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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología E Ingeniería ECBTI

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

Curso
Biotecnología

Informe de Laboratorio

Presentado a
Zain Sánchez Reinoso

Realizado por:
Erika Lorena Toro Jaramillo
1054.993.219
Marino Ocampo Atehortua
1017.144.220
Juan Camilo Giraldo Estrada
1115.184.116

Grupos
305689_22
305689_23

Programa
Ingeniería de alimentos

Mayo de 2018
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Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología E Ingeniería ECBTI

PRÁCTICA 2: CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Objetivo

Realizar una curva patrón para la determinación de crecimiento en levaduras.

Resumen

El crecimiento microbiano se compone de cuatro fases llamadas: fase de latencia, la


cual se refiere a la etapa en el cual no hay crecimiento celular debido a que la célula
necesita un periodo de transición cuando son transferidos a diferentes condiciones;
fase exponencial, que es cuando las células están dividiéndose; fase estacionaria, la
cual se da cuando existe un agotamiento de nutrientes esenciales por lo que las
células no pueden seguir reproduciéndose; y finalmente, fase de muerte que se da
cuando las células además de dejar de crecer, dejan de realizar actividades
metabólicas.

Introducción

En esta práctica se evaluará el crecimiento y comportamiento de una cepa de


Escherichia coli en diferentes medios sintéticos de cultivo; para ello se utilizarán dos
matrices; la primera: modificando la fuente de carbono, manteniendo constantes los
demás compuestos y la segunda: variando la concentración de un sustrato. La
medición del crecimiento se realizará por turbidimetría utilizando una curva patrón
relacionando absorbancia y concentración de biomasa seca por ml de medio.

Materiales y métodos
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RESULTADOS

Tiempo (min) Absorbancia


9:02 0,1954
9:32 0,1875
10:02 0,1899
10:32 0,1886
11:02 0,1957
11:32 0,2018
12:02 0,2048
12:32 0,202
13:02 0,2084
13:32 0,4579
14:02 0,4391
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Tiempo VS Absorbancia
0.5
0.45 0.4579
0.4391
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2 0.1954 0.1875 0.1899 0.1886 0.1957 0.2018 0.2048 0.202 0.2084
0.15
0.1
0.05
0
9:02 9:32 10:02 10:32 11:02 11:32 12:02 12:32 13:02 13:32 14:02

ANÁLISIS DE RESULTADOS

 A pesar de que los tiempos fueron tomados tal cual lo establece el


procedimiento, la gráfica nos refleja un tiempo estacionario muy largo (5
horas), fenómeno que se presenta, como el resultado del agotamiento de los
nutrientes disponibles o del efecto de acumulación de productos tóxicos de
metabolismo que tienen como consecuencia la disminución de la velocidad del
crecimiento.

 Presenta una breve fase exponencial y una pequeña fase de muerte, debido al
agotamiento de las reservas celulares de energía.

CONCLUSIONES

El objetivo de la práctica no se logra alcanzar, debido a múltiples factores que no


permitieron la ejecución de la misma. Estos factores fueron:

 El sustrato presentaba sedimentación, interviniendo así en la toma de las


muestras a incubar.

 El sustrato no contó con el suficiente tiempo de preparación, esto altero los


resultados obtenidos.
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PRÁCTICA 3: CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES

Objetivo

Establecer los métodos para cuantificar el consumo de diferentes tipos de sustrato


por diferentes microorganismos.

Resumen

Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero poseen


preferencia por un tipo particular de sustrato y algunos resultan no consumibles para
algunas cepas de una especie en particular. Cuando dos o más sustratos están
presentes en el medio de cultivo, los microorganismos no los consumen por igual,
sino que consumen preferencialmente uno de ellos hasta agotarlo. Solo en este punto
inician el consumo del siguiente sustrato preferido. Este fenómeno se conoce como
diauxia.

Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una de las cepas
de un organismo, y puede ser medida como la variación en la velocidad de
crecimiento, consumo de sustrato o generación de producto.

Introducción

Para que un microorganismo produzca el metabolito deseado es necesario


proporcionarle un sustrato que garantice un mayor rendimiento. Para ello, es
necesario realizar diferentes ensayos que nos permita saber las diferencias en
preferencia de diferentes tipos de sustrato. En este ejercicio de laboratorio analizaras
estadísticamente las diferencias existentes en el consumo de diferentes tipos de
azúcar por diferentes cepas comerciales de levaduras.

