Biotecnología de Materiales.

Curso 2011-2012

Tema 2 – Formación de Biofilms

BIOPELÍCULAS = BIOFILMS
Characklis & Marshall (1990): “Conjunto de células inmovilizadas en un sustrato y embebidas en
una matriz exopolimérica de origen microbiano que las mantiene unidas junto a otras sustancias
del medio en que se encuentran”

FASES DE FORMACIÓN DE UNA BIOPELÍCULA

1. Transporte a la superficie
Formación del SUSTRATO CONDICIONANTE previa a la llegada de los microorganismos
Llegada de los microorganismos planctónicos (Gravedad, Difusión, Cilios y Flagelos, Agregados
procedentes de otras biopelículas, …).
2. Adhesión inicial “reversible”
En estas interacciones iniciales entre las células microbianas y el sustrato participan fuerzas
electrostáticas y fuerzas hidrofóbicas e hidrofílicas.
Si las condiciones del medio no resultan óptimas para el desarrollo del biofilm, las bacterias
pueden desprenderse y volver al estado planctónico, buscando otros nichos más apropiados
3. Adhesión “irreversible”, Attachment
Esta unión con el sustrato es más estable. Se forman microcolonias que van aumentando su
tamaño mediante procesos de multiplicación de las células antiguas y de las que se van
incorporando desde el medio. Las células comienzan a segregar sustancias poliméricas
extracelulares (EPS) y quedan englobadas en una matriz protectora, dando al conjunto mayor
cohesión y fuerza de unión. Esta matriz contribuye a muchas de las características estructurales y
funcionales del biofilm maduro.
4. Colonización
Se produce el crecimiento de las microcolonias, formándose macrocolonias, con mayor número
de células, donde hay mayor heterogeneidad metabólica y fisiológica. La estructura final de la

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macrocolonia se describe, en el grupo de las pseudomonas, como un “champiñón” de bordes bien

definidos y el conjunto de champiñones y los canales que los separan es lo que se conoce como
biofilm maduro. Una vez formado, el mantenimiento de este biofilm maduro requiere procesos de
diferenciación celular que permiten a las células organizarse estructuralmente y distribuir las
actividades metabólicas entre las distintas células que forman el consorcio. Para ello, los
microorganismos sésiles expresan genes que no lo hacían cuando estaban en estado planctónico
5. Desprendimiento, Detachment
En cualquier momento durante la formación del biofilm, se pueden producir desprendimientos de
microorganismos o pequeños fragmentos de biopelícula que pasan al medio y son transportados a
otras zonas. La liberación de las bacterias desde el biofilm es el proceso que menos se conoce, se
han descrito algunas proteínas-enzimas con la función de degradar la matriz de EPS y así
favorecer esta fase de detachment.
En todas estas fases, es necesario un alto grado de interacción celular donde se hayan implicados
mecanismos de comunicación célula-célula a través de diferentes señales químicas o Quorum
sensing.
SUSTANCIAS POLIMÉRICAS EXTRACELULARES
(Extracellular Polymeric Substances, EPS)
Characklis & Wilderer (1989): “Polímeros orgánicos de origen microbiano y que, en las
biopelículas, son responsables de la cohesión entre las células y otras partículas del medio así
como de la unión de esta estructura al sustrato”
Las EPS proporcionan una matriz viscosa en la que se localizan las células y actúan como una
capa protectora frente a agentes potencialmente peligrosos, así como una fuente de carbono y
energía en condiciones limitantes. Son consideradas las principales responsables de las
propiedades biológicas y fisicoquímicas de los biofilms. Su proporción en los biofilms puede
variar entre el 50% y el 90% del contenido total en materia orgánica.

