Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
56T00229 PDF
56T00229 PDF
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
TESIS DE GRADO
PREVIA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR
RIOBAMBA – ECUADOR
2010
-1-
CAPÍTULO I
1. MARCO TEÓRICO
1.1 FITOTERAPIA
El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que se ha
utilizado desde tiempo inmemorial. Durante mucho tiempo los remedios naturales, y
sobre todo las plantas medicinales, fueron el principal e incluso el único recurso de que
disponían los médicos. Esto hizo que se profundizara en el conocimiento de las especies
vegetales que poseen propiedades medicinales y ampliar su experiencia en el empleo de
los productos que de ellas se extraen. (29) (32)
No debemos olvidar que los remedios a base de plantas medicinales presentan una
inmensa ventaja con respecto a los tratamientos químicos. En las plantas los principios
activos se hallan siempre biológicamente equilibrados por la presencia de sustancias
complementarias, que van a potenciarse entre sí, de forma que en general no se acumulan
en el organismo, y sus efectos indeseables están limitados. Sin embargo, a pesar de que
han aumentado las investigaciones y estudios científicos de las plantas medicinales,
todavía no se conocen muchos de los principios activos a los que deben las plantas sus
extraordinarias cualidades. (28) (32) (39)
-2-
Comprende una serie de determinaciones para establecer los diferentes tipos de actividad
terapéutica de la droga. A partir de los conocimientos ancestrales de las plantas la ciencia
comenzaría a investigar las virtudes terapéuticas aprovechables de la plantas, averiguar
su composición química y separar sus distintos principios activos. (4) (28)
La actividad biológica de una planta depende en primer lugar del principio o principios
activos mayoritarios que contiene, pero éstos suelen estar acompañados de otros
principios que potencian o modulan la acción de los primeros; la proporción en la que se
encuentran unos de otros es muy variable.
Una vez separados los principios activos y realizadas con éxito las pruebas pertinentes,
los científicos aceptan que esa planta puede ser aplicada con finalidad curativa. (4)
La actividad biocida se define como: “La capacidad que posee un fármaco o compuesto
natural de inhibir el crecimiento de microorganismos”. Generalmente los compuestos que
poseen dicha actividad vienen a tener un gran interés a nivel mundial, ya que con ellos se
puede controlar y hasta eliminar las infecciones provocadas por los microorganismos. (4)
Son aquellos remedios procedentes del mundo vegetal que son capaces de inhibir el
crecimiento de microorganismos o de eliminarlos. Son aquellos remedios naturales que
pueden ser capaces de evitar o curar muchas enfermedades. (9)
Ajo: ( Allium sativum) Sin duda alguna el mejor bactericida y antiviral natural. Contiene
más de 20 componentes con propiedades antivirales y casi 40 componentes
antibacterianos (Aliicina, ácido cafeico, ácido ascórbico, ácido clorogénico, quercetina,
etc.) Todo ello lo hace ideal para el tratamiento interno de enfermedades respiratorias y
del aparato excretor. Usado externamente, sirve para desinfectar y prevenir infecciones
en las heridas. (9)
Cebolla: ( Allium cepa) De la misma familia que el ajo y con una composición similar la
cebolla constituye otro antibiótico natural. Rica también en componentes sulfurados,
ácidos y flavonoides es uno de los mejores remedios naturales para combatir procesos
infecciosos del aparato respiratorio (gripe, bronquitis, faringitis, etc.) Usada
externamente, se considera un buen desinfectante. (9)
Tomillo (Thymus vulgaris) Son fundamentalmente los ácidos que contiene esta planta los
que le proporcionan propiedades antivirales. El tomillo es un fuerte antibacteriano.
Usada externamente es un potente desinfectante y ayuda a cicatrizar las heridas. (9)
Menta: ( Mentha ssp. ) Las mentas también son muy ricas en principios antibacterianos,
especialmente indicadas para prevenir putrefacciones intestinales. (9)
Tila: ( Tilia sp.) La tila posee propiedades antivirales y antibacterianas capaces de inhibir
el crecimiento de virus y bacterias, por lo que resulta muy útil su administración durante
los periodos en que el organismo se ve obligado a luchar contra las infecciones. En este
sentido se puede considerar esta planta como un buen antibiótico natural. (9)
1.5.1 HISTORIA
El romero es una de las especies aromáticas que mayor predicamento ha tenido desde
tiempos remotos, merced a sus propiedades medicinales, comestibles y aromatizantes.
El romero fue introducido a través de los Alpes por los primeros monjes cristianos,
siendo muy popular en los jardines monásticos. Se solía esparcir sobre los cajones y
roperos para alejar las polillas. (10) (11) (22)
En la antigua Roma se empleaba para adornar los relicarios de los espíritus protectores
del hogar.
