2011

Extraccin del aceite esencial del zacate de limn (Cymbopogon citratus) y sus aplicacin como agente antimicrobiano y antimictico

07/06/2011

INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ

MATERIA: TALLER DE INVESTIGACION I TEMA: EXTRACCION DEL ACEITE ESENCIAL DEL ZACATE DE LIMON (Cymbopogon citratus) y su aplicacin como agente antimicrobiano y antimictico CATEDRTICO: ING. IBQ. JAQUELINE LEYRA RODRIGUEZ INTEGRANTES DE EQUIPO: LEON MORALES ALICIA DEL CARMEN VAZQUEZ GALVEZ KARLA MAJOGGANI ZAPATA DIAZ YESENIA GUADALUPE ZENTENO VAZQUEZ MARIA ELENA CARRERA: ING. BIOQUIMICA SEMESTRE: 4

TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS; A 07 DE JUNIO DEL 2011

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INDICE Portada.1 Presentacin.2 ndice.3 Capitulo I Planteamiento del problema4 Introduccin.5 Antecedentes..6 Justificacin..7 Hiptesis....9 Objetivos..10 Captulo II Marco terico11 Captulo III Metodologa..37 Captulo IV Resultados..46 Capitulo V Discusin de resultados.49 Captulo VI Conclusin..50 Captulo VII Recomendaciones.51 Captulo VIII Bibliografa.52 Capitulo IX Cronograma55

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CAPITULO I 1.1. Planteamiento del problema

Como sabemos en estos das encontramos muchas enfermedades, relacionadas con agentes bacterianos, microbianos, entre otros, ya que muchas bacterias se han vuelto resistentes a mltiples antibiticos que constituyen un desafo para el tratamiento de infecciones, por lo que hay la necesidad de encontrar nuevas sustancias con propiedades antimicrobianas, para su uso en la lucha con estos microorganismos, teniendo mejoras en humanos y plantas, de tal manera que se utilicen menos qumicos, que sean ms econmicas y que no puedan tener repercusiones en el medio ambiente. Los recursos naturales de origen vegetal son recursos renovables que se encuentran ntimamente unidos a su ambiente. El conocimiento y uso total del mundo vegetal es una meta llena de recompensas intelectuales y materiales. La informacin obtenida de la investigacin de aquellos compuestos de origen vegetal ayuda a comprender la bioqumica y fisiologa de los organismos que lo producen y as lograr un aprovechamiento optimo con fines econmicos y cientficos. Por lo tal se han estudiados diversas plantas que cuentan con muchas propiedades significativas, en este caso propiedades medicinales, y en la cual hay gran diversidad y la que abarcaremos en este trabajo es el zacate de limn (Cymbopogon citratus). Las cual posee muchas propiedades curativas, dentro de ellas podemos mencionar los siguientes: de actividad antiinflamatoria, analgsica, antiasmtica, diurtica, antiespasmdica y antimicrobiana, toxicidad y genotoxicidad, entre otros. El aceite esencial que posee el zacate de limn (Cymbopogon citratus) como componente principal es el citral, que tiene un alto poder antibacteriano y antimictico, adems de otras aplicaciones en las industrias de: perfumera, farmacutica, alimentos, entre otras. Por lo que se han hecho estudios de esta maravillosa planta por lo cual se ha extrado su aceite esencial con diferentes propiedades como ya las antes mencionadas, el cual pude servir para futuros productos, con fines mdicos y teraputicos.

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1.2.

Introduccin

Se ha encontrado que un gran nmero de plantas usadas en la medicina tradicional poseen sustancias capaces de inhibir el desarrollo de diversos microorganismos. Esto ha despertado el inters de diversas industrias como la farmacutica y alimentaria, que actualmente se encuentran en la bsqueda de nuevas alternativas para el tratamiento de enfermedades y la conservacin de alimentos, enfocando su atencin en los distintos metabolitos secundarios biolgicamente activos producidos por algunas especies vegetales. Los aceites esenciales son metabolitos que han adquirido gran importancia ya que se ha comprobado que poseen una fuerte actividad antimicrobiana contra bacterias, levaduras y hongos, incluso frente a microorganismos que presentan resistencia a los antibiticos (Prashar, 2003). Actividad atribuida a los compuestos por los que estn constituidos, tales como: monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, hidrocarburos y sus derivados.34,36 Una planta medicinal aromtica que posee grandes propiedades medicinales, es la del zacate de limn (Cymbopogon citratus) la cual es empleada en diferentes medicamentos gracias a su actividad analgsica, antiasmtica, diurtica, antiespasmdica, antimicrobiana, toxicidad, entre otras.36,35 El zacate de limn es cultivado en numerosos pases del mundo para la obtencin de su aceite esencial, el cual es conocido por sus mltiples usos. El aceite esencial posee como componente principal el citral, que tiene un alto poder antibacteriano y antimictico, adems de otras aplicaciones en las industrias de: perfumera, farmacutica, alimentos, entre otras. El aceite esencial del zacate de limn es muy usado en la industria de la aromaterapia, por las caractersticas que este posee como: antiinflamatoria, antirreumtico y repelente contra mosquitos.33,34 El aceite esencial del zacate de limn posee un color amarillo y un olor muy parecido al limn. Este se encuentra presente en las hojas de la planta, dentro del tejido foliar.54 El citral es un importante material para la perfumera, confitera y licorera y se emplea como materia prima en la sntesis de las iononas, sustancias aromticas con fuerte olor a violetas y en la sntesis de vitamina A. Los aceites esenciales ricos en citral son bien conocidos tambin por sus propiedades bactericidas y fungicidas.34,35 La tcnica ms utilizada para extraer aceite esencial es por arrastre con vapor va que se obtiene aceite esencial de buena calidad que conserva sus propiedades organolpticas, fsico-qumica. Por ello es muy importante desarrollar tecnologas ecolgicas para abatir las problemticas que se nos presentan en la actualidad.
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1.3.

Antecedentes

A las puestas del siglo XXI, el hombre ha alcanzado un extraordinario conocimiento de la mente y el cuerpo humanos. Gracias a ello, nuestra capacidad para dominar la enfermedad y los sufrimientos que esta causa, es en la actualidad mayor de lo que fue en ningn momento de la historia. Obviamente, este progreso est ligado al hecho de que hoy disponemos de ms centros de investigacin y apoyos a los mismos. En las ltimas dcadas se ha producido un desarrollo tan espectacular de la industria farmacutica, as como de la produccin de medicamentos sintticos. Los medicamentos de sntesis qumica que proporciona la moderna industria farmacutica, han demostrado su eficiencia en caso de procesos agudos y de afecciones graves, debido en parte a la inmediatez de sus afectos. Ahora bien, ningn producto qumico se halla exento de efectos secundarios ms o menos imprevisibles e importantes. Toda sustancia elaborada en un laboratorio, y por lo tanto extraa a los organismos vivos, tiene que ser aceptadas con la mxima prevencin por mdicos y enfermo, y no debe considerarse inofensivas sin pruebas validas (Harold Burn). Estos fenmenos cada vez ms frecuentes, han sucintado un renovado inters por los medicamentos naturales de origen vegetal, tanto por parte de los mdicos como de los enfermos. Las plantas han sido utilizadas como remedio para las dolencias de los seres humanos como la de los animales, desde tiempos muy antiguos. Todas las civilizaciones se han valido de ellas para aliviar el sufrimiento, y en muchos casos, hasta para curar la enfermedad. Hoy conocemos con exactitud la composicin de muchsimas plantas medicinales, de modo que las podemos aplicar de forma racional cuando mejor conviene, es por esto que a partir de las sustancias activas de una planta, y de los resultados que proporciona la investigacin farmacutica y clnica, se deducen sus aplicaciones medicinales. A medida que las plantas medicinales se vayan conociendo mejor, sern ms y mejor utilizadas y apreciadas. Las plantas medicinales no se deberan de usar nicamente buscando en ellas una accin curativa, como se hace con los frmacos, cuando ya se ha manifestado la enfermedad. Precisamente una de las grandes virtudes es su capacidad para regular los procesos vitales y para prevenir la enfermedad. El uso adecuado de las plantas medicinales, dentro de un conjunto de hbitos de vida sana, puede evitar que las debilidades de nuestro organismo y la predisposicin a padecer ciertas enfermedades evolucionen hasta convertirse en enfermedades declaradas.

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1.4.

