Práctica de espectrofotometría UV-Visible

(Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y análisis de mezclas)

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FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la
radiación electromagnética con la materia. A través de esta interacción las moléculas
pueden pasar de un estado energético, m, a otro estado energético distinto, l, absorbiendo
una cantidad de energía radiante igual a la diferencia energética existente entre los dos
niveles: E l − Em . Para conseguir esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal
que:
hc
El ∆E = hν = κ
∆E h = Constante de Planck= 6.63.10-34 J.s
Em c
ν = Frecuencia de la radiación= κ
c = velocidad de la luz=3.1010 cm.s -1
λ = longitud de onda

Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva,
no son mas que el registro de las distintas µ(o κ ) a las que se producen estos tránsitos
energéticos.

Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones en si, de los

movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas...etc, las
moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio
de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes
regiones. Un esquema podría ser el siguiente:

2 5
λ / nm 1 10 10 10 10 10 10
3 4
10
6 9

Rayos γ Rayos x UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADIO

Transitos electrones electrones Vibraciones Rotaciones RMN
internos
nucleares externos
400 500 600 700

violeta añil azul verde amarillo naranja rojo

La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la transición de los

electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a niveles
mas altos de energía.
Espectrofotometría página 2

LEY DE LAMBERT-BEER

Si se hace incidir radiación monocromática sobre una muestra con una

concentración “C” de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda “λ”, la intensidad
de la radiación que la atraviesa, I, está relacionada con la intensidad incidente I 0 y con
el espesor de la muestra,l , por la expresión :

I = I 0 ∃10 − ε l c

aplicando logaritmos: logI = log I 0 − ε l c

reordenando términos: logI 0 − log I = ε l c

I
log I0 = ε l c
pudiéndose escribir :
I
I
Habitualmente, el cociente 0 se denomina “transmitancia” de la muestra y se suele
I
expresar como porcentaje de luz transmitida: I 0
∃ 100 . Por otra parte, se define la
“absorbancia” de la muestra como: A = log(1/T). Tanto la absorbancia como la
transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en el espectrofotómetro.

Segun estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresión que se conoce con
el nombre de la ley de Lambert-Beer:

A=εlc

donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor

constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ y en unas condiciones
experimentales determinadas; también se denomina “coeficiente de extinción molar” si,
como es frecuente, la concentración se expresa en moles por litro.

Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un
determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la
concentración molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del análisis
espectrofotométrico cuantitativo.

Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de

Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al
análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de
concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona
las absorbancias con las concentraciones.
Espectrofotometría página 3

La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis cuantitativo de mezclas

de dos o más sustancias, siempre que sus respectivos espectros de absorción sean lo
suficientemente distintos. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad
aditiva, de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los
componentes. Así, para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiación de
una misma longitud de onda, se cumplirá que:

A = A 1 + A 2 = ε 1 l c1 + ε 2 l c2

Supongamos, entonces, que nuestro problema es el análisis de una mezcla de dos

sustancias. En primer lugar se habrá de registrar el espectro de absorción de cada una de
ellas por separado, con lo que nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones
siguientes:

a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes de onda

de trabajo. El problema se reduce, entonces, a sendos análisis por separado, cada
uno en la zona del espectro en donde cada componente de la mezcla se presenta
como único absorbente.
b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de longitudes
de onda. En este caso se han de seleccionar dos longitudes de onda diferentes, λ1 y
λ2, y obtener, con disoluciones de las sustancias puras, las respectivas
κ1 κ2 κ1 κ2
absortividades molares a cada longitud de onda: ε 1 , ε 1 , ε 2 , ε 2 . Con estos datos
se pueden determinar las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a
partir de las medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de
κ1 κ2
trabajo seleccionadas, A y A . El cálculo se realiza resolviendo el siguiente
sistema de 2 ecuaciones con 2 incógnitas:

κ 1 κ 1
A κ 1
= ε 1 l c 1 + ε 2 l c 2
κ 2 κ 2
A κ 2
= ε 1 l c 1 + ε 2 l c 2

CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE

Espectrofotometría página 4

Lámpara

a
Lente

l
Rendija de entrada
l
a Fototubo

Rendija de salida Objetivo

t

(m
n

ul
ti
)
Prisma
a

(mono )
P

Filtro
Cubeta

La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro, que en

esencia consta de un monocromador (prisma o red de difracción) que controla la longitud de
onda de la radiación que se hace incidir sobre la muestra. La radiación no absorbida se
detecta y mide convenientemente. La absorbancia de la muestra se compara con la de una
“referencia” que consta estrictamente de disolvente.