-5-
En Atenas se solía colocar las ramas de romero sobre las manos de los fallecidos, como
símbolo de la inmortalidad del alma. Los jóvenes colocaban ramas entrelazadas en el
pelo para estimular la memoria y el resto de actividades mentales. (11)
Por otra parte, el romero se esparcía en las habitaciones de los enfermos como
desinfectante aromático. También se lo empleó para decorar las habitaciones en las
festividades navideñas. El aceite esencial fue obtenido por destilación por primera vez en
1330 gracias a las investigaciones de Ramón Llull. A partir de entonces fue muy popular
como ingrediente en perfumería. Entre 1820 y 1950 estuvo inscripto en la Farmacopea de
los Estados Unidos. (22) (27)
El romero, es una especie del género Rosmarinus cuyo hábitat natural es la región
mediterránea, sur de Europa, norte de África y también Asia Menor. En España se halla
en la mayor parte de Cataluña, hasta los Pirineos en Aragón y Navarra, Castilla-La
Mancha, Castilla-León, La Rioja, Madrid, Murcia, Extremadura, en las zonas
montañosas de la Comunidad Valenciana, Andalucía e islas Baleares. Es muy poco
frecuente en puntos del norte o noroeste de la península. (10) (40)
Se cría en todo tipo de suelos, preferiblemente los áridos, secos y algo arenosos y
permeables, adaptándose muy bien a los suelos pobres. Crece en zonas litorales y de
montaña baja (laderas y collados). A más altura, da menor rendimiento en la producción
de aceite esencial. Forma parte de los matorrales que se desarrollan en los sitios secos y
soleados en las zonas de encinar, zonas degradadas por la tala o quema y laderas
pedregosas y erosionadas. Florece dos veces al año, en primavera y en otoño. (10)
REINO: Plantae
SUBREINO: Tracheobionta
DIVISIÓN: Magnoliophyta
CLASE: Magnoliopsida
ORDEN: Lamiales
FAMILIA: Lamiaceae
SUBFAMILIA: Nepetoideae
GÉNERO: Rosmarinus
ESPECIE: Officinalis
El romero es un arbusto leñoso de hojas perennes muy ramificado, puede llegar a medir 2
metros de altura. Lo encontramos de color verde todo el año, con tallos jóvenes borrosos
(aunque la borra se pierde al crecer) y tallos añosos de color rojizo y con la corteza
resquebrajada. (9) (43)
Las hojas, pequeñas y muy abundantes, presentan forma linear. Son opuestas, sésiles,
enteras, con los bordes hacia abajo y de un color verde oscuro, mientras que por el envés
presentan un color blanquecino y están cubiertas de vellosidad. En la zona de unión de la
hoja con el tallo nacen los ramilletes floríferos. (7)
Las flores son de unos 5 mm de largo. Tienen la corola bilabiada de una sola pieza. El
color es azul violeta pálido, rosa o blanco, con cáliz verde o algo rojizo, también
bilabiado y acampanado. Son flores axilares, muy aromáticas y melíferas (contienen
miel), se localizan en la cima de las ramas, tienen dos estambres encorvados soldados a la
corola y con un pequeño diente. (7) (43)
El fruto, encerrado en el fondo del cáliz, está formado por cuatro pequeñas nuececitas
trasovadas, en tetraquenio, de color parduzco.
Floración: En zonas templadas, prácticamente todo el año. En zonas frías, de finales del
invierno a mediados de otoño. (7)
-7-
Rica en principios activos que ejercen su acción sobre numerosos órganos como:
analgésica, antidiarreico, antirreumática, astringente, sudorífico, cicatrizante, tónico,
estimulante, diurético, colagogo, estomacal. (48) (52)
La esencia sola se utiliza también para preparar el alcohol de romero, con el que se
realizan fricciones en zonas doloridas. Efectos secundarios y contraindicaciones; se
considera que el principio activo del romero carece de toxicidad; sin embargo, las
-10-
Asimismo, no es recomendable que las personas con cálculos biliares recurran a esta
droga sin consultar previamente con un médico. Esto es debido a que cuando existe
litiasis biliar, un aumento del drenaje de la vesícula biliar puede ir acompañado de una
obstrucción de los conductos biliares. Finalmente, aunque la probabilidad de presentar
una intoxicación por el consumo de infusiones de romero es muy baja, una sobredosis
podría derivar en un cuadro caracterizado por espasmo abdominal, vómitos,
gastroenteritis, hemorragia uterina e irritación renal.
En cuanto al uso del aceite esencial, en concentraciones elevadas puede ser tóxico para el
sistema nervioso central y provocar convulsiones. Por este motivo, no se recomienda su
uso durante períodos de tiempo prolongados o a dosis mayores a las recomendadas y se
debe tener especial cuidado cuando se usa en niños. Por vía tópica, la esencia de romero
puede causar dermatitis y eritema en personas hipersensibles. (11)
En todos los casos la actividad antioxidativa de dos de sus componentes, carnosol y ácido
ursólico, serían los responsables del mencionado efecto antimicrobiano.
Se ha realizado estudios de la eficacia de un extracto etanólico de romero contra
Staphylococcus aureus en dos modelos de infección en piel de ratón, como por ejemplo
infecciones producidas en heridas quirúrgicas. Los resultados evidenciaron la acción
bacteriostática del extracto de R. officinalis que contiene 4,6 % de polifenoles activos
contra la bacteria patógena S. aureus en la infección presente en la piel de ratón. (7)
(11)
1.6.1 HISTORIA:
El uso del tomillo data de tiempos muy antiguos. Los egipcios lo empleaban como una de
las sustancias aplicadas en los procesos de momificación. El nombre Thymus proviene
del griego thumus que significa fuerza o coraje, ya que se empleaba principalmente como
infusión energizante y como antiséptico de heridas de guerreros. Esta nomenclatura fue
empleada por Teofrasto para designar tanto al tomillo como a la ajedrea. Se la
recomendaba como antídoto para las mordeduras de serpientes. El propio Carlo Magno
ordenó su cultivo en todos los jardines para aprovechar tanto sus propiedades
medicinales como culinarias. (42) (44)
.
