadas según el diámetro del halo de
inhibición.
RESULTADOS
BACTERIA:
INTERPRETACIÓN
PRÁCTICA: VI
NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
Requerimientos nutricionales mínimos para el crecimiento microbiano
(Nutrientes, pH, temperatura, y demanda de oxígeno)
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias
químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos
objetivos:
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Los requerimientos nutricionales de los microorganismos se relacionan con la fuente de energía y con la
fuente de carbono. De acuerdo a ello las bacterias pueden clasificarse como:
OBJETIVO
Determinar en que medio de cultivo se encuentra mayor crecimiento microbiano.
MATERIALES
Cepas
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli.
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
RESULTADOS E INTERPRETACION
Bacteria/Medios M1 M2 M3 M4
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
+ = Poco crecimiento
++ = Regular crecimiento
+++ = Mayor crecimiento
OBJETIVO
Determinar el pH óptimo para cada una de las bacterias de experimentación.
MATERIALES
Cepas:
Bacillus subtilis
Escherichi coli
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Medios de cultivo:
Caldo nutritivo en tubos de 10 ml cada uno a diferentes pH (4, 7, 9).
PROCEDIMIENTO
Sembrar los microorganismos en los tubos con caldo nutritivo a diferentes pH
Incubar a 37°C por 24 horas.
Observar el crecimiento y calificar por cruces.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Bacteria pH 4 pH 7 pH 9
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
+ = Poco crecimiento
++ = Regular Crecimiento
+++ = Mayor crecimiento
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Psicrófilas
Su temperatura óptima de crecimiento está entre 5ºC - 15 ºC. Suelen encontrarse en regiones árticas,
antárticas y en los glaciares
.
Mesófilas
Son microorganismos que crecen a temperaturas moderadas. Su temperatura óptima de crecimiento
está entre 25ºC y 45ºC. La mayoría de las bacterias pertenecen a este grupo, incluyendo las bacterias
comunes del suelo y las que infectan al organismo humano.
Termófilas
La temperatura óptima de estos microorganismos está entre 45 ºC – 70ºC y son comúnmente
encontradas en las aguas termales.
Hipertermófilas
Estas bacterias crecen a muy altas temperaturas. Su temperatura óptima de crecimiento está entre
70ºC - 110ºC. Generalmente éstos pertenecen al Dominio Archaea y se encuentran cerca de
hidrotermas en las grandes profundidades del océano.
OBJETIVO
MATERIALES
Cepas
Bacillus subtilis ☺Sabias que …..
Bacillus cereus Los microorganismos
pertenecientes al dominio
Escherichia coli Arquea pueden sobrevivir a
Pseudomonas aeruginosa temperaturas de ebullición, en
ácidos, cerca de fuentes
Medio de Cultivo: Caldo nutritivo en tubos sulfurosas de ventilación en
los océanos o en otros
ambientes extremos.
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
+ = Poco crecimiento
++ = Regular crecimiento
+++ = Mayor crecimiento
OBJETIVO
Observar si existe crecimiento de microorganismos en cada uno de los medios utilizados después de
la incubación.
RESULTADOS E INTERPRETACION
PRÁCTICA: VII
METABOLISMO MICROBIANO
Metabolismo de carbohidratos (oxidación y fermentación) en bacterias.
Metabolismo de proteínas: hidrólisis de caseína y gelatina.
Metabolismo de lípidos: Hidrólisis de lecitina
Determinación de enzimas microbianas
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Los azúcares son los sustratos orgánicos utilizados por los microorganismos, mediante la fermentación
(en ausencia de O2) y la oxidación. Los azúcares son convertidos en ácidos orgánicos y con frecuencia se
liberan gases con variación de hidrógenos en el medio, este hace variar el color del indicador de pH ácido.
El uso de azúcares sirve para la clasificación e identificación de los microorganismos.
OBJETIVO
Determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un hidrato de carbono incorporado a un
medio de cultivo, produciendo alcohol, ácido y/o gas.
MATERIALES:
Microorganismos:
Escherichia coli
Klebsiella sp
Salmonella sp
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Medios de cultivo:
Medio semisólido rojo de fenol conteniendo un azúcar al 1% (glucosa, galactosa, sacarosa,
lactosa o manitol).
Agar KIA (Kligger Iron Agar)
Agar Citrato de Simmons
PROCEDIMIENTO:
Medio semisólido: Sembrar con asa de aguja un mismo microorganismo en cada uno de los
tubos, hasta una profundidad de 2/3 del medio de cultivo.
Agar TSI: Sembrar con asa de aguja en los 2/3 superiores del medio y seguidamente hacer
estrías en la parte inclinada del agar.