Las instrucciones generales de manejo de un espectrofotómetro serían:

1.- Encendido de lámparas :

1.1. Lámpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido
instantáneo.
1.2. Lámpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita un
calentamiento previo.
2.- Adaptación del espejo a la lámpara adecuada, atendiendo al rango de longitud de
onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no automáticos).
3.- Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente.
4.- Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando “Ajuste
del cero”, hasta que aparezca CERO en la pantalla.
5.- Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia, que
normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando “A-T”.
6.- Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.

Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.00 cm de espesor) deben estar

escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas.
No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carácter abrasivo de éste
sino con un papel suave.

APLICACIONES DE LA TÉCNICA
Una de las aplicaciones prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de
absorción UV-Visible es la del análisis cuantitativo, basada en la aplicación de la ecuación de
Lambert-Beer

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Espectrofotometría página 5

Se trata de analizar la composición de una disolución que contiene una mezcla del indicador
Azul de Bromotimol en su forma molecular HA (ácida) y disociada A- (básica), las cuales
presentan absorción en la región VISIBLE del espectro. Las propiedades
espectrofotométricas del Azul de Bromotimol en ambas formas son diferentes, lo que
permite su cuantificación en disoluciones en las que aparecen mezcladas. Para ello habrá
que registrar los espectros de absorción de las dos formas (ácida y básica) y obtener las
correspondientes rectas de calibrado a dos longitudes de onda seleccionadas.

MATERIALES Y REACTIVOS
‰ Espectrofotómetro UV-Visible y 6 cubetas de plástico.
‰ Matraces aforados de 10 mL
‰ Vasos de precipitados de 100 mL
‰ Pipetas graduadas de 10 mL y de 5 mL.
‰ 4 Frascos de almacenamiento.
‰ Disolución de Azul de Bromotimol en medio ácido (HA) de concentración 5.10-5 M
‰ Disolución de Azul de Bromotimol en medio básico (A-) de concentración 5.10-5 M
‰ Disolución diluyente ácida: HCl 10-2M.
‰ Disolución diluyente básica: NaOH 10-2 M.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Preparación de disoluciones de la forma ácida del Azul de Bromotimol:

Tomando como base una disolución de partida, facilitada por el profesor, de Azul de
Bromotimol 5.00.10-5 M en medio ácido (HCl), prepárense por dilución las siguientes
disoluciones:

{ Disolución A: En un matraz de 10 mL pipetear 8 mL de disolución de partida y

enrasar con diluyente ácido (HCl).
{ Disolución B: En un matraz de 10 mL pipetear 6 mL de disolución de partida y
enrasar con diluyente ácido.
{ Disolución C: En un matraz de 10 mL pipetear 4 mL de disolución de partida y
enrasar con diluyente ácido.
{ Disolución D: En un matraz de 10 mL pipetear 2 mL de disolución de partida y
enrasar con diluyente ácido.