FOTOGRAFÍA No. 2 TOMILLO, Thymus vulgaris.
-13-
Crece espontáneo por todo el sur de Europa, donde se reproduce bien, ya sea por semillas
o, más frecuentemente por división de las matas en primavera. Prefiere los terrenos
ligeros y pedregosos, y cuando es cultivado, requiere riegos repetidos durante los calores
excesivos. (42) (44)
Clasificación científica:
REINO: Plantae
DIVISIÓN: Magnoliophyta
CLASE: Magnoliopsida
ORDEN: Lamiales
FAMILIA: Lamiaceae
GÉNERO: Thymus
Aceite esencial (0,8- 2,5 %): Presenta fundamentalmente timol (40%), p- cimeno (15 –
50%), alcanfor (11 – 16%), carvacrol (2.5 – 14.6 %), linalol (4%), 1,8- cineol (3%), γ-
terpineno (1-5%), borneol, acetato de bornilo, acetato de linalino, geraniol, α y β- pineno,
limoneno.
El rendimiento porcentual de aceite esencial del tomillo varía al método utilizado para su
extracción ya sea por destilación con agua, destilación con vapor de agua o la
combinación de ambas. (7)
Otros: taninos (7-10%), serpilina (principio amargo), saponinas ácidas y neutras, ácido
labiático, oleanólico y ursólico (1,5%), ácidos fenilcarboxílicos (clorogénico y cafeico),
ácido rosmarínico (1%), ácido litospérmico, resinas. (7)
-15-
Aún cuando no se conocían los antibióticos, el tomillo era considerado como un eficaz
desinfectante. Actualmente, está comprobado que sus componentes fenólicos, timol y
carvacrol, tienen actividad antibacteriana frente a gérmenes gran positivos y gran
negativos. Este efecto se debe a su acción sobre la membrana bacteriana. Además tiene
acción anti fúngica (eficaz contra Candida albicans) y antivírica. (7)
El agente activo del tomillo (Thymus vulgaris) es el timol que se caracteriza por su poder
desinfectante y fungicida. Por su sabor agradable está presente en la formulación de
diversos enjuagues bucales, pastas de dientes, etc. Una disolución de 5% de timol en
etanol se utiliza para la desinfección dermal y contra infecciones con hongos. (7)
Al eliminarse por vía respiratoria y renal, el tomillo produce efecto antiséptico en el árbol
respiratorio y en las vías urinarias. (7)
Frente a S aureus y Helicobacter pylori resultó activo in vitro el extracto acuoso de las
hojas de tomillo. Así como la propiedad inhibitoria del aceite esencial frente a
Listeria monocytogens (7)
La acción espasmolítica se debe al timol ya al carvacrol del aceite esencial, que se cree
tienen la capacidad de inhibir la disponibilidad del calcio, con lo que podrían bloquear la
conducción nerviosa. Poe otro lado, se ha comprobado que la acción de los flavonoides
derivados del luteol potencia la acción espasmolítica de los fenoles, actuando sobre todo
en la tráquea. (7)
El aceite esencial de Tomillo actúa como tónico nervioso, y en forma similar al romero
estimula el cerebro y la memoria por lo que resulta útil en casos de fatiga o debilidad. La
acción primaria del aceite esencial de Tomillo es sobre el tracto genito-urinario y sobre
las vías respiratorias compartiendo incluso propiedades antisépticas con el eucalipto. El
aceite esencial posee timol, carvacrol, γ-Terpineno, ρ-Cimeno. (2)
Las cenizas solubles en agua es aquella parte de las cenizas totales que se disuelven en
agua y las ácido insolubles, el residuo que se obtiene después de la disolución de las
cenizas totales en ácido clorhídrico al 10%. (57)
-18-
1.7.2 HUMEDAD
Es por ello, que los límites en el contenido de agua debe ser determinado para las drogas
vegetales, especialmente para aquellas que absorben fácilmente la humedad o en las
cuales el deterioro puede ser promovido por la presencia de un exceso de agua. (57)
Los principales activos contenidos en las plantas pueden ser extraídos mediante diversas
técnicas extractivas o bien pueden ser administrados como tales, tal y como se
encuentran en la planta desecada o en la planta fresca. (19)(35)
- La cantidad de agua. Cuanto mayor sea la cantidad de agua, más elevado será el
agotamiento de los principios activos dentro de la planta.
- Las influencias que entre unos y otros principios activos pueden ocurrir, una vez
en solución den lugar a una mayor solubilidad o menor en otros casos.
- La temperatura. La infusión o el cocimiento a una temperatura cercana a los
100ºC favorece la extracción. No obstante, a veces conviene hacer la extracción
con agua fría, ya que puede interesar no extraer determinados principios activos
que solamente pasarían al agua con la ayuda del calor.
- El tiempo. La duración del contacto de la planta con el agua.
- El sistema empleado para la extracción.
