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(CICUTA)
*Chiappe, Andrea; Castañeda, Brian; Díaz, Jonnathan; Rodríguez, Diego & Romero, Juan Manuel
Corporación Tecnológica de Bogotá
Carrera 21 No. 53 D – 35, Bogotá Colombia
Tecnología en Regencia de Farmacia
*Docente asesora en la investigación
Resumen
Esta investigación se divide en tres partes principales, las cuales son esenciales en el proceso de una marcha fitoquimica
preliminar convencional: Extracción, identificación y separación cromatografica de los metabolitos secundarios. En la
primera parte (extracción de metabolitos) se hizo el correspondiente secado y macerado de las partes aéreas de las
planta (hojas y flores), por otro lado con el material seco se extrajeron el aceite esencial por el método de arrastre por
vapor y el extracto etanólico con el método Soxhlet. El aceite esencial no se obtuvo. En la segunda parte se efectuó la
identificación de metabolitos secundarios por medio de pruebas específicas para cada grupo dependiendo de sus
características químicas y estructurales. La preparación de las muestras se hizo con una disolución de la goma en etanol
y éter de petróleo. A cada muestra se le agrego un reactivo que determinaba la presencia de un tipo de metabolito en
particular. Se encontró la presencia de alcaloides en las raíces, hojas, semillas y frutos; presencia de Flavonoides en la
corteza y Cumarinas en los frutos, presencia de Carotenoides en las flores, presencia de compuestos parecidos a los
cardiotónicos (tremetona) en las hojas y presencia de esteroides (estigmasterol y β-citosterol) en las hojas. Por último, se
probaron varias mezclas de solventes (polares y apolares), a diferentes proporciones para determinar cuál de ellos corría
mejor con una muestra del extracto etánolico de la especie vegetal “Conium Maculatum L.” en cromatografía en capa
fina (TLC). Se determinó que el mejor solvente fue la mezcla entre Acetato de Isopropilo y cloroformo (1:1).
Palabras claves: marcha fitoquimica, metabolitos secundarios, muestra vegetal, cromatografía en capa fina, cicuta,
quimiotaxonomía y partes aéreas.
Abstract
This research is divided into three main parts, which are essential in the process of a conventional preliminary
phytochemical up : Extraction, chromatographic separation and identification of secondary metabolites . In the first part
(extraction of metabolites) and the corresponding macerated dried aerial parts of the plant (leaves and flowers) , on the
other hand with the dry material was the essential oil is extracted by steam drive method and ethanol extract with
Soxhlet method. The essential oil was not obtained . Identification of secondary metabolites was carried out by specific
tests for each group depending on their chemical and structural features in the second half. The sample preparation was
done with a solution of gum in ethanol and petroleum ether. To each sample was added a reagent which determined the
presence of a particular type of metabolite . The presence of alkaloids in the roots , leaves, seeds and fruits was found ;
Flavonoids present in the cortex and the fruits Coumarins , carotenoids present in the flowers , presence of cardiac -like
compounds ( tremetona ) on the leaves and the presence of steroids (stigmasterol and β - citosterol ) in the leaves. Finally
, various mixtures of solvents ( polar and nonpolar ) at different ratios to determine which one best running with a
sample of the ethanol extract of the plant species " Conium maculatum L. " on thin layer chromatography (TLC ) were
tested . It was determined that the best solvent was the mixture of isopropyl acetate and chloroform (1:1).
Keywords: phytochemical up, secondary metabolites, plant displays, thin layer chromatography, hemlock,
chemotaxonomy and aerial parts.
Introducción
Las reacciones químicas estandarizadas consisten en Figura 3. Estructura general de los esteroides presentes en la
cambios químicos en algún grupo funcional de la especie Conium Maculatum L. (A. Estigmasterol y B. β-sitosterol)
estructura del metabolito, y desde luego, la formación Fuente: Radulovic et al (2011).
de otro compuesto químico que al generar cambio en la
con los reactivos indicados para cada metabolito. (Tabla
2) Para las pruebas de alcaloides se acidificó el extracto
etánolico.