Polisacáridos
Los polisacáridos suelen ser los componentes mayoritarios de las EPS. Basándose en la
composición química, la especificidad antigénica y la biosíntesis, los polisacáridos bacterianos se
han dividido en dos grupos, denominados polisacáridos específicos y no-específicos.
Polisacáridos específicos o antigénicos: poseen propiedades inmunológicas y son específicos de
ciertas cepas bacterianas. La especificidad de estos polisacáridos reside en la posición y
configuración de uniones glucosídicas.
Polisacáridos no-específicos se encuentran en gran variedad de cepas bacterianas y son por regla
general estructuralmente diferentes y más simples que los polisacáridos específicos.
La composición del exopolisacárido es diferente en cada bacteria y varía desde alginato en P.
aeruginosa, celulosa en S. typhimurium, poly-N-acetilglucosamina en S. aureus, etc. Además,
estudios recientes han puesto de manifiesto que incluso una misma bacteria, dependiendo de las
condiciones ambientales en las que se encuentre, puede producir distintos exopolisacáridos como
componentes de la matriz del biofilm.

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Proteínas
Lectinas: se unen irreversiblemente a estructuras específicas de los hidratos de carbono mediante
puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. En las bacterias, muchas de ellas parecen estar
implicadas en la patogénesis mediando en la adhesión específica a la célula del huésped. En el
biofilm, una función para estas proteínas sería mediar la adhesión de la célula a la matriz de EPS
o a otras células de la comunidad del biofilm,
Liasas y polisacarasas: degradan polisacáridos para originar oligosacáridos. Están implicadas en
la biosíntesis y utilización de estos compuestos. En el contexto del biofilm, la combinación de
varias liasas permitiría la degradación completa de los exopolisacáridos de la matriz de EPS
proporcionando una fuente de nutrientes a los microorganismos. Esta degradación colectiva de
polisacáridos podría a su vez modular el desprendimiento de las bacterias del biofilm.

ADN
Es un componente importante de la matriz de EPS, aunque su origen es incierto. Se pensaba que
procedía fundamentalmente de células muertas y que no tenía un papel en el biofilm, pero hay
estudios que sugieren que el ADN es un componente estructural de la matriz en los primeros
estadíos del desarrollo de ciertos biofilms.
Funciones de los EPS
Adhesión de las células al sustrato
Estructura (gel que une las células entre sí)
Protección frente a agentes externos: barrera física y química (Predadores, sistema inmune,
desinfectantes, toxinas, luz UV,…)
Patogénesis: infecciones bacterianas crónicas
Fuente de energía y de nutrientes
Desecación

QUORUM SENSING (QS) = SEÑAL DE QUÓRUM

Mecanismo de comunicación célula-célula, que se utiliza para la regulación de procesos celulares

dentro de una comunidad. Basado en la secreción de moléculas señal. Las células vecinas

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“sienten” la densidad poblacional y se produce un cambio de la expresión génica que tiene como
resultado el comportamiento social coordinado: biopelícula ~ organismo multicelular.
1. Producción constante de sustancias difusibles: AUTOINDUCTOR
2. Masa CRÍTICA de células: Concentración UMBRAL de autoinductor
3. Activación transcripcional: Cambia expresión génica
Entre las bacterias Gram negativas, la señal de quórum dependiente de AHL (N-Acyl-L-
Homoserine Lactone) es la más conocida. La participación de un sistema de QS en la formación
de biofilm se indicó por primera vez en 1998 para P.aeruginosa, al detectarse un mutante (en el
sistema las) que formaba biofilms indiferenciados al ser comparados con los formados por la
cepa salvaje con sus champiñones y canales, lo que llevó a pensar que el sistema las era necesario
para el desarrollo de la arquitectura del biofilm. El sistema las consiste en un activador
transcripcional LasR y la sintasa de AHL LasI que dirige la síntesis de N-3-oxo-dodecanoil-
homoserina lactona (3-oxo-C12-HSL), el autoinductor. Cuando el autoinductor alcanza una
concentración crítica y se une a su activador transcripcional se produce la expresión de toda una
serie de genes implicados en la formación y desarrollado del biofilm maduro, así como genes de
virulencia implicados en la infectividad, daño tisular y generación de la respuesta inflamatoria del
huésped.
INTERCAMBIO GENÉTICO EN LOS BIOFILMS
Transferencia horizontal de genes (parasexualidad): un organismo adquiere información genética
de otro organismo en un proceso independiente de la reproducción, dentro de la misma
generación. Se puede dar entre organismos de la misma especie o de especies diferentes.
1. Transformación
Requiere la unión y captura de ADN libre hacia el interior bacteriano y la expresión de la
información genética que contiene. El proceso que permite la transformación se denomina
competencia, que es un estado transitorio que precisa que las células se encuentren activas
metabólicamente y capaces de activar un conjunto de genes
específicos.
En el caso de las bacterias gram-positivas la inducción de la
competencia ocurre en la fase exponencial de crecimiento y
parece estar asociado a procesos de quorum sensing, mediante la
CÉLULA producción, exportación y captura subsiguiente por las células
COMPETENTE
vecinas de un pequeño péptido señal llamado factor de
competencia (CF). Cuando el CF alcanza una cantidad crítica es
detectado por el activador transcripcional (una histidina-kinasa
unida a membrana) que inicia la inducción de una cascada de
genes específicos de competencia, que provocan la degradación
parcial y controlada de la pared celular, de modo que quedan al
descubierto complejos de proteínas que son sitios de unión al
ADN exógeno. La transformación comienza con la unión del
ADN de doble hélice al exterior celular de forma independiente de su secuencia. Al poco de
unirse, el ADN va pasando al interior del citoplasma y recombina con la zona complementaria
del cromosoma bacteriano, expresándose.