Materiales y métodos
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RESULTADOS (Solución Glucosa)

Solución de glucosa
Tubo Agua (mL) Conc mg/ml Absorbancia
(mL)
0 0 1 0 0,1116
1 0,1 0,9 0,3 0,1262
2 0,2 0,8 0,6 0,1028
3 0,3 0,7 0,9 0,1075
4 0,4 0,6 1,2 0,1403
5 0,5 0,5 1,5 0,1548
6 0,6 0,4 1,8 0,1703
7 0,7 0,3 2,1 0,1975
8 0,8 0,2 2,4 0,225
9 0,9 0,1 2,7 0,235
10 1 0 3 0,2621

Concentración Inicial m 0,0691


(gl/l) o mg/ml (60 3
mg/20 ml) b 0,0527
g/100 ml
0.3 x conc g/ml
y Absorbancia
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Curva Calibración
0.3

0.25
Absorbancia

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Concentración glucosa (mg/ml)

ANÁLISIS DE RESULTADOS

 La gráfica nos muestra las variaciones que tuvo la solución de glucosa en


correlación con los ml tomados para el análisis, tuvo picos de decadencia que
nos hacen dudar sobre la medición en el equipo, como también el proceso
metabólico de la enzima.

CONCLUSIONES

El objetivo de la práctica no se logra alcanzar, debido a múltiples factores que no


permitieron la ejecución de la misma. Estos factores fueron:

 El reactivo DNS, se encontraba mal preparado. Toca interrumpir la práctica,


hasta que lo prepararan nuevamente.

 El calentamiento en baño María, tardó más de 10 min y los tubos de ensayo


fueron sometidos todos al mismo tiempo al baño María, cuando debía ser uno
por uno.

 El espectrofotómetro, se encontraba des calibrado y este no arrojaba los datos


requeridos, se realiza la medición de los resultados en otro equipo.
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RESULTADOS (E. COLI)


Tiempo Conc apa. Adición de
Tubo Absorbancia Conc. Real
(min) mg/ml agua ml
0 0 0,2368 9,189 7,811 17
1 30 0,2242 20,000 3,000 17
2 60 0,2241 19,788 2,788 17
3 90 0,173 20,000 3,000 17
4 120 0,2078 20,000 3,000 17
5 150 0,2249 20,000 3,000 17
6 180 0,1964 20,000 3,000 17
7 240 0,211 20,000 3,000 17
8 270 0,1133 20,000 3,000 17
9 300 0,1835 20,000 3,000 17
10 330 0,2239 20,000 3,000 17

Microlitros
tomados
20
de cada
tubo

Blanco 0,182
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Consumo de sustrato
9.000
Concentración glucosa
8.000
7.000
6.000
mg/ml

5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0.000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo (min)

ANÁLISIS DE RESULTADOS

 La gráfica nos presenta variaciones en la absorbancia de la muestra, debido a


que no teníamos claro las concentraciones de los tubos de ensayo y se adicionó
agua destilada para ajustar su color con el del color patrón, el cual nos permitía
una medición más efectiva de la muestra.

CONCLUSIONES

El objetivo de la práctica no se logra alcanzar, debido a múltiples factores que no


permitieron la ejecución de la misma. Estos factores fueron:

 Las muestras analizadas tenían que tener un color patrón para poder obtener
la lectura en el espectrofotómetro, este color fue muy difícil de lograr, puesto
que no tuvimos en cuenta la marcación de los tubos con su respectiva
concentración.

 Las celdas del espectrofotómetro, no eran uniformes y por consiguiente


arrojaban diversos resultados.

 El tiempo del baño María, no fue el acorde y el tiempo del baño con hielo, no
se cumplió a cabalidad debido a la prisa por analizar.
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PRÁCTICA 4: AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE


AMILASA

Objetivos

General

 Aislar y seleccionar microorganismos productores de enzimas amilolíticas a


partir de muestras de suelo.

Específicos

 Comprender el procedimiento necesario para diluir la muestra preparada y así


obtener la siembra.

 Realizar una siembra que permita identificar organismos productores de


amilasa.

 Aislar y caracterizar las cepas productoras de amilasa.

 Identificar organismos productores de amilasas.