Agar citrato: Sembrar con el asa de aguja haciendo estrías en la parte inclinada del agar.
Incubar todos los tubos a 37º C x 24 horas.
Si hay metabolismo del azúcar por el microorganismo, se podrá observar el cambio de color y la
presencia de gas (CO2 y H2).
Resultados
E. coli
Klebsiella sp.
Salmonella sp.
P. aeruginosa
S. aureus
Resultados
E. coli
Klebsiella
Salmonella
P. aeruginosa
S .aureus
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
OBJETIVO
Identificar si las bacterias utilizan de carbohidratos por oxidación y/o fermentación.
MATERIALES
CEPAS
o Pseudomonas aeruginosa.
o Escherichia coli o Klebsiella sp.
MEDIOS DE CULTIVO
PROCEDIMIENTO
Sembrar en medio O/F, con el asa de aguja hasta el fondo, se siembra en dos tubos, luego uno de los
tubos se cubre con una capa parafinada. Se deja incubar por 48 h a 37 ºC.
Resultados
E. coli
Klebsiella sp.
P. aeruginosa
Las numerosas reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo de síntesis y el energético de los
microorganismos se realizan por medio del control de enzimas.
A. METABOLISMO DE LÍPIDOS
Hidrólisis de Triglicéridos
Los triglicéridos son esteres de glicerol y ácidos grasos, los microorganismos utilizan los triglicéridos
después de la hidrólisis del enlace éster que llevan a cabo las enzimas extracelulares llamadas lipasas,
dando como resultado glicerol y ácidos grasos libres, las lipasas no son muy específicas y atacan
triglicéridos con ácidos grasos de longitud de cadena variable.
OBJETIVO
Reconocimiento e identificación de la actividad lipolítica de las bacterias.
MATERIALES:
Microorganismos:
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Pseudomonas aeruginosa
Medios de cultivo:
Agar nutritivo conteniendo grasa vegetal (margarina) al 4%
Agar nutritivo conteniendo yema de huevo al 10%
PROCEDIMIENTO:
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
B. METABOLISMO DE PROTEÍNAS
Degradación de la Gelatina.- Los microorganismos que poseen la enzima gelatinasa actúan sobre la
gelatina, hasta la producción de aminoácidos.
OBJETIVO:
Reconocimiento e identificación de la actividad proteolítica de las bacterias.
MATERIALES:
Microorganismos:
Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Staphylococcus aureus
Medios de cultivo:
Agar nutritivo conteniendo leche descremada al 5%
Agar gelatina
PROCEDIMIENTO:
Los factores más importantes que afectan la producción de las enzimas bacterianas como gelatinasa,
amilasa, DNAsa, etc. y a la vez la velocidad de las reacciones catalizadas por éstas, son: pH,
concentración de glucosa y la presencia de inhibidores presentes en el medio de cultivo.
Cuando se analizan de manera apropiada estos factores, es posible conocer gran parte de la naturaleza de
la reacción enzimática bacteriana, deduciendo si el efecto de las variaciones en estos factores son
favorables o no a la producción enzimática.
A continuación presentamos algunas enzimas importantes:
AMILASAS
Algunos microorganismos, colocados en medios de cultivo apropiados, segregan cantidades considerables
de amilasas o de proteasas. Después de separar las células y otras impurezas, las disoluciones se
concentran por evaporación al vacío a bajas temperaturas y las enzimas de estas disoluciones se precipitan
por adición de sales inorgánicas (como el sulfato de sodio) o disolventes orgánicos miscibles en agua.
Como ejemplos de amilasas y de proteasas microbianas, se pueden citar:
Las –amilasas bacterianas (obtenidas fundamentalmente por medio del Bacillus subtilis): son enzimas
que licúan el almidón y que se utilizan para la producción de adhesivos o de recubrimientos a base de
almidón para papeles, en panadería o en otras industrias alimentarias o para la obtención de productos de
desencolado en la industria textil.
UREASA
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por
acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se
usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en inclinación en agar urea de Christensen. Este medio se complementa
después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces
de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador
de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que
especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser
leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen
actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación
PRÁCTICA: VIII
BACILOS GRAM NEGATIVOS 1
Enterobacterias patógenas
Cultivo e identificación de:
Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Yersinia.
Esta familia tiene unos requerimientos nutricionales sencillos: Son bacilos gramnegativos, no forman
esporas, aerobios o anaerobios facultativos, catalasa variable- por lo común positivos-, presencia de
capsulas variable, Movilidad variable (si es positiva tiene flagelos peritricos) – caso especial es el
denominado movimiento ondulante de la especie Proteus conocido como “swarming” en el cultivo de
agar, interfiriendo con su aislamiento- también se caracterizan por ser Oxidasa Negativas, O/F (oxido-
fermentación de la glucosa), algunas especies de esta familia tienden a producir gas CO 2 y H2S,
Temperatura optima de crecimiento es de 37ºC, reducen los nitratos a nitratos. La ausencia de actividad
de citocromo oxidasa es una característica importante, debido a que se puede determinar rápidamente
mediante una sencilla prueba, y se utiliza para diferenciar a las enterobacterias de otros bacilos
gramnegativos fermentadores y no fermentadores.