Metabolito Prueba
Reactivos Extracto
secundario química
Extracto
Obtención de aceite esencial Shinoda HCl 10% y Mg
etánolico
Flavonoides
Leucoantociani Extracto
Las muestras vegetales secas se pusieron en un balón HCl 10%
das etánolico
de dos bocas de 100 mL, se utilizo la técnica de arrastre
por vapor, se uso agua para la producción de vapor, se
recogió el aceite obtenido en un enlermeyer de 100 mL. Comportamien
to ante acido y Zinc, HCl [ ] Extracto
Quinonas
donador de (NaOH 40%) etánolico
Obtención de extractos etanólicos. electrones.
Metabolito Prueba Resultad Observacion Para el análisis de taninos en la cicuta los resultados
secundario o es fueron negativos en las tres diferentes pruebas
Carotenoides Salkoski + Formación realizadas, según Valderrama (2002) este tipo de
de
coloración
compuestos en la familia Apiaceae se encuentra en
azul en la plantas forestales y de corteza abundante, la especie
interfase Conium Maculatum L. no posee un volumen de tallo o
Taninos Cloruro férrico - No hubo corteza abundante por lo que la presencia de este tipo
reacción
de metabolitos queda descartada.
Acetato de plomo - No hubo
reacción
HO OH
Gelatina – sal - No hubo HO OH
- 2-
reacción Fe (OR)
+ 3HCl
+ FeCl3
Flavonoides Shinoda - Coloración
OH
amarilla. No OH
hubo
reacción.
Leucoantiocianidi - Coloración
Prueba del cloruro férrico
nas amarilla. No
hubo
reacción
- -
HO O HO O
O O
n n
Figura 8. Prueba de Shinoda
Figura 5. Prueba del acetato de plomo
Los resultados para las Cumarinas fueron negativos en
- - - - - - -
OH
R CO NH R CO NH R``
puente de hidrogeno
las diferentes pruebas. Según Larsson (2004) en la
OH
O
-
-
Conium Maculatum L. se ha evidenciado la presencia de
O
- - - - - - - furano Cumarinas lineales, pero su lugar de biosíntesis y
HO CO 2 + R CO NH R CO NH R``
acumulación no ha sido bien identificado. Se dice que su
HO CO 2
OH
HO
HO
OH
concentración se da primordialmente en las frutas.
-
CO 2 -
CO 2
CH3
++
Los resultados para los metabolitos de tipo cardiotónico
+
+ 2H /Zn + Zn fueron positivos en las dos pruebas realizadas, sin
O OH embargo, en la literatura no se reporta presencia de
estos metabolitos en las hojas de la Conium Maculatum
Figura 7. Comportamiento ante acido y donador de electrones
L.
Los resultados de las pruebas para la detección de OH OH
OH
Flavonoides dieron negativo, según Larsson (2004) la H OH
+ OH
O
H OH
familia Apiaceae presenta tejidos que son H OH
H2SO4
OH
O
O
OH
O
estos se encuentran mayoritariamente en la corteza. No
se encuentra una caracterización fiable en donde se
detalle la presencia de este tipo de compuestos en la Figura 11. Prueba de Molish
especie Conium Maculatum L.