Justificacin

Desde tiempos remotos, nuestros antepasados han recurrido a la cura de enfermedades por medio de remedios elaborados a base de plantas, que aun mucha de ellas conservan sus propiedades medicinales. Hoy en da hay plantas que fueron rescatadas ya que muchas han sido extintas como consecuencia del descuido humano. Hoy en da podemos encontrar una gran diversidad de plantas y con la ayuda de la tecnologa y nuevas tcnicas que podemos explotarlas aun mas aprovechando todas sus propiedades entre estas plantas podemos encontrar zacate de limn o te de limn (Cymbopogon citratus) en la cual tiene muchas propiedades ; entre las propiedades farmacolgicas de dicha planta son analgsicas, antiasmticas, expectorantes, antiespasmdico, etc.Gracias a su naturaleza aromtica del genero Cymbopogon ha atrado la atencin del hombre a lo largo de su historia. El agradable olor que poseen las diferentes especies de este gnero por sus contenidos en aceites esenciales ricos en compuestos terpenicos ha creado una demanda de estos para el desarrollo de la industria en pases como: Alemania, Argentina, Brasil, Cuba, Ecuador, Sri Lanka, India, Singapur, Malaya, Java, Formosa, China, Francia, Sudfrica, Seychelle, Islas Comoros, Madagascar, Hait, Puerto Rico, Mxico, Guatemala, Honduras y Salvador. Como sabemos, Mxico es un pas rico en plantas medicinales gracias a sus condiciones climticas y geogrficas. Y en el caso del t de limn (Cymbopogon citratus) es una planta adaptable casi a cualquier tipo de suelo ya que muchas veces se encuentra de manera silvestre. En nuestro pas varios estados del Altiplano Central, Golfo de Mxico y Sureste. En los cuales se encuentra nuestro bello estado Chiapas, siendo de los 4 principales productores a nivel nacional, no obstante eso si no que tambin genera nuevas alternativas de ingresos para la poblacin rural, como en la regin de los Joaquines municipio de Cintalapa Chiapas, donde se cuenta con parcelas productoras de zacate de te-limn orgnico certificado al 100% por la empresa mexicana Certimex. Tambin este cultivo se encuentra en establecimiento en la zona de la selva, Municipio de Ocosingo, Chiapas. El aceite esencial que posee el zacate de limn (Cymbopogon citratus) es de suma importancia ya que contiene un gran porcentaje de citral, el cual a su vez contiene propiedades bactericidas y fungicidas, un ejemplo de esto sera la especie microbiana Trichphyton Rubrum que es un hongo dermatofito, antropoflico, causante de enfermedades de piel, como por mencionar el pie de atleta, prurito de Jockey, tia, entre otras.
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Una de sus grandes peculiaridades es su funcin ya que puede ayudar a combatir patologas humanas tanto como en plantas, es por eso que en algunos casos esta se utiliza como insecticida agradable al ambiente. Por lo que es importante que en la actualidad busquemos medicinas naturales que puedan ser econmicas y accesibles, ya que actualmente encontramos medicinas sintticas con demasiados qumicos, las cuales son caras y en algunos casos tienen repercusiones en nuestra salud; en el caso del zacate de limn (Cymbopogon citratus) es una planta de uso limitado en ciertas regiones pero que tambin las propiedades de esta han sido comprobadas cientficamente.

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1.5.

Hiptesis

Utilizacin de la extraccin del aceite esencial del zacate de limn?

El uso clnico del zacate de limn como un agente antimictico y antibacteriano, mediante la extraccin de su aceite esencial, para la utilizacin de su aceite en un producto natural para la poblacin en general para la sustitucin de algunos medicamentos sintticos con la misma calidad.

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1.6.

Objetivos

1.6.1 Objetivos Generales Obtener Aceite Esencial a partir de las hojas del zacate de limn (Cymbopogon citratus), para su aplicacin como antibacteriano y antimictico 1.6.2. Objetivos Especficos Realizar un proceso de extraccin que no altere las caractersticas del aceite esencial mediante la identificacin de los procesos qumicos implcitos en la obtencin del aceite esencial del zacate de limn (Cymbopogon citratus). Determinar propiedades antibacterianas y antimicticas del aceite esencial del zacate de limn (Cymbopogon citratus).

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Captulo II Marco terico 2. PLANTAS AROMATICAS MEDICINALES 2.1 PLANTAS AROMATICAS MEDICINALES Las ltimas cuatro dcadas se han caracterizado por el renacimiento de una cultura naturalista cientficamente fundamentada, que incluye tanto la actividad agropecuaria como la mdica. Surge una revalorizacin en el suelo y produccin de las plantas medicinales, tanto en estado natural, como de las sustancias y productos elaborados a partir de ellas. La bsqueda se sustancias con actividad antibacteriana y antimictica, en fuentes como las plantas superiores, es importante para encontrar alternativas teraputicas efectivas contra las infecciones producidas por microorganismos resistentes a los antibiticos.1 La medicina tanto tradicional como natural forman parte importante de cada pas y regin del mundo con caractersticas propias, dependiendo de los recursos disponibles en ellos, y teniendo en cuenta la idiosincrasia de sus habitantes. Entre las plantas reconocida por sus comprobadas propiedades medicinales se encuentra el cultivo de zacate limn (Cymbopogon citratus (D.C) Stapf), cuya importancia se centra en la obtencin de aceite esencial, el cual es rico en citral, y presentan varias propiedades entre ellas que es antibacteriano y antimictico.2 2.2. PLANTA DEL ZACATE LIMON (Cymbopogon citratus (D.C) Stapf)

Grafico. Plantacin del zacate limn

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Otros nombres comunes: En Mxico, Costa Rica, Honduras, Nicaragua y Guatemala se le conoce con los nombres de zacate limn, te de limn, zacate limn, y zacate t. En Panam se la conoce como hierba de limn y paja de limn.3 En Venezuela y Republica Dominicana se la conoce con los nombres de limoncillo, pasto limn, hierba de limn, grama de limn, citronela, lemongrs, limonera, pasto cedrn, caita de malojillo, malojillo criollo, limonaria y lemongrass4 En Colombia y la Guayana se la conoce como limoncillo, limonera, zorra de limn, vergata, belgata. En ecuador se le conoce con los nombres de hierba luisa, yerba luisa1 En la Amazonia se le conoce como patchuli falso5 En Cuba se la conoce con los nombres vulgares de caa santa, caita de limn, hierba de calentura, lemongrass, hierba limn, cauela de limn, caita santa, yerba de la calentura, yerba de limn. En Estados Unidos, Antillas Francesas y las Antillas inglesas se le conoce con los nombres de lemongrass, limoncillo, matojo de limn, chiendent citronnelle, nest indian lemongrass.6

Aspectos taxonmicos: La Dra. Rafaela Soto en su estudio de la planta zacate limn la clasifica de la siguiente manera: Reino: Cormobionta Divisin: Magnoliophyta Clase: Liliatae (liliopsida) Subclase: Commelinidae Orden: Cyperales Familia: POACEAE (gramneas) Gnero: Cymbopogon Spreng Especie: citratus Stapf Sinnimos: Andropogon citratus D.C. 7
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Origen y distribucin: El zacate limn es originario de la India, regiones de Asia Suroriental y frica ecuatorial. Se encuentra distribuida en zonas tropicales, subtropicales y templadas. Identificacin de la especie: Antiguamente exista confusin sobre la taxonoma de las plantas de las Indias Orientales y de las Indias Occidentales, productoras del aceite esencial denominado lemongrass. Pero toda esta confusin finaliza cuando el cientfico Stapf, identifica a la planta de las Indias Orientales como Cymbopogon Flexuosus y a la de las Indias Occidentales como Cymbopogon citratus.8 Descripcin botnica:

Grafico. Planta del zacate limn. El zacate limn es una planta herbcea, muy vigorosa. Su tamao es mediano, la altura mxima a la cual la planta llega es de 1.50 hasta 2m con un dimetro de 5cm., y posee de 40 a 50 hijos.9

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Segn lo descrito por la doctora Rafaela Soto, en un anlisis bromatolgico realizado al zacate limn se cuantifico su composicin, y se obtuvieron los datos descritos en la tabla siguiente Anlisis bromatolgico del zacate limn Caracterstica Materia seca Materia orgnica Nitrgeno total Protena cruda Cenizas Fibra cruda Carbohidratos solubles Calcio Fosforo

% 93.19% 86.07% 0.96% 6.03% 7.12% 29.45% 2.99% 0.41% 0.22%

PARTE Raz

DESCRIPCION El zacate limn posee una raz corta, muy ramificada. Estudios realizados han determinado que la mayor cantidad de races se encuentran en el suelo a una profundidad de 0.30 cm.