- El grado de pulverización de la planta. Aumenta la extracción cuanto más
troceada esté la planta, pero hasta ciertos límites a partir de los cuales pueden
originarse una serie de procesos físicos que dificulten el proceso. (35)
Esta determinación se realiza con cientos de bacterias para minimizar errores. Se mide el
diámetro de la zona de inhibición obtenida por cada una de tales cepas y se grafica dicha
medida frente a la CMI, obteniéndose la línea de regresión o "recta de concordancia" que
proporciona la correspondencia entre las CMI y los diámetros de inhibición.
Clasificación científica:
ORDEN: Eubacteriales
FAMILIA: Micrococacea.
GÉNERO: Staphylococcus.
ESPECIE: aureus.
Prueba Reacción
Coagulasa (+)
Manitol (+)
Catalasa (+)
S. typhimurium al igual que otros patógenos digestivos, induce a las células del huésped a
englobarlos, pero parece algo diferente a la fagocitosis inducida de otros patógenos, ya
descrita. Luego de adherida la bacteria a la superficie celular, se produce un pliegue en la
célula, que la rodea y la introduce en una vesícula de endocitosis. Hay intensa
polimerización de actina en la vecindad y luego de introducida, ésta desaparece. (20)
-26-
ORDEN: Eubateriales.
FAMILIA: Enterobacteriaceae.
GÉNERO: Salmonella.
ESPECIE: typhimurium
Prueba Reacción
Glucosa (+)
Lactosa (-)
Movilidad (+)
Ureasa (-)
FUENTE: MANUAL DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
fermentación acetónica o prueba de Voges Proskauer son positivos. Por último, sus
condiciones óptimas de cultivo son en agar nutritivo a 37 ºC, pH de 7.0, presión osmótica
de 1 atm. (31)
Clasificación científica:
ORDEN: Eubacterales.
FAMILIA: Enterobacteraceae.
GÉNERO: Klebsiella.
ESPECIE: pneumoniae.
Prueba Reacción
Gas glucosa (+)
Producción de H2S (-)
Movilidad (+)
Indol (-)
Ureasa (+)
Citrato (+)
FUENTE: MANUAL DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Suele presentarse como una célula oval levaduriforme de 2 a 4 micras, con paredes finas;
sin embargo, en tejidos infectados también se han identificado formas filamentosas de
longitud variable, con extremos redondos de 3 a 5 micras de diámetro y seudohifas, que
son células alargadas de levadura que permanecen unidas entre sí. (14)
Clasificación científica:
REINO: Hongo
FAMILIA: Cryptococcaceae
GÉNERO: Candida.
ESPECIE: albicans
Prueba Reacción
Pseudohifas (+)
Glucosa (+)
Lactosa (-)
FUENTE: MANUAL DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Clasificación científica:
ORDEN: Eubacteriales.
FAMILIA: Pseudimonadaceae.
GÉNERO: Pseudomonas.
ESPECIE: aeruginosa.
Prueba Reacción
Oxidasa (-)
Movilidad (+)
Catalasa (+)
Ureasa (-)
Maltosa (-)
Lactosa (-)
FUENTE: MANUAL DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
-30-
CAPITULO II
2. PARTE EXPERIMENTAL
- Autoclave
- Balanza de precisión
- Cámara fotográfica
- Computadora
- Estufa de secado
- Incubadora
- Refrigeradora
- Baño María.
- Rotavapor.
- Espectrofotómetro.
- Cajas petri 140 X 15 mm
- Hisopos estériles
- Reverbero eléctrico.
- Asas de platino.
- Mechero.
- Tubos de ensayo.
- Varillas de vidrio.
- Gradilla
- Erlenmeyer 250 mL.
- Bureta 50 mL
- Caja de guantes estériles
- Caja de mascarillas
- Caja de parafilm
- Espátula
- Fundas plásticas de 10 x 15 pulgadas
- Pipetas de 1, 5 y 10 mL
- Piceta
- Pliegos de papel filtro
- Rollos de papel aluminio
- Vasos de precipitación de 100, 250, 500 y 1000 mL.
-32-
2.2.5 REACTIVOS
- Agua destilada.
- Alcohol potable.
- Etanol.
- Hexano.
- Acetona.
- Éter etílico.
- Ácido clorhídrico.
- Ácido nítrico.
- Ácido sulfúrico.
- Peróxido de hidrógeno.
- Suero fisiológico.
- Vainillina.
- Safranina.
- Reactivos para Tamizaje fitoquímico.
- Solución índigo carmín.
- Solución gelatina.
- Caolín.
- Sulfato de estreptomicina.
- Sodio cloruro.
- Amoníaco.
- Los extractos.
- Actividad antibacteriana.
2.5 MÉTODOS
Se observó claramente a ojo descubierto y con una lupa de mano las características
morfológicas que le son propias a las dos plantas motivo de estudio.
Las especies fueron identificadas de acuerdo a la forma de las hojas, tallos y flores.
Principio
Procedimiento
- Después se enfrío los crisoles en un desecador durante media hora como mínimo
al cabo de lo cual se procede a pesar los crisoles en la balanza analítica y se
registró este peso en el cuaderno respectivo.
- Luego se pesó alrededor de 2.5 g de la muestra problema con una aproximación
de 0.1 mg, en el crisol que se encuentra en la balanza analítica. Y se registró el
peso.
- Luego se pasó los crisoles a la plancha precalcinadora y se lo mantuvo allí hasta
que las muestras estén previamente calcinadas.