La identificación de esteroides fue positiva mediante la (2010) se encuentra presente en las semillas, con lo que
reacción de Lieberman-Burchard. El cambio a color podemos confirmar que el resultado negativo es
verde fue inmediato, después de pasados 5 minutos se verdadero al solo usar las hojas para el análisis. Vetter
siguió la misma tendencia. Según Radulovic et al (2011) (2004) reporta que cuando se hacen las pruebas en las
los esteroides predominantes que se encuentran en la raíces y las puntas de los brotes de plantas jóvenes
especie Conium Maculatum L. son el estigmasterol estas indican resultados positivos; en las plantas más
(stigmasta-5,22-dien-3β-ol) y el β-sitosterol (estigmast- maduras estas reacciones positivas tienden a
5-en-3β-ol). Las estructuras de estos compuestos desaparecer, como en nuestro caso. Las reacciones
pueden ser detallados en la Figura 3. Según Rodríguez positivas se muestran en las frutas sólo por conductos
(1999) el mecanismo de reacción para esta prueba no secretores. Corsi y Biasci (1998) sugieren que la Conium
ha sido descubierto. Maculatum L. es similar a otros miembros de la familia
Apiaceae, que tiene conductos secretores en órganos
- -
HgCl 2 + 2I -------2 Cl + HgI 2 vegetativos y frutas. Las concentraciones y las
PRECIPITADO ROJO proporciones relativas de los diferentes alcaloides en la
Conium Maculatum L parecen depender de diferentes
- 2-
HgI 2 + I ------- HgI 4 factores (temperatura, humedad, tiempo y la edad de
los la planta) (Vetter, 2004). Las fases de floración,
COMPLEJO DE COLOR PARDO
polinización y fertilización muestran un cambio brusco
en la distribución de alcaloides. La y-coniceina es el
componente alcaloide predominante durante la época
Hg
de lluvias y la coniina predomina durante el período
O NH 2I seco. El contenido de y-coniceina disminuye y el
Hg contenido de coniina aumenta notablemente durante la
COLOR AMARILLO INTENSO fase de maduración de la fruta (Fairbairn y Challen,
Figura 12. Reacción general para la identificación de alcaloides.
1959). En el caso de las hojas se dice que en las plantas
jóvenes (es decir, en la fase del crecimiento activo) la y-
La cicuta es una planta que está compuesta coniceina es el componente principal alcaloide, con
mayoritariamente por alcaloides. Los resultados para pequeñas cantidades de conhidrina. Vetter (2004) nos
este tipo de metabolito secundario fueron negativos en dice que la mayoría de las plantas de la familia Apiaceae
todas las diferentes pruebas efectuadas. Frente a esto, producen diferentes aceites volátiles en los tejidos
Farnsworth (1966) informa que si hay presencia de un claramente delimitados de los frutos. Se sabe que la
compuesto alcaloide el cual no tiene el nitrógeno especie Conium Maculatum L. produce y contiene
heterocíclico, si no que más bien es un protoalcaloide alcaloides de piperidina pero la síntesis y los sitios de
las pruebas especificas darán falsos negativos. De igual acumulación aún no se han identificado de manera
manera ocurre con los compuestos que tienen un grupo inequívoca. Por tanto, no se puede establecer la
oxigeno enlazado con el nitrógeno. Al observar la figura verdadera presencia de estos en las hojas de la planta.
2, en donde se detallan los diferentes alcaloides Cabe resaltar que se dice que estos compuestos se
reportados en la cicuta se puede detallar como este encuentran mayoritariamente en los aceites esenciales.
postulado no se cumple en nuestro caso en particular, López et al (1999) reporta que el contenido promedio
debido a que la mayoría de estos compuestos son de alcaloides en las hojas va de un 0,5% a un 1,5%. Al
alcaloides verdaderos, que si pueden ser fácilmente igual se puede resaltar malos procedimientos al
detectados por las pruebas de reconocimiento. Para efectuar las pruebas de identificación, o
determinar las posibles causas de estos falsos negativos sobrecalentamiento del extracto, lo cual daña los
se tuvieron que mirar otras características y aspectos de metabolitos secundarios termolábiles.
la planta. Entre ellos, la concentración de estos
alcaloides en las diferentes partes de la planta (cabe Técnicas cromatograficas de separación
resaltar que en nuestros experimentos solo se usaron Solvente apolar (A) Solvente polar (P) Proporción (A:P)
las hojas y alguna que otra flor) y la concentración de Éter de petróleo Etanol 7:3
metabolitos secundarios dependiendo del tiempo Cloroformo Acetato de 1:1
vegetativo o de crecimiento de la planta. Isopropilo
Tolueno Etanol 3:7
La especie Conium Maculatum presenta la presencia del Tabla 4. Mezcla de solventes (apolares y polares) y
alcaloide coniina, este compuesto según Gonzales proporciones utilizadas en la práctica.