Tallo

Posee una forma cilndrica, es fuerte y corto. Su color es verde, cuando la planta es cortada, este se torna caf rojizo

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Hojas

Flor

Son de color verde oscuro, poseen una vaina tubular la cual envuelve al tallo, encontrndose agrupadas cerca de la base. Tienen los bordes speros llenos de cerdas (parecidos al filo de un serrucho), que al manipular la planta cortan. El largo de las hojas va de 60 cm. a 1 m., y el ancho de (0.01 a 0.02) m, estas dimensiones varan con cada estacin climtica. Las hojas poseen un fuerte olor a limn, ya que en el lado central del mesofilo y entre las heces vasculares se encuentran las clulas donde se almacena el aceite esencial, el cual es rico en citral. Las clulas epidrmicas de las hojas poseen slice, el cual puede causar ulceras. Esta planta generalmente no tiende a florecer, cuando lo hace es porque ha crecido en un clima propicio y no ha sido cortada en varios aos. Las flores se encuentran sostenidas en el tallo, en varios racimos.

Ciclo de vida: El ciclo de vida del zacate limn va alrededor de cuatro a cinco aos. En la bibliografa se puede encontrar datos que hacen referencia a ciclos de vida de ms de 10 aos, esto depende de las condiciones en las cuales est creciendo la planta.1, 10 Clima: El zacate limn crece en climas templados y clidos, requiere para su crecimiento la presencia de luz. Es resistente a las severidades del invierno, ya que soporta lluvias pero no en exceso. No tolera las nieblas.10, 11 La cantidad de aceite esencial de planta varia de mes en mes en el ao, siendo los meses de junio, julio y agosto los que ms aceite esencial produce la planta. Esto se debe principalmente a que el calor, el sol y la humedad climtica de estos meses hacen que la planta acumule mas aceite esencial, mientras que en pocas donde la presencia de lluvia es constante el rendimiento de aceite disminuye, debido a que la planta llena de agua sus clulas para protegerse del mal tiempo.12
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Una de las causas principales para que este cultivo vare en su produccin son los factores ambientales (condiciones climticas, nutricionales y otros), los cuales afectan directamente a la expresin de los genes responsables de la produccin de los principios activos.13 PROPAGACION: El zacate limn se propaga por divisin de matas, debido a que la obtencin de sus semillas es muy difcil, ya que la planta no florece en la mayora de zonas del mundo Las matas son extradas de las plantas madres que tengan uno o dos aos de edad, y se le recorta la parte area y las races.1, 14 Las nuevas madres van a dar una produccin de 40 a 70 hijos en periodo de alrededor de 10 meses a un ao de ser plantadas.1, 15 SUELO: El zacate limn crece en terrenos arenosos-arcillosos con adecuado drenaje y profundidad. Datos encontrados en la bibliografa, indican que el zacate limn tambin puede crecer en suelos ligeramente arenosos.12 El zacate limn es una planta muy resistente, razn por la cual se le encuentra en suelos de buena calidad, con abono verde en suelos infrtiles, en pendientes montaosas, en suelos arenosos, en suelos ligeramente cidos. Pero la produccin de aceite esencial de esta planta se da en suelos arenosos-arcillosos.1, 12 Un dato muy interesante encontrado en la bibliografa, indica que el zacate limn cultivado en suelos con pH de 7.5 posee un alto rendimiento de cultivo y aceite esencial, mientras que el zacate limn cultivado en suelos con pH de 4.8 posee bajos rendimientos.8, 12, 26 Se debe preparar el suelo 40 das antes de la plantacin, ya que este debe estar en condiciones ptimas para el buen crecimiento de la planta, para lo cual se debe realizar las siguientes actividades: Labrar la tierra (profundidad de 30 cm.), para facilitar el crecimiento de las races. Limpieza del suelo de todas malezas, para que estas no afecten el crecimiento del nuevo cultivo. Realizar un riego peridico, para que el suelo cuente con las condiciones optimas para el crecimiento del nuevo cultivo Surcar el suelo
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Colocar una correcta cantidad de abono con productos tales como: estircol bien fermentado, azufre.12, 16, 9

CULTIVO: En la tabla siguiente se encuentran todos los pasos que se deben seguir para realizar el cultivo de zacate de limn: ACTIVIDAD Plantacin DESCRIPCION Para realizar la plantacin de zacate limn se deben tomar en cuenta algunos aspectos importantes tales como: poca de plantacin, adecuado uso en la radiacin solar, evitar la presencia de malezas, la conservacin del agua y del suelo, fertilidad del suelo, entre otros. La plantacin de zacate limn se realiza a mano colocando en cada hoyo del suelo de 1 a 3 hijos, posteriormente se coloca tierra hasta cubrir la raz. En la bibliografa se encuentran varios datos de la distancia que se deben guardar entre planta y planta, siendo la distancia promedio (50x90) cm. la poca de plantacin depende de la zona donde la planta de zacate limn va a ser cultivada. Las labores de cultivo se las hace a los 20 a 25 das despus de realizada la plantacin, y posteriormente cada quincena. Esta actividad tiene la finalidad de controlar el crecimiento de malezas en los cultivos de zacate limn, ya que estas hacen que el crecimiento de la planta disminuya Fertilizar orgnicamente el cultivo ya que necesita nitrgeno, fosforo, potasio y materia orgnica para su adecuado crecimiento, previamente se debe hacer limpieza de maleza. Si en la zona donde se encuentra sembrada la planta no llueve, se debe regar la planta con agua potable si es posible. El riego se lo debe hacer constantemente, ya que as la planta crecer ms rpido y en correctas
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Labores de cultivo

Cosecha

Poscosecha

condiciones, evitando que se produzca un envejecimiento de las hojas acelerado. El zacate limn no se ve afectado de manera significativa por plagas y enfermedades. La recoleccin del zacate limn suele realizarse en cualquier poca del ao. Se cortan con un machete las hojas a no menos de 10 cm. de la superficie del suelo, para permitir la reparacin del follaje. La planta est lista para ser cortada cuando empieza a envejecer, mostrando como caracterstica la punta de las hojas de color pardo amarillenta y el tallo un color rojizo. Cuando la planta tiene de ocho meses a un ao de edad se debe cortar solo una vez, en los siguientes aos, se realizan de dos a cuatro cortes, cada tres o cuatro meses. Siempre la cosecha se la realiza a las primeras horas de la maana, esto es entre 5 a 6 de la maana. Una vez cosechada a las hojas de la planta zacate limn, se le realiza el control de calidad, es decir, se les examina retirando aquellas que presentan envejecimiento, manchas, huecos debido a que han sido atacadas por insectos, posteriormente las hojas son lavadas y llevadas al lugar donde van a ser almacenadas, el cual debe ser oscuro, tener aireacin y baja humedad. Dichas condiciones deben de evitar el deterioro de la planta en forma rpida. La planta tendr varios destinos, puede ser usada entera para procesos de elaboracin de medicamentos, para la extraccin de su aceite esencial en alambiques a vapor de agua o a fuego directo. La destilacin de le realiza con las hojas enteras o picadas en trozos pequeos. El tiempo que tarda el proceso de destilacin es de dos horas cuando se utiliza arrastre de vapor y dos horas y media cuando se realiza a fuego directo.

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2.3. Aceites esenciales Los aceites esenciales son compuestos formados por variad substancias orgnicas voltiles, que pueden ser alcoholes, acetonas, cetonas, teres, aldehdo, y que se producen y almacenan en los canales secretores de las plantas. Normalmente son lquidos a temperatura ambiente, y por su volatilidad, son extrables por destilacin en corriente de vapor de agua, aunque existen otros mtodos. En general son los responsables del olor de las plantas. Origen Las plantas elaboran los aceites esenciales con el fin de protegerse de las enfermedades, ahuyentar insectos depredadores o atraer insectos benficos que contribuyen a la polinizacin. Los aceites esenciales son caractersticos de los magnoliales, los laurales, los austrobaileyales, y los piperales, y tambin de algunas familias no emparentadas con estos rdenes, como Myrtaceae, Rutaceae, las familias de apiales, Lamiaceae, Verbenaceae y Asteraceae. Estn presentes en distintas partes de la planta: en las flores (como en el caso de la lavanda, el jazmn y la rosa) en todo el rbol (como sucede con el eucaliptus) en las hojas (la citronela) en la madera (el sndalo) en la raz (el vetiver) en la resina que exhudan (el incienso, la mirra y el benju) en la cscara de los frutos (el limn, la naranja y la bergamota)

Dentro de los tejidos vegetativos, se encuentran en clulas esfricas o diferentes cavidades o canales en el parnquima, y cuando dan el olor a las flores, se encuentran en las glndulas odorferas, desde donde son liberados.39,38

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Clasificacin de los aceites esenciales Los aceites esenciales se pueden clasificar en base a diferentes criterios: consistencia, origen y naturaleza qumica de los componentes mayoritarios. a. Consistencia De acuerdo con su consistencia los aceites esenciales se clasifican en: Las esencias fluidas son lquidos voltiles a temperatura ambiente Los blsamos son extractos naturales obtenidos de un arbusto o un rbol. Se caracterizan por tener un alto contenido de acido benzoico y cinmico, as como sus correspondientes esteres. Son de consistencias ms espesas, son poco voltiles y propensos a sufrir reacciones de polimerizacin, son ejemplos el blsamo de copaiba, el blsamo del Per, benju, blsamo de tol, estoraque, etc.