- Posteriormente se trasladó los crisoles con la muestra previamente calcinada a la
mufla a una temperatura de 550 a 700 ºC por el tiempo de 8 horas como mínimo.
- Luego se sacó los crisoles de la mufla y se los colocó en el desecador por un
tiempo de media hora como mínimo para su enfriamiento.
- Luego se procedió a pesar los crisoles con las cenizas y se registró su peso.
Cálculos
Porcentaje de Ceniza:
Donde:
Principio.
Conocida también como humedad tal como ofrecido (TCO), y consiste en secar la
muestra en la estufa a una temperatura de 70 °C hasta peso constante, el secado tiene una
duración de 24 horas. Esta muestra posteriormente se lleva a la molienda si el caso
requiere el análisis proximal.
Procedimiento.
Cálculos
Donde:
Principio
Procedimiento
Cálculos
Principio
La destilación por arrastre con vapor es una técnica para la separación de sustancias
insolubles en agua y ligeramente volátiles de otros productos no volátiles.
Las sustancias arrastrables con vapor son inmiscibles en agua, tienen presión de vapor
baja y punto de ebullición alto.
-38-
La pureza y el rendimiento del aceite esencial dependerán de la técnica que se utilice para
el aislamiento.
Procedimiento
Principio
Procedimiento
Determinación del color: Se toma un tubo de ensayo bien limpio y seco y se llena hasta
las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observa el color. Se informa los
resultados.
Principio
Procedimiento
Cálculos
D25 = M1 – M / M2- M
Donde:
M1 = peso del picnómetro con la muestra (g).
M2 = peso del picnómetro con el agua (g).
M = peso del picnómetro vacío (g).
-41-
Principio
Sen i ⁄ Sen r = n
Así los refractómetros utilizan como principio de medición, la determinación del ángulo
límite el cual presenta en el campo visual un contraste claro y otro oscuro. La línea de
separación entre ambos campos establece el ángulo límite de la luz incidente.
Procedimiento
- Se coloca sobre el prisma de medición una gota de agua destilada, utilizando para
ello una varilla de vidrio que no tenga cantos agudos.
- Se ajusta el equipo seleccionado la zona del espectro visible que aparece en la
línea límite del campo visual, moviendo el compensador cromático y colocando
la intersección del retículo sobre la línea límite de los campos claro y oscuro.
- Después de haber realizado el ajuste del refractómetro, se coloca una gota de la
muestra de ensayo sobre el prisma de medición.
- Se cierra el termoprisma y se enfoca la luz por medio del espejo, de modo tal que
la misma incida sobre la apertura de entrada del prisma de medición y se proceda
de la misma forma que con el agua.
Cálculos
Se hacen tres lecturas y se calcula el promedio de las mismas. Dos o más lecturas no
deben diferir en más de 0.002.
-42-
Nd 25 = N d t + (t – 25)
Donde:
Nd 25 = índice de refracción a 25 ºC
Ndt = valor leído en la escala del aparato a la temperatura t.
t = valor de la temperatura a que se realiza la medición (ºC)
0.00044 = factor de corrección por grado Celsius.
Los valores se aproximan hasta las milésimas.
Principio
La acidez o la alcalinidad de las soluciones acuosas se caracterizan por el valor del índice
de hidrógeno. El pH es por tanto un índice numérico que se utiliza para expresar la
mayor o menor acidez de una solución en función de los iones hidrógeno.
Procedimiento
Principio
Procedimiento
- 5.0 mL del producto se llevan a una cápsula previamente tarada a 105 ºC.
- Se evapora sobre baño de agua hasta que el residuo esté aparentemente seco.
- Se pasa entonces hacia una estufa y se deja hasta peso constante
(aproximadamente 3 h).
- Se retira la cápsula de la estufa y se coloca en una desecadora hasta que alcance la
temperatura ambiente.
- Para obtener la masa constante entre una pesada y otra se mantendrá un tiempo de
secado de 60 minutos.
Cálculos
St = Pr – P * 100 / V
Donde:
REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN:
A. Ensayo de Baljet
Una alícuota del extracto que se encuentra en alcohol, se evaporó en baño de agua y se re
disolvió en 1 mL de alcohol. En estas condiciones se adicionó 1 mL del reactivo,
considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo.
B. Ensayo de Dragendorff
Para este ensayo, la alícuota del extracto que está disuelta en un solvente orgánico, se
evaporó en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 mL de ácido clorhídrico al 1%
en agua.
Se añadió 3 gotas del reactivo de Dragendorff, si hay opalescencia, turbidez definida ó
precipitado se considera positivo.
C. Ensayo de Mayer.
Para este ensayo, si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente orgánico, este
debe evaporarse en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico
al 1 % en agua. Si el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido
clorhídrico concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez). Con la
solución acuosa se añade una pizca de cloruro de sodio en polvo, agite y filtre. Añada 2 ó
3 gotas de la solución reactiva de Mayer si se observa opalescencia, turbidez definida o
precipitado coposo es positivo.
-45-
D. Ensayo de Wagner
Se parte al igual que en los casos anteriores de la solución ácida, añadiendo 2 ó 3 gotas
del reactivo, clasificando los resultados de la misma forma.
F. Ensayo de Shinoda.
G. Ensayo de Borntrager
H. Ensayo de Kedde
Una alícuota del extracto se mezcló con 1 mL del reactivo y se dejó reposar durante 5 a
10 minutos. Un ensayo positivo es en el que se desarrolla una coloración violácea
persistente durante 1 a 2 horas.
