CORPORACIÓN UNIVERSITARIA LASALLISTA

INSTITUCIÓN CORPORACIÓN UNIVERSITARIA LASALLISTA

UNIDAD CENTRO DE LABORATORIOS
LABORATORIO Química
ASIGNATURA Bioquímica de los Alimentos
PROGRAMA Ingeniería de Alimentos
NOMBRE DE LA Análisis de proteínas por método
PRÁCTICA colorimétrico
CÓDIGO DE LA P RÁCTICA

INVESTIGACIÓN PREVIA

En esta práctica, el estudiante del curso de bioquímica de los alimentos, deberá aplicar los
conocimientos teóricos adquiridos en clase para explicar un fenómeno ocurrido en una situación
real. Para esto, el estudiante deberá seleccionar una matriz alimentaria y planteará una hipótesis
relacionada con el contenido de proteína de este alimento y que pueda ser comprobada en el
laboratorio mediante la utilización del método de Biuret.

1. Consultar el principio de funcionamiento, ventajas, desventajas, de los siguientes

métodos para análisis de proteínas:

 Método de kjeldahl
 Método de biuret
 Método de lowry
 Método del ácido bicinconínico (BCA)
 Método de absorción UV a 280nm
 Método de adhesión de colorante
 Método de bradford
 Método de la ninhidrina
 Método turbidimétrico

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Las proteínas son moléculas de alto peso molecular, que contienen carbono, hidrógeno, oxígeno
y con frecuencia, azufre. Las unidades fundamentales de las proteínas son los aminoácidos,
compuestos orgánicos que contienen grupos amino y carboxilo y que por lo tanto, tienen
propiedades anfotéricas; los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar dipéptidos,
oligopéptidos y polipéptidos. Se considera que las proteínas están formadas por polipéptidos que
adquieren diferentes configuraciones espaciales. Las propiedades fisicoquímicas de las
proteínas están determinadas por la secuencia de aminoácidos (estructura primaria), su
configuración espacial, las fuerzas interiónicas, puentes de hidrógeno (estructuras secundaria y
terciaria).
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las
proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no
establecen fuertes interacciones intermoleculares, como si lo hacen las proteínas fibrosas. De tal
manera que las proteínas globulares son solubilizadas generalmente en forma de suspensiones
coloidales.

En general, existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos

métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b)
la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos
colorantes. Específicamente, el método de Biuret es uno de los métodos más utilizados debido a
su simplicidad. Se basa en la formación de un complejo coloreado en medio básico entre el Cu 2+
y los grupos NH de los enlaces peptídicos. 1Cu 2+ se acompleja con 4 NH (Figura 1). La
intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. Sin
embargo, la sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de
proteínas en preparados muy concentrados.

Figura 1. Principio de funcionamiento del método de Biuret para determinación de proteínas.

El cobre (Cu2+) se une a los grupos NH de los enlaces peptídicos, formando un complejo de color violeta

La cantidad de complejo Cu-Proteína puede ser determinado mediante espectrofotometría. De

manera general y como se muestra en la Figura 2, la luz blanca se puede dividir en cada uno de
los colores (longitudes de onda) que la componen, de tal manera que al interactuar con la
proteína (específicamente complejo Cu-Proteína), algunas de esas longitudes de onda serán
absorbidas por la muestra y otras se transmitirán fuera de ella.

Figura 2. Representación esquemática de la interacción de la luz (longitudes de onda) con una

proteína.
Como se puede apreciar en el esquema de la Figura 2, la muestra recibe todas las longitudes de
onda visibles (400 – 700 nm), pero deja pasar solamente las longitudes de onda
correspondientes al violeta, el naranja y el rojo; de tal manera que la longitud de onda
correspondiente al color verde y parte del amarillo (500-600) fueron absorbidas por la muestra.

Específicamente, el complejo Cu-Proteína formado en el ensayo de Biuret, absorbe la luz a una

longitud de onda de 540 nm y la intensidad de esa absorción (que se mide como absorbancia) es
directamente proporcional a la cantidad de complejo Cu-Proteína (Figura 3).

Figura 3. Curva de calibración. Relación lineal entre concentración y absorbancia

En general, en el caso de análisis de proteínas, se acostumbra preparar una curva de calibración

con un estándar, es decir, una proteína de concentración conocida (generalmente albúmina), la
cual se hace reaccionar con el reactivo de Biuret y se determina su absorbancia, construyendo
una gráfica (curva de calibración) como la que se muestra en la Figura 3, sobre la cual es posible
interpolar algún valor de absorbancia y relacionarlo con un valor de concentración, siendo el
principio para el análisis de proteínas (comparación de la muestra con un estándar mediante una
curva de calibración)

OBJETIVOS

 Determinar el contenido total de proteína en una muestra de alimento utilizando el

método espectrofotométrico de Biuret.