Crecimiento sugerido en agar MacConkey.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Las características de las colonias de estos microorganismos en los diferentes medios se han utilizado
para distinguir a los miembros más frecuentes de esta familia. Por ejemplo, la capacidad de fermentar
lactosa se ha utilizado para distinguir a las cepas
fermentadoras de lactosa (Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Citrobacter y Serratía) de las cepas que no
fermentan lactosa o lo hacen lentamente (Proteus, Salmonella,
Shigella y Yersinia spp.). Las sales biliares en algunos
medios selectivos se ha utilizado para separar a los patógenos
entéricos (Shigella, Salmonella) de los microorganismos
comensales que se inhiben con las sales biliares (bacterias
grampositivas y algunas gramnegativas presentes en el sistema
OBJETIVOS
MATERIALES:
Cepas de Enterobacterias
Escherichia coli
Shigella
PATOGENAS Salmonella
Yersinia
Medios de cultivos
Reactivos
Reactivo de Kovacs
PROCEDIMIENTO:
AISLAMIENTO:
Para ello se utilizan medios que son selectivos, donde podremos ver la morfología, color y otras
características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra.
Inocular con el asa de siembra cada cepa en los medios de cultivos (agar MAC, ENDO y XLD).
Incubar por 24 h a 37 ºC.
IDENTIFICACIÓN
Trabajar con las colonias aisladas previamente en agar Mac Conkey.
En TSI inocular con asa de Kohle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar el asa hacer estrías en la
parte inclinada.
En LIA inocular con el asa de Kohle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 partes del agar y al
retirar el asa hacer estrías en la parte inclinada.
En Citrato sembrar con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada.
En el medio MIO sembrar con el asa de Kohle en aguja.
Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas por 18 a 24 horas a 37 ºC.
Agregar gotas del reactivo de Kovacs (para Indol) al resultado del MIO, pero después de hacer las
lecturas de Movilidad y descarboxilación de la Ornitina.
Agar TSI:
-Pico alcalino/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo=K/A): el microorganismo solamente
fermenta glucosa.
- Pico ácido/profundidad ácida (pico amarillo/fondo amarillo= A/A): el microorganismo fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
- Pico alcalino/profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo = K/K): el microorganismo no fermenta
azúcares.
- Presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo indican que el microrganismo produce gas.
- El Ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce H2S.
Agar LIA:
- Descarboxilación de la lisina: Resultado positivo: pico alcalino(violeta)/profundidad alcalina
(violeta). Resultado negativo: pico alcalino (violeta)/ profundidad ácida (amarillo).
- Desaminación de la lisina: Pico rojizo/profundidad ácida.
- Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio.
Medio MIO:
-Movilidad: Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
-Ornitina descarboxilasa: Resultado positivo: color púrpura. Resultado negativo: color amarillo, a
veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.
-prueba del indol: Agregar gotas del reactivo de Kovacs, pero después de hacer las lecturas de
Movilidad y descarboxilación de la Ornitina. Resultado positivo: color rojo. Resultado negativo: el
color del reactivo permanece incoloro-amarillento.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Microorganismo: _______________________________________________________
RESULTADOS DE GRUPO
Microorganismo: Microorganismo:
Microorganismo: Microorganismo:
PRÁCTICA: IX
BACILOS GRAM NEGATIVOS 2
Enterobacterias oportunistas
Cultivo e identificación de:
Klebsiella, enterobacter, Proteus y Serratia.
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS:
Aislar e identificar los géneros oportunistas más importantes de enterobacterias, mediante pruebas
bioquímicas.
Reconocer la importancia clínica de esta familia en infecciones humanas.
MATERIALES
Cepas de Enterobacterias
Serratia
Klebsiella
OPORTUNISTAS Enterobacter
Proteus
Medios de cultivos
Reactivos
Reactivo Voges-Proskauer
Reactivo de Kovacs
IDENTIFICACIÓN
Trabajar con las colonias aisladas previamente en agar Mac Conkey.
En TSI inocular con asa de Kohle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar el asa hacer estrías en la
parte inclinada.
En LIA inocular con el asa de Kohle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 partes del agar y al
retirar el asa hacer estrías en la parte inclinada.
En Citrato sembrar con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada.