La selección de cloroformo (apolar/polar) y acetato de
isopropilo (polar) en una proporción 1:1, como fase
móvil, permitió una mejor separación de cada uno de
los compuestos presentes en el extracto etanólico de la
Conium Maculatum (Figura 13), hecho que al ser
comparado con la fase móvil sugerida por Rodríguez
(1997) es aproximado, ya que en la literatura sugiere
como fase móvil cloroformo y etanol o
hexanocloroformo y Dietilamina al 0.05% en una
proporción 3:7 cuando la fase estacionaria es una placa
Figura 13. Recorrido de la muestra del extracto etánolico y la
de alúmina, con el objetivo de separar alcaloides que es
tinta china en las diferentes mezclad de solventes. 1. Éter de
el blanco de la investigación de la planta. Al observar las
petróleo:Etanol (7:3); 2. Cloroformo:Acetato de Isopropilo
proporciones que se sugieren, la fracción polar es (1:1) y 3. Tolueno:Etanol (3:7).
mayor que la apolar, siendo en este punto donde se
clarifica la razón por la cual la separación no fue optima; Al observar la fase móvil utilizada (Alúmina) se puede
ya que la proporción escogida en la práctica fue de 1:1. decir que no es la adecuada para la separación de
compuestos que contienen un grupo Amina (alcaloides)
De otro lado, Baerheim-Svendsen recomienda que para ya que debido a que según UAM esta es útil para la
separar los alcaloides de la cicuta por cromatografía se separación de compuestos apolares tales como
debe emplear como solvente Cloroformo-etanol hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y
absoluto y amonio 25% (18:2:2) con platos de silica gel cetonas. De esta manera la literatura recomienda que
activa. Stahl (2007) recomienda el uso de acetona, para la separación de compuestos aminados se debe
dietil éter y amonio concentrado (50:50:3) y silica gel usar la Silice-gel como fase estacionaria ya que retiene
para la separación de los alcaloides de la cicuta y la con más fuerza sustancias más polares. Este proceso se
identificación de la arecolina. da debido a las interacciones intermoleculares de tipo
dipolo-dipolo o enlaces de hidrogeno entre el soluto y el
Ahora bien, la mayoría de metabolitos encontrados en
adsorbente, de este modo a medida que corre la fase
la cicuta son alcaloides piperidinicos, los cuales pueden
móvil va arrastrando al compuesto y este va siendo
ser identificados con la mezcla de solventes descrita
retenido por dichas interacciones con la fase
anteriormente. (Hui, 1997). Los alcaloides piperidinicos
estacionaria, en este caso la alúmina, cada metabolito o
pueden ser resueltos en TLC de silica gel eluido con
sustancia tiene un tiempo de retención especifico.
cloroformo y etanol (7:3) y visualizados con el reactivo
de Dragendorff. La Gamma Coniceina (Figura 2) puede Cabe resaltar que nuestro extracto etanólico no estaba
ser determinada en presencia de otras piperidinas por bien concentrado, es decir, no tenía una cantidad
reacción con nitroprusiato de sodio. (Hui, 1997). suficiente de metabolitos secundarios como para hacer
una corrida eficaz. Esta variable pudo ser la que más
Al no ser óptimamente separados los compuestos
infirió en los resultados poco concluyentes de la
presentes en el extracto etanólico, se creó un conflicto
práctica. No obstante, se pudo evidenciar que si hubo
entre cada uno de los compuestos, puesto que están
una corrida en las placas, pero que estas no estaban
superpuestos creando impedimentos que dificultan la
resultas de forma tal que pudieran dar una correcta
reacción, por lo cual al momento de ser revelados con
separación e identificación del compuesto en particular.