Nota: El pKa del azul de bromotimol es 7.30, al encontrarse en medio ácido

no hay duda de que el indicador se encuentra totalmente bajo su forma
ácida:

HA λ A− + H + (pKa=7.30)

b) Preparación de disoluciones de la forma básica del Azul de Bromotimol:

Tomando ahora como base una disolución de partida, facilitada por el profesor, de
Azul de Bromotimol 5.00.10-5 M en medio básico (NaOH 10-2M), prepárense por
dilución las mismas disoluciones que en el apartado anterior pero ahora enrasando
con diluyente básico (NaOH).
Espectrofotometría página 6

Nota: Como el pKa del indicador es 7.30 no hay duda de que éste se encuentra
totalmente bajo su forma básica en NaOH 10-2 M .

c) Obtención de los espectros de la forma ácida y básica del indicador:

Para ello vamos a utilizar las disoluciones “A” respectivas preparadas anteriormente.
En cada caso, llenaremos una cubeta con la referencia adecuada y otra con la
muestra a medir. A continuación, iremos midiendo el valor de la absorbancia de la
muestra a distintas longitudes de onda entre 400 y 680 nm, haciendo las medidas a
intervalos de 10 nm. Es importante tener en cuenta que, cada vez que se modifique
el valor de la longitud de onda, hay que ajustar de nuevo el cero de absorbancia con
la referencia.

Finalmente, se representan los datos en papel milimetrado, de manera que

figure la absorbancia “A” en ordenadas frente a longitud de onda “λ” en abcisas:

A Forma
1.000 básica

Forma ácida

0.000
400 500 600 700
Longitud de onda / nm

d) Obtención de las rectas de calibrado para las formas ácida y básica del Azul
de Bromotimol:

A la vista de los espectros de absorción de la forma ácida y básica del

indicador, se apreciará un máximo para la forma básica en torno a 620 nm y un
máximo para la forma ácida alrededor de 440 nm. Elegidos estos valores de longitud
de onda como los mas idóneos, se mide la absorbancia de cada una de las
disoluciones preparadas en el apartado a) (disoluciones de la A a la D), ajustando
previamente el cero de absorbancia a cada longitud de onda con la referencia
adecuada. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos tablas
correspondientes, una para la forma ácida y otra para la forma básica, que serán del
tipo:

Disolución A B C D
C / mol L-1
Absorbancia a 440
Absorbancia a 620
Espectrofotometría página 7

A continuación se representan en papel milimetrado los datos de las dos tablas

anteriores (absorbancia frente a concentración) y se obtienen las 4 rectas de
calibrado que confirman el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer:

0.8
A
0.6

0.4

0.2

0.0
1 2 3 4
-5
c /10 M

Las rectas que se obtienen son del tipo y = ax, de forma que al compararlas con la ley de
Lambert-Beer se deduce que:

∆y y2 −y 1
pendiente = ∆x = x2 −x 1 = ε l

pendiente
de donde: ε = l

Como la longitud de la cubeta es de 1.00 cm se obtiene el valor de ε en M-1cm -1. Por tanto
habremos determinado las cuatro absortividades molares que estabamos buscando:

ε 440
HA , ε 620 440 620
HA , ε A − , ε A −

e) Análisis de una muestra desconocida de azul de bromotimol

A partir de una muestra facilitada por el profesor se trata de determinar las

concentraciones de HA y A- que hay en la muestra. Para ello se medirá la
absorbancia de la muestra a 440 y 620 nm y a partir de las ecuaciones
correspondientes se obtendrán las concentraciones de HA y A- .

f) Comprobación del pKa del azul de bromotimol

Con los datos obtenidos en el apartado anterior y recordando la ecuación de

Henderson-Hasselbalch se puede calcular el valor del pKa del indicador:

[A − ] [A− ]
pH = pKa + log [HA] υ pKa = pH − log [HA]
por tanto sabiendo las concentraciones de HA y A- y midiendo el pH de la muestra se
puede calcular el pKa.
Espectrofotometría página 8

Si la suposición de que la absorbancia era aditiva es correcta, el pKa así obtenido ha

de cerrar con el pKa determinado potenciométricamente para este indicador.
Sabiendo que el valor tabulado es de 7.30, podría discutir la validez de nuestras
suposiciones y calcular los errores relativos cometidos por el experimentador.

Bibliografía

CONNOR, K.A., "Curso de análisis farmacéutico", Ed. Reverté. 1980.

MIÑONES, J., "Manual de técnicas instrumentales", Círculo editor Universo. 1978.