En el medio MIO sembrar con el asa de Kohle en aguja.
Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas por 18 a 24 horas a 37 ºC.
Al tubo con medio MIO agregar gotas del reactivo de Kovacs, para la lectura del indol.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN.
Descripción de crecimiento en agar:
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
________________________________________
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Microorganismo: _______________________________________________________
RESULTADOS DE GRUPO
Microorganismo: Microorganismo:
Microorganismo: Microorganismo:
Los bacilos Gram negativos no fermentadores son un grupo de bacilos aerobios no formadores de esporas
que no utilizan los hidratos de carbono como fuente de energía o los degradan a través de vías
metabólicas diferentes a la fermentación.
Dentro de estos bacilos tenemos al Género Pseudomonas, Acinetobacter, y Alcalígenes, algunos de ellos,
en general desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, los microorganismos objeto de
esta práctica son saprófitos en la naturaleza no producen enfermedad en el individuo sano pero pueden
comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos.
Todos ellos comparten una característica común: son incapaces de fermentar la glucosa.
Género Pseudomonas
Bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvados.
No forman esporas.
Mide aprox. 0,6 x 2 μm.
Móviles mediante flagelos polares.
Crecen bien en agar sangre y Mac Conkey
Elaboran pigmentos verdoso (pioverdina), azulado (piocianina), rojo oscuro (piorrubina), etc.
Es aerobio obligado, excepto aquellas que utilizan la desnitrificación como medio de respiración.
Es oxidasa positiva.
La Pseudomonas aeruginosa crece bien a 42 ºC a diferencia de las otras especies del género como P.
fluorescens, P. putida, P. mullei, P. cepacia.
Género Acinetobacter
Bacilo o cocobacilo Gram negativo.
A menudo se ven en pares.
Se encuentran diseminadas en suelo y agua.
Crecen bien en agra Mac Conkey y producen un suave pigmento azul.
También puede detectarse un olor parecido al amoniaco.
Aerobio obligado.
Oxidasa negativa
Género Alcalígenes
Bacilos Gram negativos
Oxidasa positivos
Móviles mediante flagelos perítricos.
Alcalinizan el medio con citrato y el medio O/F que contiene glucosa.
Negativos a ureasa.
Pueden formar parte de la flora bacteriana humana normal.
P. aeruginosa es la especie patógena aislada con mayor frecuencia en muestras humanas. Es un bacilo
aeróbico obligado que mide aproximadamente de 0,5 a 1 µm de ancho por 3 a 4 µm de largo, posee un
solo flagelo, pero en forma ocasional algunos pueden tener dos o tres. Producen dos pigmentos de
importancia clínica: piocianina, que puede colorear de azul verdoso el pus de una herida, y pioverdina
(fluoresceína), pigmento amarillo verdoso que fluoresce bajo la luz ultravioleta. Esta especie puede
infectar heridas, vías urinarias, quemaduras y el tracto respiratorio inferior, especialmente en individuos
inmunosuprimidos, considerado además un patógeno oportunista, causante principal de mortalidad en
pacientes con fibrosis quística, enfermedades neoplásicas y quemaduras severas. En ambientes
industriales y hospitalarios tiene la capacidad de sobrevivir y multiplicarse en medios húmedos, con el
mínimo de materia orgánica, condiciones favorables para convertirse en un gran contaminante y posterior
patógeno. Actualmente, este grupo de bacterias ocasiona un problema de salud pública, principalmente la
especie P. aeruginosa, debido a la notable incidencia en las infecciones intrahospitalarias; además ha
mostrado elevada multirresistencia a diferentes antibióticos.
FUNDAMENTO
PRUEBA DE LA OXIDASA
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema de
citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es
reducido por el oxígeno molecular. La prueba utiliza ciertos
reactivos colorantes como clorhidrato de p-fenilendiamina, que
sustituye al O2 como aceptor de electrones.
Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-
fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo c en
su presencia, produciendo formas coloreadas (azul/morado).
Permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de
citocromo c) del género Pseudomonas (que posee citocromo c).
MATERIALES
CEPAS
o Pseudomonas aeruginosa.
o Escherichia coli.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
o LIA, TSI, Citrato, MIO
.
MEDIOS DE CULTIVO
o Agar Mac Conkey
o Agar Cetrimide
o Agar Tripticasa Soya
o Medio Hugh & Leifson (O/F)
REACTIVOS
o Sol. de α-naftol / etanol.
o Sol. de Dimetil p-fenilendiamino/agua.
PROCEDIMIENTO
Sembrar en agar Mac Conkey las cepas de Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli tratando de
obtener colonias aisladas para poder sembrar en los medios de identificación bioquímica; incubar a
37 ºC x 24 h.