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El ADN capturado puede conferir un fenotipo ventajoso como la resistencia a algún tóxico o un
aumento de la actividad metabólica. Pero también puede ser heterólogo o inservible para
recombinación y expresión o incluso puede que siendo homólogo y se exprese no confiera
ninguna ventaja al receptor.
En el caso de bacterias gram-negativas, la transformación implica la captura de secuencias
específicas de DNA de doble hélice que deben ser reconocidas por la célula receptora. Además es
un proceso que ocurre entre bacterias de la misma especie o de especies muy próximas durante la
fase estacionaria de crecimiento.
2. Conjugación
El material genético se transfiere desde la bacteria donadora hasta la
bacteria receptora sin pasar por el medio de suspensión. El intercambio
de material genético depende del contacto directo entre dos células y
está polarizado, es decir, ciertas cepas designadas F+ (fertilidad más)
actúan siempre de donadoras y otras, F- (fertilidad menos) actúan como
receptoras. Las cepas F+ contienen un plásmido, llamado plásmido F,
que lleva todos los genes que codifican la transferencia genética por
conjugación.

3. Transducción
Implica la transferencia del material genético empaquetado en unas
partículas fagocíticas. Como la partícula es más o menos estable la
célula donadora y receptora no necesitan encontrarse en el mismo
sitio simultáneamente. En este caso la célula receptora debe tener
sitios específicos de unión que sean reconocidos por el fago
atacante. La transducción puede ser generalizada, cuando cualquier
DNA bacteriano es empaquetado y transferido, o especializada
cuando sólo algunos genes particulares pueden ser transferidos.

PROPIEDADES DE LAS BIOPELÍCULAS

Las biopelículas parecen ser una forma de vida muy favorable para los microorganismos así
como una estrategia de supervivencia.
En los biofilms las bacterias están unidas entre sí y a la superficie del material, viven
continuamente a altas densidades celulares en poblaciones mixtas, facilitando los procesos de
reconocimiento celular gracias a la estrecha proximidad de las bacterias que se mantienen
unidas gracias a los EPS. La transferencia horizontal de genes se ve facilitada por este
estrecho contacto entre los agregados de células y la acumulación de ADN en la matriz de
EPS, lo que puede contribuir a cambios fenotípicos en los microorganismos del biofilm.
El fenómeno de quorum sensing también puede ocasionar la expresion de nuevos fenotipos.
Las señales químicas activan la transcripción de una serie de genes para que se inicie una
respuesta coordinada de la población. Estas señales de quorum están implicadas en la
adhesión y el mantenimiento del biofilm.

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Además los EPS secuestran nutrientes de la fase acuosa lo cual es muy interesante en ambientes
oligotróficos, y retienen agua lo que previene de la desecación.
La matriz de EPS constituye una barrera, tanto física como química, protegiendo a las bacterias
de condiciones adversas como los biocidas, antibióticos, radiaciones, sistema inmunitario en caso
de infecciones, ....
Además en los biofilms se establecen gradientes de oxígeno y otros aceptores de electrones, así
como gradientres de diferentes sustratos, de productos y gradientes de pH. Esto permite la
creación de microambientes donde pueden coexistir una gran variedad de especies distintas.