Procedimiento.
Cálculos
% de Taninos = (a-b). equiv. KMnO4. 0,0042
mL de alícuota tomada del extracto
-47-
A partir de los extractos obtenidos de romero y tomillo se realizó una cromatografía con
el fin de identificar flavonoides presentes en los mismos, para ello se emplea como
Sistema de solventes: Acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético glacial: agua
(100:11:11:27), sobre sílica gel – 60, y como revelador una solución de vainillina en
ácido sulfúrico.
MÉTODO DE MITSCHER
Día 1
Día 2
Utilizando una asa esterilizada a la llama y enfriarla se tomó una asada de los
microorganismos ATCC de los tubos inclinados que los contienen y se transfirieron
independientemente a los erlenmeyer codificados.
Los erlenmeyer se incubaron a 37oC por 24 horas.
-49-
Se disolvió 40g de TSA en un litro de agua destilada. Esta cantidad es suficiente para
aproximadamente 100 cajas.
Se realizó una disolución en caliente. Luego se repartió a tubos de ensayo con tapa 150 X
15. Se autoclavaron a 121oC por 15 minutos. Los tubos de ensayo se sacaron del
autoclave y se mantuvieron en baño María a 45oC hasta el momento de usar.
Un víal limpio, seco y estéril, se codifico con el nombre del extracto de la planta. Con
precisión se peso 50 mg del extracto crudo o total y se disolvió en 500 mL DMSO (Se
anoto en el libro de record la cantidad exacta pesada).
La disolución del extracto se puede realizar con la ayuda de ultrasonido. La
concentración final de extracto fue 100000 µg/mL.
Se realizó una disolución al décimo, utilizando tubos de ensayo 100 x 13 limpios, secos y
estériles a los que se añadió 900 µL de DMSO y 100 µL del extracto de la concentración
10000 µg/ml. La concentración final de esta disolución fue 1000 µg/ml.
Se codifico 6 cajas Petri estériles con el nombre del extracto y la concentración final (tres
cajas para la concentración 1000 µg/ml y tres cajas para la concentración 100 µg/ml).
Las cajas Petri una vez solidificado el medio de cultivo que contienen los extractos se
invirtieron y se dejaron a temperatura ambiente por 18-24 horas.
Concentración finales 5000, 2500, 1250, 625, 312.5, 156.2, 78.1 y 39 µg/ml.
Se codificaron 27 cajas petri estériles con el nombre de control estreptomicina y las
concentraciones finales: 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.5, 7.8 y 3.9 µg/ml.
Se pipetearon separadamente 100 µL de las disoluciones de estreptomicina a los tubos de
ensayo que contienen 10 ml de TSA a 45oC. Las concentraciones finales son 500, 250,
125, 62.5, 31.2, 15.5, 7.8 y 3.9 µg/ml respectivamente.
Se mezclaron con la ayuda de un vortex e inmediatamente se pasaron a las cajas Petri
previamente codificadas con el nombre de control de Estreptomicina y de las
concentraciones respectivas.
Las cajas Petri una vez solidificado el medio de cultivo que contiene las diluciones de los
controles de estreptomicina se invirtieron y se dejaron a temperatura ambiente por 18-24
horas.
C. Compuestos Puros
Con precisión se pesó 2.0 mg de muestra pura y se disolvió con 0.2 ml de DMSO en
tobos 100 x 13 limpios, secos y estériles. Concentración final 10000 µg/ml.
-51-
Se codificaron 27 cajas petri con el nombre del extracto puro y las concentraciones
finales 500, 125, 62.5, 31.2, 15.5, 7.8 y 3.9 µg/ml.
Las cajas petri una vez solidificado el medio de cultivo que tiene las diluciones de los
extractos puros se invirtieron y se dejaron a temperatura ambiental por 18-24 horas.
Se debe realizar blanco de reactivos y de DMSO.
Día 3
Las cajas petri preparadas ene el día 2 no deben tener contaminación, si la tienen, se
desechan y se debe repetir su preparación con más cuidado.
Todas las cajas petri se dividieron con marcador en siete partes iguales y se marcaron del
1 al 7.
Todos los erlenmeyer que contienen los microorganismos para el ensayo deben estar
visiblemente turbios y a partir de estos se realizan las siguientes suspensiones en los
tubos con solución salina estéril.
Las suspensiones de los microorganismos deben ser agitadas de tiempo en tiempo para
evitar la sedimentación.
El estriado es más seguro si se lleva a cabo desde el límite de las cajas petri hasta el
centro de la caja sin llegar exactamente al centro.
Si se va a compartir la labor del estriado un investigador debe estriar todas las cajas Petri
con un microorganismo dado.
Cuando todas las cajas Petri hayan sido estriadas con todos los microorganismos se
invierten y se incuban a 37 ºC por 24-48 horas. Se incuban boca abajo para evitar que
gotas de agua condensada puedan caer sobre los microorganismos y dispersen su
crecimiento.
-54-
Día 4 y 5
1. LECTURA DE RESULTADOS
Hay actividad antibiótica cuando no hay crecimiento visible en las cajas rayadas. La
concentración inhibitoria mínima (CIM) es la menor concentración de las diluciones en
la cual no hay crecimiento del microorganismo.