Sembrar de una colonia aislada del agar Mac Conkey, en los medios de identificación bioquímica.
Luego incubar a 37 ºC x 24 h. Transcurrido ese tiempo realizar las lecturas correspondientes.
Sembrar en medio O/F. En este medio se siembra por puntura hasta el fondo, se siembra en dos
tubos, uno con capa parafinada y otra sin ella. Se deja incubar por 48 h a 37 ºC.
Sembrar en TSA para ver la producción de oxidasa, se deja incubar por 24 h a 37 ºC, luego de los
cuales se agrega los reactivos: 0,2 mL de la sol. de α-naftol y 0,3 mL de la solución de Dimetil-p-
fenilendiamino y proceder a leer. Alternativamente se puede coger un papel embebido con un
reactivo de oxidasa; en este papel se extiende con el asa de siembra un colonia. La reacción de color
positiva se produce a los 5 a 10 segundos (color azul-violeta).
RESULTADOS E INTERPRETACION
PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA
PRUEBA DE OXIDASA
PRÁCTICA: XI
BACILOS GRAM POSITIVOS
Bacilos Gram positivos no esporulados aerobios
Cultivo e identificación bioquímica de:
Lactobacillus
Bacilos Gram positivos esporulados aerobios
Cultivo e identificación bioquímica de:
Bacillus subtillis, Bacillus cereus
Los bacilos Grampositivos aerobios incluyéndose a los anaerobios facultativos son comúnmente hallados
en el laboratorio de microbiología clínica, sobresaliendo por su naturaleza los géneros Bacillus y
Lactobacillus. La mayoría de estos bacilos son ubicuos en la naturaleza y habitan en suelos, aguas, en la
piel y mucosas de diversos animales; en el hombre especies de estos bacilos causan enfermedades
importantes.
Es esencial que el microbiólogo reconozca y diferencie si el bacilo Grampositivo aerobio esporula o no,
pues la formación de endosporas le confiere a estas bacterias, patogenicidad y resistencia al calor y
agentes químicos, constituyéndose en un gran problema tanto en medicina como en la industria
alimentaria.
BACILLUS
Este género es prototipo de la familia Bacillaceae. Son Bacilos Gram Positivos (BGP) grandes y
esporulados, no exigentes y en general móviles. Incluye bacterias aerobias y anaerobias facultativas.
Están ampliamente distribuidos en la naturaleza; algunos forman parte de la flora normal y suelen ser
contaminantes del laboratorio. El Bacillus anthracis es el más importante en microbiología médica y
veterinaria. Existe una gran diversidad de contenido G+C en su genoma, 32-62 mol % dentro del género,
lo que refleja su gran heterogeneidad.
Ciertos miembros del género tienen implicancias médicas por la producción de antibióticos como
polimixina y bacitracina, además de uso industrial en la producción de solventes, enzimas, vitaminas, etc.
LACTOBACILLUS
Los lactobacilos carecen de sistema de citocromos y son incapaces de utilizar oxígeno como aceptor de
electrones. En lugar de ello estos bacilos aerotolerantes producen ácido láctico a partir de azúcares
sencillos y crecen bien en medios ácidos.
Desarrollan generalmente en agar sangre y en agar chocolate. También se obtiene buen desarrollo en el
medio selectivo de Rogosa, agar jugo de tomate que tienen pH ácido.
Al igual que para la identificación de cualquier especie bacteriana, lo primero a realizar es un frotis con
tinción de Gram. Luego debemos conocer los requerimientos atmosféricos de la cepa a identificar, ya que
sabemos que este grupo posee tanto bacterias aerobias como aerobias facultativas y anaerobias. Para esto
sembramos en un caldo de tioglicolato. Realizaremos posteriormente un cultivo en medios agar simple,
agar sangre y las diferentes pruebas bioquímicas.
Grandes
esporulados
-
Bacillus subtilis.
Otros.
Catalasa + Lecitinasa
Clostridium
+
Las pruebas más comúnmente realizadas son las que se observan en el diagrama (en la parte
superior): lecitinasa, movilidad, y otras como indol, nitratos, citrato, Voges Proskauer, etc.; además
de la observación de la macroscopía y microscopía, bastante características de cada especie en
particular.
También se pueden utilizar técnicas de biología molecular como análisis de los fragmentos de
restricción o métodos inmunológicos para detección de las toxinas.
MATERIALES:
Microorganismos
Bacillus cereus
Bacillus subtilis
Medios de Cultivo
Agar TSA
Agar Mossel
Agar leche descremada
Medio tioglicolato
PROCEDIMIENTO
Sembrar por la técnica de aislamiento en agar TSA y hacer dos líneas en los otros agares con
las muestras de Bacillus cereus y Bacillus subtilis
Incubar las placas a 37 ºC x 24 h
En la placa de agar Mossel, interpretar directamente luego de la incubación. Se observa un
halo opaco o transparente.