Resumen del Laboratorio

El propósito de esta práctica tiene como fin el reconocimiento sobre el aislamiento de


microorganismos productores de amilasa, buscando comprender el procedimiento, las
características y los organismos productores de la misma, comprendiendo que la
amilasa es un microorganismo capaz de reducir azucares complejos a azucares
simples, separando la amilosa de la amilopectina, entrando al almidón y
fraccionándolo, para comprender mejor lo dicho, se procedió a diluir 1 gr de tierra
seca con 15 ml de agua esterilizada, después de agitar durante 30 a 60 minutos,
luego se tomó 1 ml de la muestra y de diluyo, después de tres diluciones, se realizó
una primera siembra en una placa de agar nutriente/almidón, y extender la muestra
por toda la superficie, luego, se realizó una nueva dilución y sembró en otra placa, se
procedió a incubar a 30°C durante 48 horas, después de terminado la incubación, se
utilizó revelador del lugol para determinar microorganismos degradados, numero de
colonias, medidas y demás características solicitadas, este procedimiento, nos hizo
falta realizar más diluciones, pues lo que se obtuvo no fue lo esperado, debido a que
la concentración de la solución fue muy alta y por ende, no se pudo detectar las
diferentes halos, colonias y demás.
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Sustrato= PDA almidón de papa

Enzima= Amilasa

Introducción

El almidón está conformado por un polímero lineal de glucosa llamado amilosa y por
un polímero ramificado también de glucosa llamado amilopectina; lo que hace, que
sea considerado como un polímero natural con una alta riqueza calórica, la
degradación del mismo en las moléculas de glucosa que representan energía para las
células se realiza a partir de enzimas extracelulares como la amilasa, la cual es
segregada por una gran variedad de microorganismos en ambientes naturales. Uno
de los objetivos de la biotecnología es encontrar microorganismos productores de
enzimas, que bajo condiciones óptimas produzcan enzimas a nivel industrial.

Materiales y métodos:

Materiales:

Agua destilada o peptonada


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Pipeta de 10ml

1 gr de tierra seca recogida

Solución de Yodo

Bastoncitos de algodón estéril


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2 cajas de Petri

Nutriente de agar preparado con 0,2 gr de Almidón Soluble

Rotulador

Lo primero que se hizo, fue tomar la muestra de tierra y diluirla en agua esterilizada,
y agitar durante 30 minutos, luego se realizó una primera dilución, hasta llegar a la
tercera, luego, se puso un medio selectivo rico en almidón llamado PDA (rico en
almidón de papa) en una caja de Petri, y realizamos la siembra selectiva, para que
después de 48 horas de estar incubado a 30°C, tinturamos con lugol, pero cuando
observamos las siembras en la caja de Petri, nos dimos cuenta que realizamos una
siembra con una concentración de la enzima muy alta, nos hizo falta diluir más la
muestra a fin de lograr obtener una concentración menor y así diferenciar las colonias
de los halos y cumplir con el objetivo de la práctica, por ello, no logramos realizar ni
las medidas correspondientes de diámetro de la colonia ni de la hidrolisis del halo.
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Resultados

Trituración con lugol

Dilución 1x10-1 en agar PDA:

Dilución 1x10-2 en agar PDA


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Dilucion 1 x 10-3 en agar PDA

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Como se puede observar en las diferentes siembras, la dilución 1x10-3 ya estaba


presentando alguna diferencia con respecto de las demás en formación de colonias,
las cuales son algo vistas, pero al ser cantidad mayor aun, ellas comienzan a competir
por territorio rico en nutrientes y no se evidencia un crecimiento destacado en alguna,
se esperaba ver una formación de la colonia con sus respectivos halos.

Sin embargo, se observa que los diferentes microorganismos han consumido el


almidón pues al aplicar el lugol, se observa que se tinturo el almidón, y las colonias
no se tinturan.