Dentro del grupo de las resinas podemos encontrar a su vez una serie de posibles combinaciones o mezclas: 1. Resinas, son producto amorfos slidos o semislidos de naturaleza qumica compleja. Pueden ser origen fisiolgico o fisiopatolgico. Por ejemplo, la colofonia, obtenida por separacin de la oleorresina trementina. Contiene acido abitico y derivados. 2. Oleorresinas, son mezclas homogneas de resinas y aceites esenciales. Por ejemplo, la trementina, obtenida por incisin en los troncos de diversas especies de pinos. Contiene resina (colofonia) y aceite esencial (esencia de trementina) que se separa por destilacin por arrastre de vapor. Tambin se utiliza el trmino oleorresina para nombrar los extractos vegetales obtenidos mediante el uso de solventes, los cuales deben estar virtualmente libres de dichos solventes. Se utilizan extensamente para la sustitucin de especies de uso alimenticio y farmacutico por ventajas (estabilidad y uniformidad qumica y microbiolgica, facilidad de incorporar al producto terminado). Estos tienen el aroma de las plantas en forma concentrada y son lquidos muy viscosos o sustancias semislidas (oleorresina de pimentn, pimienta negra, clavo, etc.).

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3. Gomorresinas, son extractos naturales obtenidos de un rbol o planta. Estn compuestos por mezclas de gomas y resinas. b. Origen. De acuerdo a su origen los aceites esenciales se clasifican como: Los naturales se obtienen directamente de la planta y no sufren modificaciones fsicas ni qumica posteriores, debido a su requerimiento tan bajo son muy costosas. Los artificiales se obtienen a travs de procesos de enriquecimiento de la misma esencia con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de esencias de rosa, geranio y jazmn, enriquecida con linalol, o la esencia de ans enriquecida con anetol. Los aceites esenciales sintticos como su nombre lo indica son los producidos por la combinacin de sus componentes los cuales son la mayora de las veces producidos por procesos de sntesis qumica. Estos son ms econmicos y por lo tanto son mucho ms utilizados como aromatizantes y saborizantes (esencias de vainilla, limn, fresa, etc.). c. Naturaleza qumica El contenido total en aceites esenciales de una planta es en general bajo (inferior al 1 %) pero mediante extraccin se obtiene en una forma muy concentrad que se emplea en los diversos usos industriales. La mayora de ellos, son mezclas muy complejas de sustancias qumicas. La proporcin de estas sustancias vara de un aceite a otro, tambin durante las estaciones, a lo largo del da, bajo las condiciones de cultivo y genticamente. El termino quimiotipo alude a la variacin en la composicin del aceite esencial, incluso dentro de la misma especie. Un quimiotipo es una entidad qumicamente distinta, que se diferencia en los metabolitos secundarios. Existen pequeas variaciones (ambientales, geogrficas, genticas, etc.) que producen poco o ningn efecto a nivel morfolgico que sin embargo producen grandes cambios a nivel de fenotipo qumico.1,2,3 Caractersticas fsicas de los aceites esenciales Los aceites esenciales son voltiles y son lquidos a temperatura ambiente. Recin destilados son incoloros o ligeramente amarillos. Su densidad es inferior a la del agua (la esencia de sasafrs o de clavo constituyen excepciones). Casi siempre dotados de poder rotatorio, tienen un ndice de refraccin elevado.
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 Son solubles en alcoholes y en disolventes orgnicos habituales, como ter o cloroformo, y alcohol de alta gradacin. Son liposolubles y muy poco solubles en agua, pero son arrstrables por el vapor de agua.9,8 Caractersticas qumicas de los aceites esenciales (terpenoides) Los componentes de los aceites se clasifican en terpenoides y no terpenoides. I. No terpenoides. En este grupo tenemos sustancias alifticas de cadena corta, sustancias aromticas, sustancias con azufre y sustancias nitrogenadas. No son tan importantes como los terpenoides en cuanto a sus usos y aplicaciones. Terpenoides. Son las ms importantes en cuanto a propiedades y comercialmente.

II.

Los terpenos derivan, de unidades de isopreno (C5) unidas en cadena. Los terpenos son una clase de sustancia qumica que se halla en los aceites esenciales, resinas y otras sustancias aromticas de muchas plantas, como los pinos y muchos ctricos. Principalmente encontramos en los aceites monoterpenos (C10), aunque tambin son comunes los sesquiterpenos (C15) y los diterpenos (C20). Pueden ser alifticos, cclicos o aromticos. 11,13 Segn los grupos funcionales que tengan pueden ser: Alcoholes (mentol, bisabolol) y fenoles (timol, carvacrol) Aldehdos (geranial, citral) y cetonas (alcanfor, thuyona) steres (acetato de bornilo, acetato de linalilo, salicilato de metilo, compuesto intiinflamatorio parecido a la aspirina). teres (1,8-cineol) y perxidos (ascariol) Hidrocarburos (limoneno, a y b pineno)13,16

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En la tabla 5. Se muestran los grupos funcionales de cada categora

Hidrocarburos monoterpnicos Son los compuestos ms abundantes en los aceites esenciales, y precursores de los ms complejos, que son los terpenos oxidados. Se denominan terminando en eno. Por ejemplo el limoneno es el precursor de los principales componentes de la esencia de las mentas (Mentha spp.,F.Lamiaceae), como carvona y mentol. El limoneno se encuentra tambin en ctricos y en el eneldo, (Anethum graveolens, F.pinaceae). Alcoholes Los alcoholes llevan el grupo hidroxilo (-OH) unido al esqueleto C10. Se denominan terminados en (-ol). Son muy apreciados por su aroma. Por ejemplo, el linalol, que tiene dos formas, el R-linalol se encuentra en la rosa y la lavanda y es el componente mayoritario de la Mentha arvensis. La forma S-linalol en el aceite de la lavanda con un contenido mayor al 5 % indica adulteracin. El linalol le da el sabor a las hojas de t, el tomillo y el cardamomo. Otro compuestos de este grupo, el mentol, es uno de los responsables del sabor y olor de la menta, cuya esencia puede tener hasta un 50% de este componente.
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Tambin el genariol, del geranio de olor (Pelargonium spp), el citronelol de la rosa (Rosa gallica), en borneol del romero, y el santalol del sndalo (Santalum lbum, F. Santalacea). Aldehdos Los aldehdos son compuestos muy reactivos. Se nombran acabados en (-al). Muchos de ellos, por ejemplo los encontrados en los ctricos, se corresponden con su respectivo alcohol, por ejemplo, geraniol-geranial o citronelol-citronelal. Son abundantes en los ctricos, responsables del olor caracterstico, principalmente los ismeros geranial (a citral) y neral (b-citral) juntos conocidos como citral. Este compuesto, adems de su aroma caracterstico, tiene propiedades antivirales, antimicrobianas y sedantes. Pero muchos de ellos, incluido el citral, son irritantes para la piel por lo que no se puede hacer uso tpico de ellos. Otro grupo importante son los aldehdos aromticos, como el benzaldehdo, componente principal del aceite de almendras amargas y responsable de su aroma caracterstico. Fenoles Solo se encuentran en unas pocas especies pero son muy potentes e irritantes. Los ms importantes son el timol y el carvacrol, que se encuentran en los tomillos (g. Thymus) y oreganos (g.Origanum), ambos de la Fam. Labiatae. Otro fenol muy importante es el eugenol, que se encuentra en muchas especies, por ejemplo en la esencia de clavo. Es un potente bactericida, as como anestsico, y se emplea en odontologa.