En el agar leche descremada sembrar la cepa de Lactobacillus, y luego incubar en
condiciones anaeróbicas
En los tubos con medio tioglicolato sembrar con el asa en aguja
Realizar la prueba de catalasa, tomando una colonia aislada de una placa y disolviendo en
una gota de suero, luego agregar gotas de peróxido de Hidrógeno, es positivo cuando se
generan burbujas.
RESULTADOS:
Bacillus
cereus
Bacillus subtilis
Lactobacillus sp.
PRÁCTICA: XII
ANAEROBIOS ESTRICTOS
Cultivo e identificación bioquímica de:
Clostridium perfringens
Clostridium sporogenes
ANAEROBIOS ESTRICTOS
Las bacterias anaerobias pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, y éste les es tóxico.
Las anaerobias facultativas pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero en este caso el oxígeno
no les es tóxico.
Los géneros que se encuentran clasificados en anaerobios estrictos están: Bifidum, Sarcina, Clostridium,
Bacteroides y Eubacterium entre otros.
Género Clostridium
MEDIOS DE CULTIVO
1. MEDIO DE TIOGLICOLATO
Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Contiene
tioglicolato de sodio y císteina para reducir el potencial redox del medio. Logrando que haya oxígeno en
la superficie y no en el resto del tubo. Posee un indicador redox, resazurina, el cual en presencia de
oxígeno toma un color rojo o rosado fucsia y en ausencia de oxigeno es incoloro. La baja cantidad de agar
ayuda a retardar la dispersión de CO2 y O2
2. AGAR SANGRE
Las placas de agar sangre son preparadas con agar tripticasa soya (TSA) u otro
agar base, y un 5% de sangre de cordero desfibrinada, se inocula el espécimen y
es llevada a la jarra de anaerobiosis.
En el agar sangre, Clostridium perfringens forma colonias rodeadas por una
doble zona de hemólisis característica, donde la hemólisis interior es completa
mientras que la hemólisis exterior es incompleta, mientras que Clostridium
sporogenes, no produce hemólisis.
☺SABIAS QUE….
La prueba de CAMP inversa, en donde se inocula en agar sangre una
estría del microorganismo sospechoso y otra de un Estreptococo del grupo
B formando un ángulo recto. Si la reacción es positiva, tras la incubación
aparece una zona de hemólisis sinérgica en forma de punta de flecha.
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS:
Conocer los requisitos para cultivar y lograr el desarrollo de bacterias anaerobias estrictas, como
las técnicas usadas comúnmente.
Aprender los métodos mas usados en la siembra de anaerobios
Conocer las pruebas bioquímicas que se realizan
MATERIALES
Microorganismos
o Clostridium sporogenes
o Lactobacillus
o
Medios de Cultivo
o Agar selectivo para Clostridium
o Agar Sangre
o Medio tioglicolato
o Caldo nutritivo
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra de Clostridium sporogenes con la ayuda de una asa en aguja en forma
perpendicular hasta casi el fondo del tubo con medio tioglicolato.
2. Sembrar empleando la técnica de aislamiento la muestra de Clostridium sporogenes en el agar
selectivo para Clostridium y en placas de agar sangre.
3. Colocar las placas y los tubos a una jarra para anaerobiosis o en una jarra bien cerrada con una vela
prendida adentro.
4. Incubar las placas y tubos a 37 ºC por 24-48 hs.
5. Describir e interpretar los resultados en el medio tioglicolato
6. Observar y describir el desarrollo de las colonias en la placa.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
OBSERVACIONES DE LOS TUBOS
Descripción de resultados
Medio tioglicolato
Caldo nutritivo
Conclusiones:
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AGAR SANGRE
AGAR SELECTIVO DE
CLOSTRIDIUM
PRÁCTICA: XIII
COCOS GRAM POSITIVOS
Cultivo e identificación bioquímica de:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, y Streptococcus pneumoniae
Catalasa
( +) ( )
Staphylococcus Streptococcus
Coagulasa Hemólisis
Morfología microscópica: Para la misma se debe realizar un frotis, de preferencia a partir de medio
liquido, realizando luego la tinción de Gram, lo que nos permitirá apreciar la forma, agrupación de la
cepa en estudio.
En el Agar sangre Colonias circulares de 1-2mm de diámetro, lisas. Habitualmente producen hemólisis
(β-hemólisis) las cepas de Staphylococcus aureus.
Las cepas de Staphylococcus epidermidis en cambio tienen gamma-hemólisis (alguna literatura ya no
considera este tipo de hemólisis).