RESISTENCIA A AGENTES ANTIMICROBIANOS (Antibióticos, Biocidas, Desifectantes)

La resistencia a sustancias antimicrobianas es una característica que comparten todos los
biofilms. Cuando las bacterias se agrupan en estas comunidades multicelulares son capaces de
soportar condiciones antimicrobianas que erradicarían a las células en estado planctónico.

Células Planctónicas BIOFILM

Mutación genética Cambio en la expresión genética
Adquisición de genes de Estado fisiológico REVERSIBLE
resistencia a antibióticos (Quorum Sensing)

Son muchos los factores que controlan el grado de resistencia de un biofilm a un antimicrobiano
entre los que se pueden destacar la concentración de antimicrobiano, el grosor del biofilm, la
edad del biofilm, la densidad celular, la composición de especies y el genotipo. Los biofilms más
gruesos, más maduros y más densos son, por lo general, menos susceptibles al ataque por
antimicrobianos que los biofilms delgados, jóvenes y dispersos. En general los biofilms
compuestos por varias especies son más resistentes que los formados por una única especie
porque en los biofilms mixtos una especie puede proteger a otra mediante diversos mecanismos y
viceversa. Aunque existen pocos datos experimentales es probable que la presencia de partículas
abióticas en el biofilm aumente la resistencia a estos agentes antimicrobianos. Los productos de
corrosión, precipitados, fibras, células muertas, etc, que forman parte de los biofilms podrían
aumentar la protección reduciendo la difusión de los antimicrobianos y/o incrementando la
capacidad de sorción, es decir, pueden obstruir físicamente la difusión o pueden unirse al
antimicrobiano impidiendo su llegada a las células del biofilm.
Otro aspecto muy importante es la dosis de antimicrobiano y el tiempo de aplicación que se
emplean para tratar a los biofilms. La regla concentración-tiempo supone que la eficacia del
tratamiento con el antimicrobiano es proporcional a la concentración del mismo y a la duración
del tratamiento. Sin embargo, en la práctica esto no ocurre y se ha comprobado que en el
tratamiento de biopelículas funciona mejor una dosis elevada que una dosis más baja aplicada
durante un periodo prolongado.

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CONSECUENCIAS DEL DESARROLLO DE BIOFILMS

Una vez que las biopelículas se han desarrollado sobre la superficie del material, las
consecuencias pueden ser favorables o desfavorables.
Entre los aspectos negativos del desarrollo de biopelículas sobre los materiales se encuentran el
Bioensuciamiento, el Biodeterioro y la Corrosión Microbiana.
El bioensuciamiento consiste en la acumulación de microorganismos y/o macroorganismos y sus
productos metabólicos sobre los materiales lo que, por ejemplo, si hablamos de intercambiadores
de calor o sistemas de enfriamiento puede originar pérdidas en la transferencia de calor
El concepto de biodeterioro de materiales, se refiere a cualquier cambio indeseable en las
propiedades de un material causado por la actividad vital de los seres vivos.
Al hablar de biodeterioro de un material metálico nos estamos refiriendo a la corrosión
microbiana, que implica la participación de los microorganismos en el proceso corrosivo, y que
ha adquirido gran importancia en los últimos años especialmente en la industria, causando la
pérdida de millones de euros anuales como consecuencia del daño a materiales y equipos. La
corrosión microbiana representa aprox. entre el 5-10% de todos los casos de corrosión y causas
pérdidas económicas en torno al 0,4-0,5% del PIB de un país desarrollado.
Entre los aspectos positivos del desarrollo de biopelículas destaca la Biodegradación y la
Biorremediación.
La Biodegradación se refiere a la transformación de materiales o substancias nocivas o
perjudiciales para el hombre y posterior aprovechamiento de los productos resultantes del
proceso.
La Biorremediación implica la reparación del daño ocasionado al ecosistema provocado como
consecuencia de la actividad humana
Otros aspectos positivos del desarrollo de biopelículas serían: el incremento de la producción
agrícola mediante interacción de las biopelículas con las raíces de plantas, la producción de
enzimas, aditivos, antibióticos, etc.

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