Al revisar la inoculación de las diferentes siembras, no tuvimos en cuenta realizar una


dilución mayor a fin de obtener una observación más clara de las diferentes colonias,
quizás, la muestra de suelo que se tomó, tiene una fuente rica en este tipo de
enzimas, sin embargo, se pudo observar el consumo del agar en las diferentes
siembras, el cual, debido a que el agar preparado es rico en almidón, presento un
consumo de la misma que permitió revelar una cantidad de colonias, que difícilmente
se podían contar, observables en la dilución 1x10-3, pero que permitió revisar que si
había presencia de microrganismos productores de la enzima amilasa.
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CONCLUSIONES

Con este laboratorio, logramos observar microorganismos productores de la enzima


amilasa, la cual es una enzima que es capaz de reducir un almidón de azucares
complejos a azucares simples, separando la amilosa de la amilopectina, lo que hace
la enzima es entrar en el almidón y fraccionarlo para obtener los azucares menores.
Las muestras para este tipo de laboratorios no precisamente se encuentran en el
suelo, también en los rumiantes, en los humanos, presentes en la saliva, los cuales
permiten desdoblar esos almidones que nosotros consumimos en los alimentos, y en
diferentes muestras.

Se comprendió la metodología de aislamiento, que a pesar de ser la más indicada,


hizo falta realizar más diluciones con el fin de obtener una mejor vista de la colonia
que pudo crear el microorganismo, utilizando un medio rico en almidón, como es el
caso del agar PDA, con el fin de que los microrganismos que tuviesen esa preferencia
por ese sustrato, crecieran incubados.

Los aislamientos realizados, no permitieron observar el debido crecimiento del


microorganismo, pues no se llegó a una menor concentración, pues e observo un
crecimiento grande del microorganismo que no permitió observar halos ni colonias de
los mismos, ya que fueron muchos los que crecieron dentro de las cajas de Petri.

Cuando se aplicó el lugol, se creyó en su momento que se tinturaban era las colonias
con sus respectivos halos, pero por explicación del tutor, lo que reacciona con el lugol
es el almidón que no se ha consumido, pues la amilasa y la amilopectina producida
no se tintura.
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DESARROLLO DEL CUESTIONARIO

 Describa lo observado en la práctica e indique 4 microorganismos


capaces de producir amilasas, que se pueden ser aislados de muestras
de suelo.

En la práctica, se observó que los microorganismos cuando tienen una alta


concentración, el consumo de almidón es más grande, y se diferencia en de la primera
a la tercera dilución de la muestra, además, se observa que al tinturar con lugol,
donde hay más alta concentración de microorganismos el almidón ya se había
degradado.

Como microorganismos productores de amilasa que pueden ser aislados de muestras


de suelo, tenemos el Aspergillus oryzae, Bacillus subtillis, y Bacillus
amyloliquefaciens.

 Nombre la funcionalidad de estas enzimas (amilasas) en la industria


de alimentos e indique su clasificación

Funcionalidad en la
Nombre industria de Clasificación
alimentos
Aspergillus oryzae es un Dominio: Eukaryota
pro biótico de hongos Reino:
filamentosos Fungi
comúnmente utilizados Filo:
en el proceso de Ascomycota
fermentación de la soja, Subfilo:
arroz, cereales y Pezizomycotina
patatas. Clase:
Eurotiomycetes
Se utiliza para hacer Orden:
ciertos alimentos Eurotiales
asiáticos fermentadas Familia:
como el tempeh, salsa Trichocomaceae
de soja, miso, Sake, y Género: Aspergillus
vinagres de arroz. Especie: A. oryzae

Aspergillus oryzae Este proceso de


fermentación produce
enzimas que se saben
que son beneficiosos a
los seres humanos y
animales. En particular,
Aspergillus oryzae
produce la enzima
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amilasa, una enzima


importante para un
intestino sano y una
buena digestión.