A = Activo
P= Parcialmente Activo
I= Inactivo
Las cajas Petri de control debe tener la apariencia esperada (crecimiento en todas las
líneas en las cajas de control negativo y la potencia apropiada en las cajas de control
positivo de sulfato de estreptomicina), de no ser así, el experimento ha fallado y debe ser
repetido.
CAPÍTULO III
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Estas dos plantas son introducidas una de las cuales es Rosmarinus officinalis y la otra
planta es Thymus vulgaris y ambas pertenecen a la familia las Lamiaceaes.
La cantidad de cenizas totales para el romero y para el tomillo es baja debido a que el
contenido de agua ha disminuido permitiendo que los elementos minerales se encuentren
en mayor concentración según Solís P. 2004 (57).
El estudio del número y tipo de microorganismos nos demuestra que la materia prima
utilizada para los estudios se encuentra dentro de los parámetros establecidos según la
OMS y la FAO
DETERMINACI GRUPO E. E.
ÓN FITOQUÍMICO HIDROALCOHÓ HIDROALCOHÓLI
LICO DE CO DE TOMILLO
ROMERO
Dragendorff Alcaloides + +
Mayer Alcaloides + +
Sudán Aceites y grasas +++ +++
Borntrager Quinonas + +
Lieberman- Triterpenos– + +
Buchard esteroides
Resinas + ++
Fehling Azúcares + +
reductores
Espuma Saponinas + +
Cloruro férrico Fenoles – taninos + ++
Shinoda Flavonoides +++ ++
+++ Muy positivo o evidente. ++ Positivo, + Ligeramente positivo. - Negativo.
También se determinó que los extractos de romero tienen poca evidencia de taninos,
alcaloides y saponinas y para el extracto de tomillo se identificó una mínima cantidad de
quinonas, alcaloides y azúcares.
condiciones:
y tomillo.
-62-
7 cm
4.0 cm
3,2
cm
Como podemos observar no hubo una buena separación de los productos tanto parar los
extractos de romero y tomillo.
Para el caso del extracto hidroalcohólico de romero se obtuvo un Rf=0.45, lo que asegura
que se trata del ácido clorogénico compuesto presente en el romero según Alonso, J.
2004 (7).
Para el caso del extracto hidroalcohólico de tomillo. Rf= 0.57 podemos apreciar una
mancha, de coloración amarillo- verduzco al revelar con Sulfato de Vainillina.
7 cm
3.3 cm
2 cm
Por medio del método del permanganato de potasio se pudo obtener el porcentaje de
taninos presentes en los distintos extractos de romero y tomillo, cuyos resultados se
especifican en el Cuadro N º9 y 10
-64-
DETERMINACIÓN E. E. HEXÁNICO DE
HIDROALCOHÓL ROMERO
ICO DE ROMERO
PORCENTAJE 0.0145 0.0342
DE TANINOS
DETERMINACIÓN E. E. HEXÁNICO DE
HIDROALCOHÓLI ROMERO
CO DE TOMILLO
PORCENTAJE 0.0373 0.081
DE TANINOS
Los taninos son sustancias de alto peso molecular, complejos polímeros de ácidos
fenólicos, algunos contienen además azúcares; su presencia en el tomillo es de 7 – 10 %
por lo que los datos obtenidos demuestran una mínimo porcentaje de taninos según
Alonso, J. 2004 (7).
Pseudomonas aeruginosa A A A A A P P P
ATCC 27853
albicans y P. aeruginosa.
Estudios realizados demostraron que los solventes orgánicos tienen mayor extracción de
los componentes activos de las plantas en general, encontrando mayor actividad
antimicrobiana en los extractos obtenidos con hexano según la OMS 2009 (46).
Del Tomillo se conoce que su extracto acuoso actúa frente a S. aureus y su aceite
esencial presenta actividad frente a E. coli y C. albicans según Alonso J. 2004(7).
Otros estudios han concluido que el efecto antimicrobiano está asociado con aceites
esenciales que contengan carvacrol y timol los cuales tienen mayor rendimiento
antibacterial según la OMS 2009 (46).
-68-
canfeno, 1,8 cineol, limoneno, alcanfor, linalol, D-linalol, borneol y su acetato, terpeno y
cariofileno. En el tomillo el poder antibacteriano se lo atribuye al timol y carvacrol
presentes en el aceite esencial según Alonso J. 2004(6).
A partir de los resultados obtenidos se puede afirmar entonces que la mezcla de los
extractos hexánicos poseen mayor actividad inhibitoria que la mezcla hidroalcohólica
debido a la mayor concentración de aceites esenciales que actúan disminuyendo el
crecimiento de S. aureus, S. tiphymurium, y C. albicans o alterando las características
propias del microorganismo como es el caso de P. aeruginosa que pierde su pigmento
verde .
-70-
CAPÍTULO IV
4. CONCLUSIONES
2. Por medio del método de destilación por arrastre de vapor se pudo determinar que
el tomillo contiene 0.82 % de aceite esencial y se estableció el timol como
componente representativo con un Rf= 0,47 y para el romero un 0.41 % de
aceite esencial y se identificó el 1,8 – cineol con un Rf = 0,28
CAPÍTULO V
5. RECOMENDACIONES
1. Realizar una investigación que permita conocer con mayor detalle el porcentaje
de actividad e inactividad de los extractos frente a los distintos microorganismos.