vainillina-ácido fosfórico, revelador indicado para
cetonas, no mostro la coloración que cita el autor como Conclusiones
positiva, que es rosa, las cuales si se encuentran en los
esteroides, compuestos presentes en la especie Conium Se realizó una marcha fitoquimica preliminar que
Maculatum L. (estigmasterol (stigmasta-5,22-dien-3β- comprendió tres etapas: extracción, identificación y
ol) y el β-sitosterol (estigmast-5-en-3β-ol)). separación cromatografía de los metabolitos
secundarios de las partes aéreas de la especie Conium
Los reveladores adecuados para la identificación de
Maculatum L., ante esto se concluyó lo siguiente:
alcaloides son: Disolución de yodoplatinico en yoduro
de potasio, o reactivo de Dragendorff o permanganato
- Se pudo determinar que el mejor método para
de potasio-bicarbonato de sodio, para tal objetivo. Por
la obtención de extracto etanólico es el método
lo cual no fue posible identificar los alcaloides,
de soxhlet, ya que es una técnica exhaustiva
metabolitos que más se encuentran en la planta.
que requiere poca cantidad de reactivo, menos
tiempo para la extracción y genera un
rendimiento notable. - Al no tener una separación adecuada de los
metabolitos en la placa cromatografica no se
- La extracción de aceites esenciales por arrastre puede establecer una identificación clara de los
con vapor de agua demostró ser una técnica compuestos hallados en la cicuta.
que se ve afectada por dos factores en general:
la cantidad de muestra vegetal y la trituración Referencias
de la misma.
- Baerheim-Svendsen, R. & Verpoorte. (1983).
- Se determinó mediante pruebas positivas y Chromatography of alkaloids, part A: thin-layer
especificas que la composición de metabolitos chromatography. Nueva York, USA: ELSEVIER
secundarios en las hojas de la especie Conium SCIENTIFIC PUBLISHING COMPANY. Pp. 61- 62.
Maculatum L. es la siguiente: Carotenoides (en
- Corsi, G. & Biasci, D. (1998). Secretory structures
las flores), cardiotónicos, quinonas y esteroides.
and localisation of alkaloids in Conium
Aunque la literatura no justifica la presencia de
maculatum L. (Apiaceae). Annals of Botany
estos metabolitos (excepto los esteroides).
(81). pp. 157–162.
- Fairbairn, W., Suwal, N., 1961. The alkaloids of
- Se determinó que la presencia de los diferentes
hemlock (Conium maculatum L.) II. Evidence for
metabolitos secundarios (en especial alcaloides)
a rapid turnover of the major alkaloids.
reportados por la literatura no se encuentran en
Phytochemistry (1). pp. 38–46.}
su totalidad en las hojas, si no que esto
- Farnsworth, N. (1966). Biological and
depende de los sitios de biosíntesis y
Phytochemical Screening of Plants. Journal of
acumulación. Al igual también son factores
pharmaceutical sciences. Volumen (55). pp. 225
importantes el clima, la temperatura, la
– 269.
humedad y en particular el tiempo de
- Fonnegra, R. Jiménez, S.L., (2007). Plantas
crecimiento. Aunque se reporta que la cicuta
medicinales aprobadas en Colombia (2 edición).
tiene gran cantidad de alcaloides en su
Medellín Colombia: editorial universidad de
composición, cabe aclarar que las reacciones
Antioquia. pp. 7.
positivas de identificación tienden a
- Garland, T. & Barey A. (1996). Toxic Plants and
desaparecer al madurar la planta.
other natural toxicants. Washington, USA: CAB
INTERNATIONAL. pp. 418 -422.
- Se logró determinar a partir de las pruebas
- González, G. (2010) Plantas tóxicas de
específicas de identificación y la literatura la
importancia en salud y producción animal en
quimiotaxonomía general de la especie Conium
Colombia. Bogotá, Colombia: Editorial de la
Maculatum L., en la que se encuentra:
Universidad Nacional de Colombia.