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teres fenlicos Son los componentes principales de especies como apio y el perejil (apiol), ans (anetol), albahaca (metilchavicol) y estragn (estragol). El safrol es un componente muy empleado en perfumera que se encuentra en la corteza del rbol del sasafrs (Sassafras albidu, F. Lauraceae). Cetonas Se producen por la oxidacin de alcoholes y son molculas bastante estables. Terminan en ona. La carvona est presente en la Mentha spicata. La tuyona (aislada por primera vez en la Tuya, Thuja occidentalis,F. Cupressaceae) y pulegona son bastante txicas y nunca deben usarse en el embarazo. La tuyona se encuentra en plantas como el gnero Artemisia (Artemisia absinthium, con la cual se hace el vermouth y la absenta), y en la salvia (S. officinalis). La pulegona se aisl por primera vez en el poleo (Mentha pulegium). teres Los teres u xidos monoterpnicos son reactivos e inestables. Un ejemplo es el xido de bisabolol presente en la manzanilla (Matricaria chamomilla). Otro muy comn es el 1,8-cineol (tambin llamado eucaliptol), que es el componente principal del aceite de eucalipto. Es expectorante y mucoltico y el componente principal de medicamentos para la tos. El aceite de eucalipto vara en aroma segn el contenido en 1,8-cineol. El aceite rico en este componente (Eucaliptus globulus, F. Myrtaceae) se emplea mas para uso medicinal, mientras que el de contenido ms bajo (por ejmplo E.radiata) se emplea para aromaterapia.18,29

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steres La mayora de loes steres se forman por reaccin de un alcohol terpnico con cido actico. Su aroma caracterizada a los aceites en los que se encuentran. Por ejemplo, el aceite de lavanda contiene linalol y su ster, acetato de linalilo. La abundancia relativa de estos dos compuestos es un indicador de buena calidad. El salicilato de metilo, derivado del cido saliclico y metanol, es un compuesto antiinflamatorio parecido a la aspirina que se encuentra en un tipo de brezo (Gaultheria precumbens, F. Ericaceae), y se emplea tpicamente en linimentos. 18,29 2.4. Aceite Esencial de Hierba Luisa El aceite esencial de hierba luisa se lo obtiene por la destilacin de sus hojas, en las cuales se encuentra en una proporcin del 0.25 al 0.35%.21 Mundialmente al aceite esencial de la hierba luisa se lo conoce con el nombre de 51 lemongrass. Caractersticas fsicas del aceite esencial Sus caractersticas organolpticas son: Posee color amarillo plido Su olor es intenso a limn. La densidad relativa a 20C esta entre: 0,878-0,900. El ndice de refraccin a 20C esta entre: 1,4830-1,4890. El pH esta alrededor de:5 6.25

Propiedades del aceite esencial de hierba luisa El aceite esencial de hierba luisa al igual que la planta, posee variadas propiedades, antes ya mencionadas. En el presente proyecto se tomaron en cuenta dos propiedades de este aceite esencial: antibacteriana y antimictica, para lo cual se ha buscado en la bibliografa los diferentes microorganismos como bacterias y hongos sobre los cuales ejerce su poder. En varios estudios realizados sobre el aceite esencial de la hierba luisa se a demostrado que detiene el crecimiento de ciertos patgenos como son: Vibrio cholerae y Salmonella
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paratyph, diferentes dermatofitos: Epidermophyton floceosum, Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes y T. rubrum, inhibe el desarrollo de bacterias como la Escherichia coli, Bacillus subtilis, y Staphylococcus aureus. Tambin se ha comprob que el aceite esencial acta sobre el Aspergillum flavus, siendo ms potente que los fungicidas sintticos.28 Cave mencionar que tambin posee propiedades potenciales como anticancergeno por el contenido de mirceno (el cual acta junto con otros componentes del aceite, solo no). Componentes principales del aceite esencial de hierba luisa Los componentes principales que se encuentran en el aceite esencial de hierba luisa se describen en la tabla 6.31

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Duracin del Aceite Esencial El aceite esencial de hierba luisa tiene un tiempo de vigencia de 3 meses, en un lugar a temperatura ambiente y con poca luz, a partir de esta fecha el aceite tiende a degradarse, ya que es sensible a la exposicin a la luz y al aire, de acuerdo a lo descrito en la bibliografa.

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Usos del aceite esencial de hierba luisa El aceite esencial se lo utiliza: Para la obtencin de iononas y metil iononas. Para la sntesis de vitamina A y de compuestos aromticos. Para extraer el citral, el cual se lo utiliza como saborizante en la industria alimenticia. Tambin es muy usado en las industrias de perfumera, farmacutica y en la que se encarga de elaborar desinfectantes. En la industria cosmtica se lo utiliza como componente para elaborar shampoo contra cabellos grasos y tambin como componente de cremas contra el acn y pieles con celulitis. Como repelente de insectos. En la Aromaterapia se lo utiliza para dar masajes y de esta manera lograr que los msculos se relajen, tambin se lo utiliza para calmar los dolores producidos por exceso de actividad. Inhalando este aceite mezclado con aceite base sirve para aliviar dolores de cabeza intensos, ayuda a eliminar el stress, ya que logra que el cuerpo se relaje, combate los resfriados, la fiebre. Para aliviar los dolores de estomago, mediante compresas.27

Importancia econmica El aceite esencial de hierba luisa posee un alto valor agregado. Una botella que contenga 10ml est alrededor de $ 6.00.32

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2.5.

Procesos industriales aplicados a los aceites esenciales

Son procesos que, aplicados a los aceites esenciales y otros extractos vegetales aromticos, sirven para separar y concentrar los componentes, para facilitar su procesamiento industrial o simplemente para homogenizar la calidad.35 Mtodos de obtencin Destilacin por arrastre de vapor. Las plantas se colocan sobre un fondo perforado o criba ubicado e cierta distancia del fondo de un tanque llamado alambique. La parte ms baja de esta contiene agua hasta una altura algo menor que el nivel de la criba. El calentamiento se produce con vapor saturado que se provee de una fuente de calor que se compone el equipo, fluye mojado y a presin baja, penetrando a travs del material vegetal. Los componentes se volatilizan, y condensan en un refrigerante, siendo recogidos en un vaso florentino, donde se separa el agua del aceite por diferencia de densidad. Expresin del pericarpio. Una bandeja con pinchos, en cuya parte inferior hay un canal para recoger el aceite esencial. Se emplea para ctricos sobre todo.36 Disolucin en grasa (enfleurage). Los aceites esenciales son solubles en grasas y alcoholes de alto %. Sobre una capa de vidrio se coloca una fina pelcula de grasas y sobre ella los ptalos de flores extendidas. La esencia pasa la grasa, as hasta saturacin de la grasa. Posteriormente con alcohol de 70, se extrae el aceite esencial. Se emplea para flores con bajo contenido en esencias pero muy preciados (azahar, rosa, violeta, jazmn).35 Extraccin con disolventes orgnicos. Que penetran en la materia vegetal y disuelven las sustancias, que son evaporadas y concentradas a baja temperatura. Despus, se elimina el disolvente, obteniendo la fraccin deseada. La seleccin del disolvente pretende que sea capaz de disolver rpidamente todos los principios y la menor cantidad de materia inerte, que tenga un punto de ebullicin bajo y uniforme que permita eliminarlo rpidamente, pero evitando prdidas por evaporacin, qumicamente inerte, para no reaccionar con los componente de los aceites, no inflamable y barato. Este disolvente ideal no existe, y los mas empleados son el ter de petrleo, con punto de ebullicin de 30 a 70 C, que se evapora fcilmente y es inflamable, benceno, que disuelve tambin ceras y pigmentos, y alcohol, que es soluble en agua. Se emplea

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cuando hay componentes de peso molecular elevado que no son lo suficientemente voltiles. 33 Extraccin con gases en condiciones supercrticas. Se emplean gases, principalmente CO2, a presin y temperatura superiores a su punto crtico. En esas condiciones se obtienen buenos rendimientos y se evitan alteraciones de los componentes de la esencia. La infraestructura necesaria es cara, pero tiene sus ventajas, como la fcil y rpida eliminacin del gas extractor por descompresin, la ausencia de residuos de disolventes y que los gases no resultan caros.36 Rectificacin Es el proceso ms comn, consiste en fraccionar en una columna de rectificacin obtenindose porciones que son analizadas individualmente. Aquellas que tengan una misma calidad se juntan. Generalmente un AE se fracciona en tres partes Cabeza o fraccin liviana Corazn o parte media Fracciones pesadas39 Fraccionamiento Semejante al anterior, pero con una particin ms especfica. Por ejemplo, los aceites esenciales con 60 70 % de citral se fraccionan tratando de eliminar los compuestos que los acompaan para obtener un 90-97 % de pureza.31 Desterpenado Al eliminar los terpenos, cuando estos no tienen la propiedad organolptica que se persigue, mejora la solubilidad en agua del aceite esencial y concentrado el sabor y el olor.32 Descerado Cuando el aceite esencial es extrado por expresin y no por arrastre de vapor, contiene, adems de la fraccin voltil terpenica, compuestos como las ceras del epicarpio de los frutos.36 Filtrado Para eliminar las impurezas de los aceites esenciales crudos se filtran con ayuda de tierras filtrantes u otros materiales que retienen el agua residual (sulfato de sodio anhidro, carbonato de magnesio, etc.)23
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Reacciones qumica Para obtener nuevos productos aromticos con mayor valor agregado, con notas ms agradables, entre ellas se encuentran: Esterificacin (cedre, vetiver y menta) Hidrogenacin (citronela) Hidratacin (trementina).34 Decoloracin Para esencias con colores fuertes. Petchuli Palo santo Clavo Lavado Para mejorar el olor desagradable debido a la presencia de cidos y fenoles se lava con soluciones de hidrxido de sodio al 1% o carbonato de sodio al 10%. Estandarizacin No es un proceso industrial en s, surge como una necesidad de homogenizar o normalizar la calidad de un producto debido a la infinidad de variables que modifican sus caractersticas. Se realiza para cumplir con las exigencias de la industria la cual requiere las mismas caractersticas independientemente del origen, ao y poca de cosecha. Aislamiento de productos especficos Algunas esencias son comercializadas para aislarse algunos componentes mayoritarios como el eugenol de la esencial de clavo o el cedrol de la del cedro.38 2.6. Usos de los aceites esenciales