CAPITULO VI
6. RESUMEN
Para el efecto se obtuvo los extractos por maceración de las hojas y tallos en un balón
aforado con hexano y alcohol – agua luego se realizó el control de calidad y se evaporó el
solvente a baño María. Posteriormente se usó tres concentraciones diferentes y la mezcla
de los extractos blandos frente a las distintas bacterias y se comprobó sus propiedades
antimicrobianas utilizando el método de Mitscher el cual consiste en la determinación
del crecimiento de los microorganismos en presencia de concentraciones crecientes del
antimicrobiano en este caso los extractos, que se encuentran diluidos en el medio de
cultivo.
This investigation is about an antibacterial activity “in vitro” of extracts of rosemary and
thyme in front of Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC
14028, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Candida albicans ATCC 10231 and
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 it was done at the phytoquimics laboratory of
microbiology of the Science Faculty at the Politecnics of Chimborazo.
We got the extracts of maceration from the leaves and stems in an hexagon ball with
alcohol-water, then we did the quality control and the solvent was evaporated. Then we
use 3 different concentration and the mixture of soft extract in front of distinct bacteria,
we proved their antimicrobial properties using the Mitscher method which consist in
determining the microorganisms growing in presence of growing concentrations of
antimicrobial, in this case the extracts are dissolved in cultivate mean.
24 and 48 hours later of incubation we saw that the extract of both plants present
antibacterial activity, being outlined the mixture of hexanics extracts in concentrations of
10000 and 1000 µg / ml in front of Staphylococcus aureus, Candida albicans and
Pseudomonas aeruginosa due the fenolics components with timol, carvacrol y cineol
presents in the essential oil, for this reason we suggest the use of the mixture of rosemary
and stem extracts in infections caused for bacterial and fungi.
-74-
CAPÍTULO VII
7. BIBLIOGRAFÍA
http://www.telefonica.net/web2/applewoods/aceites_esenciales.htm
2009/03/16
3. ACTIVIDAD BIOLOGÍCA
http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/Biological_activity
4. ACTIVIDAD BIOLOGÍCA
http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/Biological_activity
2010-04-25
9. ANTIBIÓTICOS NATURALES
http://www.botanical-online.com/medicinalsantibioticosnaturales.htm
2008/07/16
-76-
http://www.ecoaldea.com/plmd/romero.htm
http://www.internatura.org/guias/plantas/romero.html
2206/05/12
http://www.medizzine.com/plantas/romero.php
2008/12/24
http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:Pr9Z4yUKXFU
J:redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/856/85611774009.pdf
http://www.inta.gov.ar/info/intainfo/doc/caracteristicas.pdf.
2002/07/23
http://web.sinectis.com.ar/fitomedicina/Introfito.html.
2006/05/28.
http://es.wikipedia.org/wiki/Klebsiella_pneumoniae
32. LA FITOTERAPIA.
http://www.salud.net/index.php?optiofitoterapia=192.html
33. MACERACIÓN
http://es.wikipedia.org/wiki/Maceraci%C3%B3n
2008/11/20
34. MARCANO, D. Fitoquímica Orgánica. Caracas. Litopar. 1991. Pp. 258.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap11.htm
-79-
http://www.nutricion.pro/12-02-2008/suplementos-dietarios/las-
propiedades-curativas-del-romero
2008/02/12
http://www.alimentacionsana.com.ar/Informaciones/novedades/romero.htm
2009/10/22
http://propiedadesdelaceite.jaimaalkauzar.es/propiedades-del-aceite-de-
tomillo.html
2007/05/30
http://saludydietas.com.ar/2008/05/14/las-propiedades-y-beneficios-del-
romero/
2008/11/24
http://propiedadesplantas.jaimaalkauzar.es/propiedades-de-la-planta-
tomillo.html
2007/06/18
http://200.21.104.25/biosalud/downloads/Revista%208_6.pdf
2009/01/08
http://74.125.47.132/search?q=cache:K1qi7dqHZgJ:www.agromeat.com
/attachm3nt5/ApiculturaTmol.doc+THYMUS+VULGARIS_es
48. ROMERO
http://cromatografia.uis.edu.co/cromatografia/investigacion/cibimol/tesis
%20cibimol/Edwin%20Bottia%20y%20Adriana%20Vargas.pdf
2009/09/28
http://www.euroresidentes.com/Alimentos/hierbas/romero.htm
2000/11/17
http://www.zonaverde.net/rosmarinusofficinalis.htm
2008/07/11
http://articulos.infojardin.com/aromaticas/Fichas/Romero.htm
2009/01/13
54. SALMONELLA
http://martinez-roberto.blogspot.com/2009/06/caracteristicas-coloniales-
y.html
59. TOMILLO
http://www.todamedicinaalternativa.com/hierbas-
medicinales/tomillo.html
http://www.natureduca.com/med_espec_tomillo.php
ANEXOS
Las hojas, las flores y los frutos contienen una esencia compuesta principalmente de
pineno, canfeno y cineol. El romero tiene propiedades estimulantes y antiespasmódicas,
facilita la secreción biliar, es tónico, estomacal, algo diurético y regulariza la
menstruación. En uso externo tiene aplicaciones en los casos de reumatismos articulares,
contusiones, heridas y eccemas.