PALABRAS CLAVES

Proteínas, espectrofotometría, método de Biuret

EQUPOS E INTRUMENTRAL

EQUIPO CAPACIDAD CANTIDAD

Micropipeta 20-200 1
Micropipeta 100-1000 1
Micropipeta multicanal 30-300 1
Plato 96 pozos 1
Tubos de reacción 1.5 mL 5 (por grupo)
Agitador mecánico - 1
Sonicador - 1
Microcentrífuga 10.000 rpm 1
Mortero -- 1
Tabla para picar y cuchillo -- 1 (por grupo)
Espectrofotómetro Lector de platos 1
REACTIVOS Y MUESTRAS

SUSTANCIA CONCENTRACIÓN CANTIDAD

Estándar de albúmina 40 mg/mL 5 mL
Reactivo de Biuret (Disolver 0.19 g de CuSO4.5H2O y 0.34 g de Na2EDTA en -- 50 mL
35 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitacion
constante 10 ml de solución fresca de NaOH 5 M. Aforar a 50 ml con agua
destilada)
Solución salina (NaCl 2.12 g / 250 mL) 0.85 % p/v 250 mL

PRECAUCIONES O RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD

Reciba las recomendaciones acerca del manejo del espectrofotómetro y las micropipetas
Consulte la ficha de seguridad de cada reactivo
Utilice los implementos de seguridad de acuerdo con el perfil de riesgo de cada muestra

PROCEDIMIENTO

ETAPA 1 Explicación general del procedimiento del laboratorio (15 minutos)

ETAPA 2 Preparación de la muestra (Trabajo preliminar, consulte el procedimiento más

adecuado dependiendo su muestra)

 Para muestras sólidas: tome una cantidad suficiente de muestra, disuélvala en

solución salina, de tal manera que se asegure una concentración de proteína alrededor
de 150 mg/mL, de acuerdo con el valor que se espera. Proceda a macerar la muestra y
posteriormente sométala a sonicación en 3 ciclos de 30 segundos cada uno, para
asegurar el rompimiento de las células y la liberación de las proteínas. Transfiera 1 mL
del homogenizado a un tubo de reacción y centrifugue a 10.000 rpm durante 10 minutos.

 Para muestras líquidas: centrifugue 1 mL de la muestra a 10.000 rpm durante 10

minutos para garantizar la separación de cualquier material particulado.

ETAPA 3 Análisis de proteínas

1. Prepare una dilución de la muestra obtenida en el punto anterior tomando 100 µl del
sobrenadante y mezclándolos con 900 µl de solución salina.
2. Prepare la curva de calibración a partir de la solución de albúmina (40 mg/mL), tomando
en cada tubo de reacción 0, 25, 125, 250, 500 y 1000 µl y diluyéndolos con solución
salina hasta 1 mL, obteniendo así concentraciones de 0 (blanco), 1, 5, 10, 20 y 40
mg/mL.
3. Dispense 270 µl de reactivo de Biuret en todos los pozos del plato que se vayan a
utilizar.
4. Tome 30 µl, ya sea de la muestra diluida o de cada una de las concentraciones de
albúmina y dispénselos en el pozo indicado.
5. Mantenga el plato en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras
se desarrolla el color del complejo Cu-Proteína.
6. Lea a 540 nm
Siga este esquema para la correcta ubicación de las muestras y el estándar en el plato.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Blanco Blanco Blanco M3 M3 M3 M11 M11 M11 M19 M19 M19

B STD1 STD1 STD1 M4 M4 M4 M12 M12 M12 M20 M20 M20

C STD5 STD5 STD5 M5 M5 M5 M13 M13 M13 M21 M21 M21

D STD10 STD10 STD10 M6 M6 M6 M14 M14 M14 M22 M22 M22

E STD20 STD20 STD20 M7 M7 M7 M15 M15 M15 M23 M23 M23

F STD40 STD40 STD40 M8 M8 M8 M16 M16 M16 M24 M24 M24

G M1 M1 M1 M9 M9 M9 M17 M17 M17 M25 M25 M25

H M2 M2 M2 M10 M10 M10 M18 M18 M18 M26 M26 M26

STD: Estándar, M: Muestra

APLICACIONES

Consulte acerca del contenido de proteínas de los alimentos más comunes de la dieta típica de
varias regiones colombianas.

ELABORÓ

Julián Londoño Londoño, QF, PhD. Docente Programa de Ingeniería de Alimentos, Corporación
Universitaria Lasallista.

BIBLIOGRAFIA

Bernal de Ramírez,I. 1993. Análisis de alimentos, Academia Colombiana de ciencias exactas,

físicas y naturales Colección Julio Carrizosa Valenzuela, No 2. Bogotá.

Copeland RA (2000) Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols, 2nd
edn. New York: Chapman and Hall.

Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett
Publishers. U.S.A. pp 209-212.

REGISTRO DE RESULTADOS Y PREINFORME

 Tome los datos de absorbancia vs concentración del estándar de albúmina y grafique la

curva de calibración.
 Utilizando la ecuación de la recta, interpole el valor de concentración de su muestra.
 Concluya con respecto a la hipótesis planteada al iniciar el experimento.