Presencia de alcaloides en las raíces, hojas,
- Hui, Y.H., Smith, R.A. & Spoerke, D.G. (2001)
semillas y frutos; presencia de Flavonoides en la
Foodborne Disease Handbook, Second Edition,:
corteza y Cumarinas en los frutos, presencia de
Volume 3: Plant Toxicant. (2ª edición). Basel,
Carotenoides en las flores, presencia de
Suiza: Marcel Dekker. pp. 357 – 359.
compuestos parecidos a los cardiotónicos
- Larsson, T (2004) Some history and effects of
(tremetona) en las hojas y presencia de
Conium Maculatum L. Estocolmo, Suecia:
esteroides (estigmasterol y β-citosterol) en las
Uppsala Universit.
hojas. Las quinonas no son justificadas debido a
- López, A. Cid, S. & Bianchini, L. (1999).
que no hay una fuente confiable que confirme
Biochemistry of hemlock (Conium maculatum L.)
su presencia en este tipo de plantas.
alkaloids and their acute and chronic toxicity in
livestock. A review. Toxicon 37, 841–865.
- Se determinó que los compuestos que pudieron - Núñez C.E. (2008) Extracciones con equipo
posiblemente correr sobre la fase estacionaria Soxhlet. Fuente:
son el estigmasterol (stigmasta-5,22-dien-3β-ol) http://www.cenunez.com.ar/archivos/39-
y el β-sitosterol (estigmast-5-en-3β-ol)), debido extraccinconequiposoxhlet.pdf
en parte al grupo cetona presente en su - Olaya, M.J. & Méndez J. (2003) Guía de plantas
estructura, que según la literatura corre con el y productos medicinales. (ed.) Bogotá,
tipo de solventes y fase estacionaria utilizados. Colombia: Convenio Andrés Bello. pp. 17 – 18.
- Rodríguez R.M. (1997) Análisis fitoquímico
preliminar. Armenia, Colombia: Universidad del
Quindío.
- Rosa Tundisa, Marco Bonesia, Brigitte Deguinb,
Monica R. Loizzoa, Federica Menichinia,
Filomena Confortia, François Tillequinb and
Francesco Menichinia (2009). “Cytotoxic activity
and inhibitory effect on nitric oxide production
of triterpene saponins from the roots
of Physospermum verticillatum (Waldst & Kit)
(Apiaceae)”. Bioorganic & Medicinal Chemistry.
Pag 17.
- Radulovic, N & Nevenka D. (2011). Steroids from
poison hemlock (Conium maculatum L.): a GC–
MS analysis. Journal of the SerbianChemical
Society. Volumen (11). pp. 1471 -1483.
- San Andrés, M.I, Jurado, R. & Ballesteros E.
(2000). Toxicología Animal provocada por
plantas. Madrid, España: Editorial Complutense.
pp. 233.
- Satyajit, D., Latif S. & Gray A. (2006). Natural
Products Isolation. (2a Edición) Totowa, New
Yersey: Editorial Humana Press. pp. 33 – 34.
- Stahl, E. & Schmitt, W. (1975). Archives
Pharmaceutical. Weinheim. pp. 570.
- Skoog, D.A. et al (2001). Fundamentos de
química analítica (volumen 2) (4 edición).
Barcelona, España: editorial reverte. pp. 782.
- UNIVERIDAD AUTONOMA DE MÉXICO. FUENTE:
http://www.uam.es/docencia/jppid/documento
s/practicas/actuales/guion-p6.pdf.
- Valcárcel, C.A. (1988). Técnicas analíticas de
separación. (1 edición). Barcelona, España:
editorial reverte. pp. 214-215.
- Valderrama, J. (2002) “Centro de Informacion
Tecnologica” Edicion 73 Vol 13. Pag 40.
- Vetter, J. (2004). Poison Hemlock (Conium
Maculatum L.) Food and chemical toxity.
Volumen (42) pp. 1373 – 1382.