No se sabe cuándo este


hongo fue domesticado
para el uso humano,
pero uso registrado se
remonta actualmente
sobre 2,000 años.
Bacillus Subtilis Bacillus subtilis ha sido Dominio: Bacteria
utilizado como pro Filo:
biótico desde 1986 para Firmicutes
mejorar el rendimiento Clase: Bacilli
productivo en pollos de Orden:
engorda. La Autoridad Bacillales
Europea de Seguridad Familia:
Alimentaria (EFSA) Bacillaceae
elaboraron un informe Género: Bacillus
científico sobre la Especie: Bacillus
seguridad y eficacia de Subtilis
un producto basado en
el B. subtilis como
aditivo para pollos de
engorda con un
contenido mínimo de 1 x
107, y uno máximo de 5
x 107 UFC/kg en dieta
completa. B. Subtilis; es
una especie con
evaluación QPS
(Qualified Presumption
of Safety) por la EFSA
por la sensibilidad a
antibióticos y la ausencia
de potencial toxigénico,
lo que es considerado
aditivo seguro para
aves, para el
consumidor y para el
medio ambiente.
En estudios recientes
han mostrado que
utilizando el B. subtilis
como pro biótico en
gallinas ponedoras (Hy-
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Line Brown) de 28
semanas de edad, puede
favorecer la ganancia
productiva mejorando
de manera efectiva su
rendimiento y la calidad
a través de la reducción
de E. coli fecal y la
modulación de la
microbiota cecal,
mediante el uso de B.
subtilis como pro
biótico; encontrando
que la alimentación en
relación con la
producción de huevo
disminuye de manera
importante, mejorando
además la resistencia de
la cáscara del huevo.
El Bacillus Reino:
amyloliquefaciens es Bacteria
una bacteria que se usa Filo:
para la conservación de Firmicutes
alimentos como, por Clase: Bacilos
ejemplo, en el pimiento Orden:
verde tras su recogida. Bacillales
Familia:
La adición de Bacillus Bacillaceae
amyloliquefaciens Género: Bacilo
propicia una mayor Especies: B.
inhibición contra el amyloliquefaciens
patógeno Ecc
(responsable del
deterioro natural), si se
Bacillus compara con el uso
amyloliquefaciens previo de vinagre de
bambú y el Quitosano.

La Bacillus
amyloliquefaciens
promueve al mismo
tiempo la dispersión de
BGP20 y no tiene efectos
negativos sobre la
germinación de esporas
de BGP20 y su vida útil.
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De estudios recientes
corroboran que la
natamicina es
totalmente compatible
con el Bacillus
amyloliquefaciens y
otros antimicrobianos, y
que tiene un gran
potencial en la mejora
de la actividad de control
biológico de algunas
hortalizas.

 Indique 2 metabolitos secundarios aparte de la amilasa que pueden


ser producidos por los microorganismos

Entre los metabolitos secundarios que pueden ser producidos por microorganismos
tenemos la Glucosidasa, la cual es una exoenzima que acorta las cadenas de almidón
en una unidad a partir del extremo no reductor y libera glucosa entre estas, tenemos
la Bacillus Megaterium, Bacillus cereus y Streptomyces.

También, tenemos las Pululanasas, las cuales son enzimas desramificadoras de la


amilopeptina, produciendo una mezcla de dextrinas y pocos azucares, entre ella
tenemos la Clostridium thermodyrosulfurico, Leuconostoc, Enterobacter aerogenes,
Bacillus polymyxa.
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BIBLIOGRAFÍA

Guadarrama, Andrea y otros; OBTENCIÓN DE α-amilasa A PARTIR DE Aspergillus


oryzae, XII Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería, Toluca, Estado de
México Obtenido de:
https://smbb.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-
24.pdf

Quintero, Mónica; (agosto 20 de 2009), PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA


a-AMILASA PRODUCIDA POR LA CEPA NATIVA Bacillus sp. BBM1, Universidad
Nacional de Colombia, Medellín, Colombia, Obtenido de:
https://revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/view/15673/18741

Nootriment, Aspergillus Oryzae: Beneficios para la salud de esta enzima pro biótica,
obtenido de: https://nootriment.com/es/aspergillus-oryzae/

Medina Tarcisio, (15 de febrero de 2017) Bacillus subtilis como probiótico en


avicultura: aspectos relevantes en investigaciones recientes, Departamento de
Ingeniería Agroindustrial. Campus Celaya Salvatierra. Universidad de Guanajuato.
México, obtenido de:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2448-
61322017000300014

Natamycin vgp, (16 de diciembre de 2016) LA INFLUENCIA DE LA NATAMICINA EN


EL BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS (BGP20) PARA LA CONSERVACIÓN DE
ALIMENTOS, Obtenido de: http://www.natamycinvgp.com/es/la-influencia-de-la-
natamicina-en-el-bacillus-amyloliquefaciens-bgp20-para-la-conservacion-de-
alimentos/

Espitia Lady, (11 de enero de 2009), Determinación de la concentración de alfa y beta


amilasas comerciales en la producción de etanol a partir de almidón de cebada
empleando Saccharomyces cervisiae, Bogotá, Colombia, Obtenido de:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis206.pdf

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