Industria alimentaria Se emplean para condimentar carnes preparadas, embutidos, sopas, helados, queso, etc. Los aceites ms empleados por esta industria son el cilantro, naranja y menta, entre otros. Tambin son utilizados en la preparacin de bebidas alcohlicas y no alcohlicas, especialmente refrescos. Con respecto a esta utilidad podemos citar las esencias extradas del naranjo, limn, mentas e hinojo, entre otros. Estas esencias tambin se emplean en la produccin de caramelos, chocolates y otras golosinas. 33
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Industria farmacutica Se usan en cremas dentales (aceite de menta e hinojo), analgsicos e inhalantes para descongestionar las vas respiratorias (eucalipto). El eucalipto es muy empleado en odontologa. Son utilizados en la fabricacin de neutralizantes de sabor desagradable de muchos medicamentos (naranjas y menta, entre otros). Industria de cosmticos Esta industria emplea los aceites esenciales en la produccin de cosmticos, jabones, colonias, perfumes y maquillaje. En este campo se pueden citar los aceites de geranio, lavanda, rosas y pachouli. Industria de productos de uso veterinario Esta industria emplea el aceite esencial de Chenopodium ambrosoides muy apreciado por su contenido de ascaridol, vermfugo. Tambin requiere limoneno y mentol como insecticidas. Desodorantes industriales Actualmente se ha desarrollado el uso de esencias para disimular el olor desagradable de algunos productos industriales como el caucho, los plsticos y las pinturas. La industria de las pinturas emplea limoneno como disolvente biodegradable. Tambin se imparte olor a juguetes. En textiles, como enmascaradores de olores en tratamientos con mordientes antes y despus del teido. En papelera, para impregnar de fragancias cuadernos, tarjetas, papel higinico, toallas faciales. Industria tabacalera Demanda mentol para los cigarrillos mentolados. Biocidas e insecticidas Existen esencias con propiedades bactericidas, como el tomillo, clavo, salvia, mentas, organo, pino, etc. Otras son insecticidas: Contra hormigas: Mentha spicata (spearmint), Tanacetum y poleo Contra afidos: ajo, otros Allium, coriandro, anis, albahaca. Contra pulgas: lavanda, mentas, lemongrass, etc. Contra moscas: ruda, citronela, menta, etc. Contra piojos: Mentha spicata, albahaca, ruda, etc. Contra polilla: mentas, hisopo, romero, eneldo, etc.
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 Contra colepteros: Tenacetum, comino, ajenjo y tomillo, etc. Contra cucarachas: menta, ajenjo, eucalipto, laurel, etc. Contra nematodos: tagetes, salvia, calndula, Asparagus, etc.33 Tabla 5. Algunas especies con aceites esenciales de utilizacin comercial.

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CAPITULO III 3. Metodologa 3.1. Tipo de investigacin El presente proyecto es una investigacin documental debido a que se recurri a fuentes bibliogrficas que describen temas similares al investigado en este proyecto, y una investigacin experimental debido a que se aprob, cauterizo y se comprob la actividad antibacteriana y antimictica del aceite esencial del zacate de limn mediante ensayos en el laboratorio. 3.2 Muestra Se trabaj con 11300 gramos de zacate de limn (Cymbopogon citratus (DC) staff). 3.3 Materiales 3.3.1 Reactivos y medios de cultivo Sulfato de sodio anhidro Tricloruro de animonio Nitrato de plata Hidrxido de sodio Hidrxido de amonio Tartrato de sodio y potasio Sulfato cprico 2,4-DNFH Acido sulfrico concentrado Hidroxilamina Cloruro frrico Permanganato de potasio Etanol Agua purificada TAT TSA SAP 3.3.2 Microorganismos E.Coli ATCC 25922 S. Aureus ATCC 6538 Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404

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3..3.3 Materiales Frasco de vidrio ambar pequeo Vaso de precipitacin Matraz Probeta Cajas petri Tubos de ensayo Cuchillo Micropipetas Agitador Parafilm Tijeras Recipientes de plastico Balanza Estufa Cronometro 3.3.4 Equipos Equipos de destilacin o Balon de 5L o Manta de calentamiento o Trampa Dean Strark con llave de tefln o Refrigerante de bolas o Mangueras Picnometro o Picnometro calibrado, con termometro o Balanza anaitica IR o Equipos Shimadzu IR o Celdas de cloruro de sodio o Porta celdas

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3.4 Procedimiento experimental A continuacin se describe la metodologa que se sigue para realizar cada proceso. 3..4.1 Extraccin del Aceite Esencial por HD 1. Recolectar la planta en horas de la maana, y llevarla al lugar donde se va a realizar la extraccin del aceite esencial (limpiar la planta) 2. Cortar la planta en trozos pequeos (alrededor de 3cm a 5cm), para facilitar la extraccin del aceite esencial. 3. Pesar la planta cortada y posteriormente lavarla 4. Colocar la planta en el baln de HD y agregar agua purificada 5. Armar el equipo de HD: manta de calentamiento (100C), sobre la cual va el baln, conectado a la trampa de destilacin Dean Stark, la cual servir para separar el aceite esencial del resto de componentes de la planta y poderlos extraer; unida a la trampa de destilacin Dean Stark se encontrara un refrigerante, que permitir que el proceso se lleve a cabo, ya que permite el cambio de temperaturas, para que el vapor pase a estado liquido, El proceso de destilacin se llevara a cabo durante 2 horas. 6. Recoger el aceite esencial en un frasco de vidrio color mbar. 7. Secar el aceite con sulfato de sodio anhidro 8. Almacenar el frasco a temperatura fra (4C), hasta realizar las pruebas de caracterizacin. En este proceso se realizan los clculos para determinar el porcentaje de rendimiento del aceite esencial. A continuacin se presenta un diagrama de flujo del proceso par a la obtencin del aceite esencial de hierba luisa por HD:

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Grafico 4.1 Diagrama de flujo del proceso de extraccin de aceite esencial del zacate de limn por HD 3.4.2. Pruebas para determinar patgenos en el aceite esencial 3..4.2.1 Preparacin de la muestra: Colocar en un tubo de ensayo 1 ml de la muestra y 9ml de TAT. Agitar el tubo por 15 a 16 minutos en un agitador. 3.4.2.2. Prueba para determinar aerobios totales, mohos y levaduras Pasar 1ml del tubo de ensayo con la muestra a cuatro cajas petri Aadir en dos cajas 15 a 20ml del medio TSA. Aadir en las otras dos cajas petri 15 a 20 ml del medio SAP Agitar de forma que se permita una homogenizacin de la muestra con el medio de cultivo Dejar que el medio se solidifique a temperatura ambiente Incubar las cajas de TSA en forma invertidas en una estufa de 2 a 4 das a una temperatura de 32.5 +- 2.5 C. Incubar las cajas de SAP en forma invertida por 5 a 7 das a una temperatura de 22.5 +- 2.5C. Examinar las cajas petri cada 24hr y determinar si existe crecimiento Si existe crecimiento calcular con la ecuacin 3.10 Si no existe desarrollo en ninguna de las cajas reportar como<10ufc/ml A continuacin se presenta un diagrama de flujo del proceso para determinar patgenos en el aceite esencial:

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Grafico 4.14 Diagrama de flujo del proceso para determinar patgenos en el aceite esencial 3.3.2.3, Prueba para S. Aureus y E. Coli Incubar la botella con el medio TAT, de 16 a 24hrs a una temperatura de 32.5 +2.5C Con asa estril, sembrar en el medio Vj Staphylococus aureus y en EMB Escherichia coli Incubar cada una de las cajas por 24hrs a una tempera de 32.5 +- 2.5C Realizar la lectura Si existe crecimiento realizar las pruebas de identificacin Si no existe crecimiento reportar como ausencia. A continuacin se presenta un diagrama de flujo del proceso para determinar la presencia de S. Aureus y E. Coli en el aceite esencial:

Grafico 4.15 Diagrama de flujos del proceso para determinar patgenos en el aceite esencial 3.4. Pruebas para determinar la actividad del Aceite Esencial 3.4.1 Fase de adaptacin de los microorganismos: Colocar cada cepa ATCC liofilizada en tubos de ensayo que contiene caldo TSB. o E.Coli ATCC 25922 (bacteria) o S. Aureus ATCC 6538 (Bacteria) o Candida albicans ATCC 10231 (levadura)
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o Aspergillus niger ATCC 16404 (hongo) Incubar durante 24hrs, a temperatura de 35+- 2.5C las bacterias y la levadura. Incubar durante 48 a 72 horas a temperatura de 20 +- 3.5C el hongo. Sembrar las cepas ATCC en cajas petri que contienen los medios: o TSA para E.coli, S. Aureus y o SAP para C. Albicans, A. Niger. Incubar en forma invertida las cajas durante 24hrs a temperatura de 35 +- 2.5C para E.coli, S. Aureus y C. Albicans, A. Niger Incubar en forma invertida las cajas de SAP con A. Niger, durante 48 a 72 horas a temperatura de 20 +- 3.5C Ver si existe crecimiento. A continuacin se presenta un diagrama de flujo de la fase de adaptacin de los microorganismos:

Grafico 4.16 Diagrama de flujo de la fase de adaptacin de los microorganismos 3.4.2 Fase de crecimiento de los microorganismos En cajas petri que contiene el medio TSA sembrar las cepas de E.coli, S. Y Aureus, en el medio SAP sembrar C. Albicans, e incubar durante 24hrs a temperatura 35+2.5C. En cajas petri que contienen el medio SAP, sembrar las cepas de A. niger, e incubar durante 48 a 72 a temperatura 20+- 3.5C Ver si existe crecimiento
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Sembrar de cada cepa ATCC en tubos de ensayo que contienen caldo TAT, e incubar para bacterias y levaduras durante 24hrs a temperatura 35+-2.5C, la cepa ATCC de hongos incubar pro 48 horas a temperatura de 20+-3.5C Nuevamente sembrar en cajas petri que contienen el medio TSA las cepas de E.coli, S. Y Aureus en SAP C. Albicans, incubar durante 24hrs a temperatura 35+2.5C, y en cajas petri que contiene el medio SAP sembrar las cepas de A. niger incubar por 48hrs a 72 hrs a temperatura de 20+- 3.5C Ver si existe crecimiento A continuacin se presenta un diagrama de flujo de la fase de crecimiento de los microorganismos:

Grafico 4.17 Diagrama de flujo de la fase de crecimiento de los microorganismos 3.4.3 Prueba para determinar la actividad antimictica y antibacteriana de aceite esencial: Utilizar los tubos de TAT con los microorganismos listos del paso fase de crecimiento Colocar en tubos de ensayo que contienen TAT cada uno de los microorganismos a trabajar hasta llegar a una escala Mc. Farland 0.5
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Realizar controles de cada tubo, y de cada caja. Dividir cada caja petri en 4 mitades En tubos de ensayo colocar 500l de TAT con cepas ATCC a escala de Mc. Farland 0.5 y 500l de aceite esencial. Encender el cronometro Sembrar con aza por estriado las cepas ATCC de bacterias con aceite esencial en TSA a: imin, 2min, 5min, y 10min, e incubar durante 24hrs a temperaturas 32.5 +2.5C Sembrar con aza por estriado las cepas ATCC de hongo y levadura con aceite esencial en el medio SAP a: 1min, 2min, 5min y 10min, e incubar durante 24 horas la levadura a 32.5 +- 2.5C y el hongo durante 48 a 72 hrs a 2.5+-2.5C Realizar la correspondiente lectura Si existe crecimiento reportar como positivo en el tiempo encontrado el desarrollo del microorganismo A continuacin se presenta un diagrama de flujo de la fase del proceso para determinar la actividad del aceite esencial:

Grafico 4.18-a Diagrama de flujo para determinar la actividad del aceite esencial.

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Grafico 4.18-b Diagrama de flujo para determinar la actividad del aceite esencial

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CAPITULO IV 4. RESULTADOS Rendimiento del aceite esencial En la tabla 7. Se indica el porcentaje de rendimiento que se obtuvo del aceite esencial recolectado.

Pruebas para determinar patgenos en el aceite esencial En la tabla 8 se indican los resultados obtenidos de la ausencia de patgenos en el aceite esencial del zacate de limn

P= positivo N=negativo A cada muestra se realizaron las pruebas de patgenos. Se tienen como resultado que el aceite de esencial no presenta patgenos.

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Prueba para determinar la actividad antimictica y antibacteriana de aceite esencial: Tabla 9. Determinacin antibacteriana del aceite esencial de limn contra la E.coli

Tabla 10. Determinacin de la actividad antibacteriana del aceite esencial del zacate de limn contra S.aureus

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Tabla 11. Determinacin de la actividad antimictica del aceite esencial del zacate de limn contra C.albicans

Tabla 12. Determinacin de la actividad antimictica del aceite esencial del zacate de limn contra A. niger

A cada muestra se les realizo las pruebas para determinar la actividad antibacteriana y antimictica. Se tiene como resultado que el aceite esencial del zacate de limn es un potente antimictico ya que inhibe el desarrollo de hongos y levaduras en un tiempo muy corto. Tambin se demostr que posee actividad antibacteriana pero inhibe el desarrollo de las bacterias en un tiempo ms largo.

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CAPITULO V 5. DISCUSIN RESULTADOS

En algunas especies forneas se ha logrado identificar el 89 % (34 compuestos) de los constituyentes de este aceite, como mayoritarios aparecen el geraniol (39,8 %) y el nerol (32 %).4 Roig registra en la especie cubana la presencia de geraniol, linalol, methilheptona, citronelol, limoneno, diterpenos y otras sustancias.25 En particular, la empleada por los autores posee un elevado contenido de citral. Las bacterias Gram positivas fueron ms sensibles, similar a lo informado por Lemos T,Hdez L y Almazora L. Sin embargo, algunos autores sealan lo contrario. Se conoce que diferencias genticas entre algunas cepas de Cymbopogon ejercen una gran influencia en la actividad antibacteriana del aceite esencial.26 Esta accin se atribuye al citral, particularmente al geraniol (alfa citral) y al nerol (beta citral), incluso se plantea que el mirceno, aunque solo no muestra tal actividad, como la parte del aceite, incrementa la accin cuando se mezcla con los anteriores. 27, 28 Los resultados de la actividad antifngica se corresponden con los de la literatura. Algunos ensayos in vitro indican que un 80 % de las cepas de dermatofitos probadas han sido inhibidas por el aceite esencial, incluso mencionan una cepa de M. canis entre las ms resistentes.29 Otros, notifican la actividad en algunas especies del gnero de Aspergillus. Algunos informes hacen responsable de la actividad antifngica a la mezcla de compuestos en el aceite y no al citral como un compuesto independiente.30 En otras especies como C. martini, al D-limoneno y al beta mirceno, entre otros.31 Con seguridad habra que profundizar en la composicin de ambos aceites esenciales, la cual es determinante en la accin biolgica y que puede variar incluso dependiendo de la situacin geogrfica de la especie. 32 Se puede concluir que la evaluacin del aceite esencial mostr el potencial antimicrobiano de esta especie medicinal y posibilit desarrollar, a partir de una fuente natural abundante, una crema con actividad farmacolgica definida. Como componente mayoritario del aceite se registr el citral.

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CAPITULO VI 6. CONCLUSIN El aceite esencial del zacate limn obtenido mediante destilacin por arrastre de vapor conservo todas sus caractersticas organolpticas durante cuatro meses, almacenndolo a 4 C y con proteccin a la luz ultravioleta del sol. El aceite esencial del zacate limn presenta altas concentraciones del aldehdo citral que junto con otras molculas con grupos funcionales en menores proporciones: -pineno, linalol, trans crisanterma, lemonol, geranil acetato, le dan la actividad antimicrobiana que posee el aceite esencial. El aceite esencial del zacate limn posee mayor actividad antimicrobiana, ya que inhibi totalmente el crecimiento de la levadura C. albicans ATCC 10231 y del hongo A. nigers ATCC 16404. El aceite esencial extrado de la planta del zacate limn mexicana posee una alta actividad antimictica inhibiendo el crecimiento de la levadura C. albicans, a diferencia de los datos obtenidos en la bibliografa del aceite esencial proveniente de la planta zacate limn cubana que no inhibe el crecimiento de este microorganismo. El porcentaje de rendimiento del aceite esencial del zacate limn vara entre los meses de mayo (0.714%-1485%), debido a factores como condiciones climticas al momento de la cosecha las cuales iban variando de templado-hmedo a clidohmedo, o viceversa, la cantidad de planta recolectada y el tiempo que transcurri desde que la planta que cosechada hasta el momento de la destilacin. Siendo el clima ms apto para cosechar la planta del zacate limn es el clido-hmedo (dato obtenido de la bibliografa) Los datos obtenidos en el aceite esencial del zacate limn de: densidad relativa, ndice de refraccin y pH concuerdan con los datos encontrados en la bibliografa. Las investigaciones del aceite esencial del zacate limn es muy importante para la obtencin de productos 100% naturales como antimicrobiales.