En el Agar manitol salado: Staphylococcus aureus da colonias grandes, convexas, con halo amarillo
intenso (debido a la producción de ácido a partir del manitol, lo que hace virar al indicador rojo de fenol).
Las cepas de Staphylococcus epidermidis en cambio son pequeñas y sin cambio de color.
El medio de Baird Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros gérmenes Gram positivos
presentándose las colonias de Staphylococcus aureus negras con borde incoloro, convexas, rodeadas de
una zona opaca con una zona clara externa.
El agar DNasa. Contiene DNasa, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa en
bacterias S. aureus producirá una lisis del DNA presente en la placa si posee esta enzima, con el
consiguiente aclaración del medio.
Prueba de Coagulasa
OBJETIVO
Aislar e identificar estafilococos
Materiales:
Cepas de Bacterias
o Staphylococcus aureus
o Staphylococcus epidermidis
Medio de cultivo
o Placas de agar sangre
o Placas de agar manitol salado
o Placas con agar tripticasa soya
o Placas con agar DNA
o Placas con agar Baird Parker
o Tubos con gradiente de solución salina (1%,5%,10%)
Reactivos
o Set de colorantes para Gram.
o Acido clorhídrico concentrado.
PROCEDIMIENTO
Sembrar por la técnica de aislamiento en agar sangre, TSA, manitol salado y Baird Parker las
muestras de Staphylococcus aureus y S. epidermidis.
Sembrar las muestras en forma de estría en agar DNAsa.
Incubar las placas a 37 ºC x 24h.
Realice un frotis de las colonias aisladas en manitol salado y colorear con Gram.
Observar con el microscopio de inmersión.
Sembrar las muestras en los tubos con la gradiente de concentración salina.
Agregar ácido clorhídrico concentrado ala placa de agar DNA y observar un halo transparente
alrededor de las colonias.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Bacteria Coloración Fermentación de
Gram Manitol Hemólisis DNAsa
S. aureus
S. epidermidis
Los estreptococos tienen una historia interesante y como género bacteriano individual han causado
probablemente más enfermedad y morbilidad humana a través de los siglos que casi cualquier bacteria,
con la posible excepción del bacilo tuberculoso. Originalmente han sido agrupados por su capacidad para
producir lisis de los hematíes; y así tenemos los estreptococos alfa hemolíticos, estreptococos beta
hemolíticos y los estreptococos gamma hemolíticos según la lisis sea parcial, total y nula
respectivamente.
De gran importancia en la constitución de la flora microbiana normal y en la patogenicidad del sistema
respiratorio, su virulencia depende de la producción de ciertas toxinas (hemolíticas, leucocidina,
eritrogénicas, etc.) y enzimas (fibribolisina, hialuronidasa, etc.)
Podemos clasificar a los Estreptococos de muy diversas formas según sea el objetivo y necesidad de dicha
clasificación.
OBJETIVO
Entrenar al estudiante en el aislamiento, coloración e identificación de estreptococos.
MATERIALES
CEPAS DE BACTERIAS
o Streptococcus sp.
o Streptococcus mutans
MEDIOS DE CULTIVO
o Placas de agar sangre
o Placas con Agar BHI
o Tubo con caldo tioglicolato
REACTIVOS
o Set. de colorantes para Gram
PROCEDIMIENTO
Siembre con un asa de Kohle procurando aislar las bacterias en las placas de agar sangre.
Siembre en el tubo que contiene caldo tioglicolato.
Incubar a 37 ºC por 24 horas en anaerobiosis.
Después de la incubación, seleccione una colonia β-hemolítica y realice una coloración Gram.
Observe con lente de inmersión.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Realizar la lectura teniendo en cuenta:
En el caldo tioglicolato: Desarrolla grumos pequeños sin producir turbidez
En el agar sangre: Observe de preferencia las colonias puntiformes y rodeadas de β hemólisis
β-hemólisis son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose como un
halo transparente alrededor de las colonias.
α-hemólisis Son aquellos que producen hemólisis parcial la cual se observa como un halo con tonalidad
verdosa alrededor de las colonias.
–hemólisis Son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.
Anote las características de forma y reacción Gram.
PRÁCTICA: XIV
MICOLOGÍA
Cultivo de mohos ambientales y levaduras.
Cultivo de dermatofitos.
Micología
Morfología y estructura
En la naturaleza pueden encontrase formas muy simples como las levaduras, formas filamentosas
multinucleadas y estructuras macroscópicas más complejas como los denominados hongos de sombrero.
Micelio
- Micelio vegetativo: Esta constituido por hifas que crecen dentro y sobre el sustrato que contiene los
nutrientes. Cumple funciones de absorción.
