Análisis de Ácido Ascórbico (vitamina C).

Método colorimétrico de la 2-nitroanilina.

El ácido ascórbico por procedimiento con la 2-nitro anilina diazotada, da lugar al

derivado 2-nitrofenilhidrazida del ácido oxálico, el cual en presencia de un exceso
de NaOH da lugar una sal sódica de color violeta cuya absorbancia se mide a 540
nm.
La aparición de otras vitaminas, compuestos sulfhídricos, ácido sulfuroso, etc., no
tienen influencia en la determinación de ácido ascórbico por este procedimiento.
El método es apropiado para el cálculo del ácido ascórbico en frutas, néctares,
alimentos suplementados con la vitamina y en elaboraciones farmacéuticas, si
ocurre que las soluciones o extractos sean transparentes, incoloros o a solo
posean un color amarillo débil.

Materiales y reactivos:

Materiales Reactivos
Tubos de ensayo
Alcohólica de fenolftaleína al 1%
Vasos de precipitado 2-nitro anilina
Embudo de vidrio Nitrito de sodio
Pipetas Etanol
Gasa Patrón ac. Ascórbico
Papel filtro Ácido oxálico
Beaker Agua destilada
Espectrofotómetro
Balanza electrónica
Picnómetro, PH-metro, crisol, soporte
universal.
  Tubos de ensayo, vasos de precipitado, embudo de vidrio, pipetas de 10 y 1
ml, gasa papel filtro y espectrofotómetro.
 Solución acuosa de ácido oxálico al 0,15%.
 Solución acética-clorhídrica de 2-nitro anilina al 0,16%- Disolver 80 mg de
2-nitro anilina en 4 ml de ácido acético glacial y diluir a 50 ml con HCl al
10%.
 Solución acuosa de nitrito de sodio al 0,08%.
 Etanol absoluto o del 96%.
 Solución patrón de vitamina C en ácido oxálico del 0,15% en concentración
0,2 mg de vitamina/ml.
 Solución acuosa de NaOH al 10%.

PROCEDIMIENTO.

Las muestras sólidas se obtiene con la solución de ácido oxálico al 0,15%, y las
liquidas (por ejemplo zumos de frutas) se procesan con solución de ácido oxálico
en una dosis suficiente para suministrar una concentración entre 0,2 y 2,0 mg de
ácido ascórbico en 5 ml de extracto.
Preparación del extracto problema:

 Filtrar sobre gasa el zumo obtenido de la fruta cítrica (limón, naranja,

mandarina, toronja, etc.).
 En un vaso de precipitado pequeño previamente pesado, medir con pipeta
5 ml del jugo libre de semillas y hollejos; pesarlo de nuevo. Por diferencia
hallar el peso de los 5 ml de jugo y anotarlo. (Pm)
 A 5 ml de jugo agregar 20 ml de solución de ácido oxálico al 0,15%. Agitar y
dejar en reposo unos tres minutos.
 Filtrar con papel de filtro seco. Este constituye el extracto problema.
Preparación de la curva de calibración:
Se rotulan 13 tubos de ensayo y se pipetean en su orden los siguientes reactivos
ver tabla 1.

Tabla 1. Muestra la concentración que debe estar contenida en cada tubo.

TUBO B 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11

2-nitro anilina (ml)

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

nitrito de sodio* (ml)

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

mezclar bien
esperar 1’

etanol (ml)
3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8

Patrón ac.
Ascórbico (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

extracto problema
(ml) 0,5

ácido oxálico (ml)

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,5

mezclar bien reposo

5’

NaOH al 10% (ml)

1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2

agua destilada (ml) 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8

Se mezcla bien el contenido de cada tubo.

Luego se lee a 540 nm ajustando el 100% de tramitancía con B.
Cálculos y expresión de resultados:
Para hallar el contenido de vitamina c primero tenemos que remontarnos a una
curva patrón que se obtuvo con un ensayo anterior y que mostraremos a
continuación que nos va a servir como base en nuestros cálculos del contenido de
vitamina c del néctar de guayaba.
AC.
ASCORBICO
TUBOS ABSORBANCIA (MG)
BLANCO 0 0
1 0,09 0,02
2 0,152 0,04
3 0,245 0,06
4 0,343 0,08
5 0,382 0,1
6 0,562 0,14
7 0,673 0,2
MUESTRA
NARANJA 0,249 0,06
MUESTRA 0,132 0,031
Con estos datos se realizó la una ecuación de la recta.Gráfico1.

Curva patrón de vitamina c

0.25

0.2 y = 0.2819x - 0.0062

R² = 0.9805
0.15

0.1

0.05

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
-0.05

Grafico1. Ecuación de la recta que nos servirá como curva patrón.

 Dónde:
Ecuación de la recta y = mx + b.

Y= Concentración de Ac. Ascórbico por cada mg/10 ml sol.

m= Pendiente. (Cuyo valor según la gráfica es 0,2819).
X= Absorbancia.
b= Intercepto. (Cuyo valor según la gráfica es -0,0062).

A continuación se muestran los datos de las absorbancias del néctar que se

obtuvieron en los tiempos 0, 5,10 y 15 minutos medidos en tres repeticiones
(R1,R2,R3) respectivamente que se hallaron con el espectrofotómetro UV- Vis
Shimasu ®. Como ya tenemos todos los datos solo nos queda reemplazar los
datos en la ecuación de la recta para hallar la cantidad de Ac. Ascórbico por cada
mg/10 ml sol.
Nota: Podemos expresar la cantidad de de Ac. Ascórbico mg/100 ml sol, con la
siguiente formula. (mg de vit. C / 100 de zumo = Cp x 25 x 100 / Va x Pm)
Donde:
Cp: Cantidad de Ac. Ascórbico por cada mg/10 ml sol.
Vsol: 25ml.
Va x Pm: Volumen utilizado de la muestra problema (0,5ml).
Realizando los cálculos correspondientes obtendríamos los siguientes resultados.

Ac. Ascorbico Ac. Ascorbico

Tubo 11 Tiempo Absorbancia
mg/10 ml sol mg/100 ml sol
R1 0 0,051 0,0082 40,88
R2 0 0,053 0,0087 43,70
R3 0 0,052 0,0085 42,29
R1 5 0,049 0,0076 38,07
R2 5 0,05 0,0079 39,48
R3 5 0,049 0,0076 38,07
R1 10 0,048 0,0073 36,66
R2 10 0,049 0,0076 38,07
R3 10 0,047 0,0070 35,25
R1 15 0,046 0,0068 33,84
R2 15 0,047 0,0070 35,25
R3 15 0,045 0,0065 32,43
 Ac. Ascorbico Ac. Ascorbico
Tubo 11 Tiempo Absorbancia
mg/10 ml sol mg/100 ml sol
R1 20 0,045 0,0065 32,43
R2 20 0,042 0,0056 28,20
R3 20 0,043 0,0059 29,61
R1 25 0,043 0,0059 29,61
R2 25 0,042 0,0056 28,20
R3 25 0,041 0,0054 26,79
R1 30 0,04 0,0051 25,38
R2 30 0,041 0,0054 26,79
R3 30 0,04 0,0051 25,38
 Bibliografía.

 http://www.nutrinfo.com/pagina/info/vitc0.html.

 Norma general del Codex para zumos (jugos) y néctares de frutas.

 (Codex Stan 247-2005).