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CAPITULO VII 7. RECOMENDACIONES - Se debe destilar las hojas del zacate limn el mismo da que se las cosecho para evitar disminucin en el rendimiento del aceite esencial - Se debe limpiar la planta antes de pesarla, para evitar contaminantes. - Controlar la temperatura a la cual va a ser extrado el aceite esencial para evitar que este pierda sus caractersticas organolpticas. - Las condiciones de almacenamiento deben ser apropiadas como bajas temperaturas y protegidos de los rayos UV para evitar reacciones que cambien las caractersticas propias del aceite por un periodo determinado de tiempo. - No se aconseja el consumo (oral o cutneo) del aceite esencial puro, pues constituye un producto de alta concentracin y puede ser perjudicial para la salud, debido a que al estar tan concentrado puede producir quemaduras, manchas, entre otras molestias. Razn por la cual se lo debe diluir en un aceite base. - Para tener un estimado real del rendimiento de aceite esencial de la planta del zacate limn, se debe realizar un estudio tomando en consideracin factores como la fecha de cosecha (un mnimo de 6 cosechas variando de mes) cantidad de planta recolectada, el clima, el cultivo, entre otros. - Sera muy interesante continuar la investigacin del aceite del zacate limn y realizar una comparacin de la actividad y rendimiento del aceite esencial de las tres regiones del pas, haciendo un control de malezas, riego y abono para determinar los factores temperatura y altura en la concentracin y actividad que estos pueden presentar.

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CAPITULO VIII 8. BIBLIOGRAFIA 1.- ACOSTA, Misael. 1995, Vademecum de Plantas Medicinales del Ecuador, 1 Edicin, Editorial Ediciones Abya-Yala, Quito-Ecuador, pag 164. 2.-. SOTO, Rafaela. Agrotecnologa para el cultivo de la caa santa o zacate limn (Cymbopogon citratus). 2002 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. 3.- BERNAL, Henry. 1995, 270 Plantas Medicinales Iberoamericanas, 1 Edicin, Editorial Presencia Ltda., Santaf de Bogota-Colombia, pg.: 308-309. 4.- RODRIGUEZ CHANFRAU, Jorge E, FUENTES, Leticia, PARDO RUIZ, Zenia et al. Estabilidad de extractos fluidos al 70 % de Cymbopogon citratus. Rev Cubana Plant Med. . Mayo-ago. 2003, vol.8, no.2 5.-WEBCOLOMBIA. Limonsillo. [online]. 2006 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. 6.- RODRIGUEZ CHANFRAU, Jorge E, FUENTES, Leticia, PARDO RUIZ, Zenia et al. Estabilidad de extractos fluidos al 70 % de Cymbopogon citratus. Rev Cubana Plant Med.. Mayo-ago. 2003, vol.8, no.2 , p.0-0. 7-. PIZARRO, Arelis. Cymbopogom Citratus (DC) Stapf (Caa Santa). [online]. 2005 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. 8.- SOTO, Rafaela, VEGA, Gilberto, TAMAJN, Aldo. Instructivo tcnico del cultivo de Cymbopogon citratus (D.C) Stapf (caa santa). Rev Cubana Plant Med. [online].Febrero. 2002, vol.7, no.2 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. 9.- HERBOTECNIA. Lemon Gras. [online]. 2002. 10.-BREMNESS, Lesley. 1997, Hierbas Aromticas, 1. Edicin, editorial grupo Zeta, Barcelona-Espaa, pag 22-23. 11.- WHITE, Alan. 1981, Hierbas del Ecuador, 1 Edicin, Editorial Ediciones Libri Mundi, Quito-Ecuador, pg.: 165-166. 12.- SOTO, Rafaela. Agrotecnologa para el cultivo de la caa santa o zacate limn (Cymbopogon citratus). [online]. 2002 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. Disponible en la World Wide Web: http://www.monografias.com/trabajos14/zacate-limon/zacate-limon.shtml
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13.- PIZARRO, Arelis. Cymbopogom Citratus (DC) Stapf (Caa Santa). [online]. 2005 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. Disponible en la World Wide Web http://www.monografias.com/trabajos29/cana-santa/cana-santa.shtml 14.-SOTO, Rafaela, VEGA, Gilberto, TAMAJN, Aldo. Instructivo tcnico del cultivo de Cymbopogon citratus (D.C) Stapf (caa santa). Rev Cubana Plant Med. [online].Febrero. 2002, vol.7, no.2 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. Disponible en la World Wide Web: 15.- HERBOTECNIA. Lemon Gras. [online]. 2002 [citado 18 Mayo 2006], p.0-Disponible en la World Wide Web: http://www.herbotecnia.com.ar/exotica-lemongras.html 16.- COTO, O., CRUZ, M., POLANCO, J. Gua Tcnica del cultivo "Zacate Limn" [online]. 1983 [citado 18 Mayo 2006], p.0-0. Disponible en la World Wide Web: http://www.agronegocios.gob.sv/comoproducir/guias/zacatelimon.pdf 25.- Roig Mesa JT. Plantas Medicinales, aromticas o venenosas de Cuba. La Habana: Editorial Ciencia y Tcnica, Instituto del Libro; 1974. 26.- Pattnaik S, Subramayam VR, Kole CR, Sahoo S. Antibacterial activity of essential oils from Cymbopogon inter and intraspecific differences. Microbios. 1995; 84(241):239-45. 27.- Syed M, Khalid MR, Chaudhang FM. Essential oil of Gramineae family having antibacterial activity. [(Cymbopogom citratus), (C. martinii) y (C. jawarancuso)] oils (part I). Pakistan J Scientific Industrial Res.1990; 33(12):529-31. 28.- Onawunmi GO, Yisak WA, Ogunlana EO. Antibacterial constituents in the essential oil of Cymbopogom citratus (DC.) Stapf. J Ethnopharmacol. 1984;12:279-86. 29 - Kishore N, Mishra AK, Chansouria JPN. Fungitoxicity of essential oils agains dermathophytes. Mycoses. 1993; 36(5-6):211-5. 30.- Lima GO, Gompertz OF, Paulo MQ, Griesbrecht A.M. In vitro antifungal activity of essential oils against clinical isolates of dermathophytes. Rev Microbiol. 1992;23(4):235-48. 31.- Wilson CL, Solar J.M, El Ghaouth A, Wisniewski ME. Rapid evaluation of plant
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extracts and essential oils for antifungal activity against Botrytis cinerea. Plant Dis. 1997;81(2): 204-10. 32.- Wannissorn B, Jafikasen S, Soontorntanasart T. Antifungal activity of Lemon grass oil and lemon grass cream. Phytother Res. 1996; 10(7): 551-4. 34.- ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS (AOAC). 2000, 17 edicin, Editorial Association of Official Analytical Chemists, Virginia-Estados Unidos, pag 133-142. 35.- DOMIGUEZ, Xavier. 1973, Mtodos de Investigacin Fotoqumicas, 1 edicin, Editorial Limusa, Mxico, pag: 229-238; 225-226. 36.- GAVIRA, Blanca. 1993, Manual de Practicas de Control Microbiolgico en la Industria Alimenticia, 1 edicin, editorial de la Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, pag: 00. 37.- JORGENSEN, Peter, LEON Susana. 1999, Catalogue of the Vascular Plants of Ecuador, Volumen 75, Editorial Missouri Botanical Gardel Press, Missouri-Estados Unidos, pag 815-816. 38.- LOCK, Olga. 1988, Investigacin Fotoqumica, 1 Edicin, Editorial Fondo, Per, pag: 21-40 39.- NEIL, Mayadele; SMITH Ann; HECKELMAN Patricia. 2004, The Merck Index, 13va edicin, Editorial Staff, Estados Unidos, pag: 405-406

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CAPITULO IX CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Actividades Seleccin de la materia prima (zacate de limn) Plantacin de la muestra (zacate de limn) Cultivo del zacate de limn (Cymbopogon citratus) Cosecha del zacate de limn (Cymbopogon citratus) Poscosecha del zacate de limn, (Cymbopogon citratus) Proceso de extraccin del aceite esencial (Cymbopogon citratus) Obtencin del aceite esencial del zacate de limn (Cymbopogon citratus) Aplicacin de pruebas antimicticas y antibacterias del zacate de limn (Cymbopogon citratus) Presentacin de los resultados Presentacin del protocolo de investigacin Marzo Abril Mayo Junio

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