- Micelio aéreo o de reproducción: Esta constituido por estructuras aéreas que se originan a partir del
micelio vegetativo y, como su nombre lo indica, cumple funciones relacionadas con la reproducción y
multiplicación.
REPRODUCCIÓN
Pueden presentar dos tipos de reproducción: Sexual y asexual.
No todos los hongos se reproducen de las dos maneras, algunos sólo de forma asexual, los hongos que se
reproducen de forma asexual son los hongos imperfectos (anamorfos). Los hongos que se reproducen
tanto asexual como sexual son los hongos perfectos (teleomorfos).
Endosporas Oosporas
- Esporangiosporas
Zigosporas
Exosporas (Conidias)
- Artroconidias Ascosporas
- Blastoconidias
- Clamidosporas Basidioesporas
DERMATOFITOS
Son un grupo de hongos que presentan la capacidad de invadir los tejidos queratinizados (piel, pelo, uñas)
del hombre y de los animales, produciendo una enfermedad que se denomina dermatofitosis o, más
comúnmente, tiña.
En medios selectivos para el aislamiento de dermatofitos son hongos hialinos que forman colonias que
presentan en general colores claros, con gamas de color restringidas a tonos blanquecinos, amarillentos y
marronáceos.
Existen diferentes estructuras microscópicas a tener en cuenta para la identificación de estos hongos
(clamidosporas, distintos tipos de hifas, etc.). No obstante, la forma y distribución de macroconidias y
microconidias es fundamental a la hora de definir los géneros y especies.
MATERIALES:
Cultivos puros en Agar Sabouraud de Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus
niger
Cultivos puros en Agar selectivo para dermatofitos de Microsporum canis
Portaobjetos y cubreobjetos
Solución de KOH al 10%
Placas de Agar Sabouraud
Agar Selectivo para Dermatofitos (DTM)
PROCEDIMIENTO:
1. A partir de los cultivos puros se inoculan las dos levaduras en placas de agar Sabouraud. Para ello se
toma una pequeña parte de una colonia aislada y se realizan estrías en una porción de la placa. Se
incuban las placas durante tres días a temperatura ambiente.
2. Observar al microscopio las estructuras características de cada especie. Colocar en un portaobjetos
una gota de solución de KOH al 10% sobre al cual se suspenderá una pequeña cantidad de inóculo.
Observar con objetivo de 10 X y 40 X
3. Exponer placas destapadas de agar Sabouraud durante un período no menor de 10 minutos. Luego
incubar a temperatura ambiente por una semana.
4. A partir de un cultivo puro de dermatofitos, sembrar en agar selectivo para dermatofitos (DTM).
RESULTADOS:
- Levadura:
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- Hongo Filamentoso:
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Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 72
Guía de Prácticas – Microbiología General 2019-I
EP. Farmacia y Bioquímica
- Dermatofito:
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Otro: ……………………………………….
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Otro: ……………………………………….
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXO: BIOSEGURIDAD
Bioseguridad
Conjunto de medidas preventivas reconocidas internacionalmente orientadas a proteger la salud y la
seguridad del personal y su entorno. Complementariamente se incluye normas contra riesgos producidos
por agentes físicos, químicos y mecánicos. Modernamente se incorporan también las acciones o medidas
de seguridad requeridas para minimizar los riesgos derivados del manejo de un organismo modificado
genéticamente (OMG), sus derivados o productos que los contengan, y uso de la tecnología del ADN
recombinante (ingeniería genética) y otras técnicas moleculares más recientes.
Agentes Biopeligrosos
Son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres
humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos,
productos recombinantes, alergenos, priones, etc.
Riesgo Microbiológico
En el Laboratorio de Microbiología existen dos fuentes principales de peligros biológicos, uno de ellos lo
representa el procesamiento de muestras provenientes de un paciente y en segundo lugar el manejo de
cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a
provocar una infección si no son manipulados con precaución.
El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que realicemos una actividad práctica en el
Laboratorio de Microbiología, razón por la cual debemos llevarlas a cabo con precaución, además de
tener un ambiente de trabajo en el que seamos capaces de reconocer y evitar los peligros involucrados con
estas actividades, para así poder evitar posibles accidentes.
Cabina de seguridad biológica: Son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar
de forma segura con agentes infecciosos. Permiten proteger según su diseño y clasificación al trabajador,
medio ambiente o al producto. Es una combinación de elementos electromecánicos/electrónicos y
procesos físicos que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie
estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas del 99,99%,
cuando el tamaño de éstas es de 0,3 μ.
Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el equipo
GRUPO DE NIVEL DE TIPO DE PRÁCTICAS DE
EQUIPO DE BIOSEGURIDAD
RIESGO BIOSEGURIDAD LABORATORIO LABORATORIO