Análisis básico del

semen

Rosa Pello Gutiérrez

Elisa Ramírez Mendoza

Hospital 12 de Octubre
 ¿Que es Liq. Seminal ?

„ Espermatozoides

„ Suspendidos en secreciones:
„ testículo
„ y el epidídimo.

„ Se junta con secreciones:

„ Próstata,
„ vesículas seminal
„ y las glándulas bulbouretrales

„ Dando lugar a un liquido viscoso

denominado eyaculado

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„ Los parámetros analizados en el semen reflejan :

„ la función exocrina de las glándulas sexuales masculinas

„ y nos orientan sobre patologías del sistema genital.

„Al sufrir una transformación desde el momento de la eyacualción,

para su estudio correcto:

„Debemos tratar la muestra con unas condiciones adecuadas

„y estandarizadas para evitar sesgos artificiales.

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„Granvariabilidad biológica:
„2 muestras de semen que difieran
entre 1 y 3 semanas.
„Si los resultados discrepan seria
necesario una 3º muestra.

„Por ser un fluido biológico (sangre, LCR), debe ser tratado con
precaución en el laboratorio, para evitar posibles
contaminaciones (VIH, Hepatitis..)

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 Obtención de la muestra
„ Por masturbación el mismo día del examen
„ Frasco de vidrio o de plástico atemperado 20- 40 ºC, de boca
amplia
„ Sólo una eyaculación
„ Se recomienda: abstinencia de 3-7 días.
„ Maximizar la calidad de la muestra.
„ Y reducir la variabilidad
„ Lo ideal: recoger la muestra en un cuarto cerca del laboratorio.
„ Evitar choque térmico (20 - 40 ºC).
„ Entregarlo lo antes posible (1h).

„ Hacer hincapié:
„ Evitar la perdida.
„ Lavarse bien las manos y genitales antes.
„ No utilizar preservativo ni el coitus interruptus.
„ Usar frascos estériles.
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 Formulario para el paciente

„ Nombre.

„ Periodo de abstinencia.

„ Fecha y hora de recolección.

„ Si toma medicación:
„ Deberá hacerse hincapié en que informen de si toman
fármacos, enfermedades concomitantes (fiebre), ejercicio
físico intenso y situaciones de estrés.

„ Si fuma, o si tiene hábitos tóxicos y tiempo de abstinencia.

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 La OMS divide el estudio del
semen
„ Examen básico
„ 1.Examen macroscópico: licuefacción, aspecto, volumen,
viscosidad, pH.
„ Concentración de esp. y otras células.
„ Motilidad
„ Vitalidad. Estudio microscópico
„ Morfología espermática.
„ Presencia de aglutinaciones.
„ Detección de anticuerpos antiespermatozoide unidos a la
superficie esp.

„ Opcional

„ Avanzados
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„ Opcional
„ Índice de teratosrpermia.
„ Test hipoosmótico.
„ Cultivos seminales.
„ Análisis bioquímico de Líquido Seminal.
„ Análisis automático de la movilidad espermática.
„ Test del Hámster.

„Avanzados
„Test de función espermática:
„Especies reactivas de oxígeno.

„Test de la zona pelúcida.

„Evaluación de la reacción acrosómica.

„Análisis automático de la morfología espermática.

„Técnicas de recuperación de espermatozoides móviles:

„Swim-up.

„Gradientes de densidad.
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 1.Examen macroscópico
„ Licuefacción:
„ Se licua a temperatura ambiente (15-60 min).
„ Al recibirla: incubar a 37ºC durante 20-25 min.(1h)
„ Y agitar (no vortex)
„ Determinamos si esta licuado.

„ Si sigue sin estar licuada: 37ºC

„ Observar: grumos, hebras, coágulos.

„ Liquido anormal.
„ Sin importancia clínica, interfiere en el análisis del semen.
„ Utilizar; digestión enzimático, tampón fosfato 1:1, medio de
cultivo.
„ Referir los resultados a volumen inicial.
„ Y si es para TRA, medio estéril, y no usar digestión enzimático.

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 1.Examen macroscópico
„ Aspecto:

„ Observaremos después de la licuefacción. 37ºC

„ Color normal: nacarado o gris opalescente.

„ Color rojizo o marrón (hematíes).

„ Color amarillento (ictericia, alta vitamina B2) o alta nivel de
flavoproteínas oxidadas de vesículas germinales (elevada
abstinencia).

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 1.Examen macroscópico
„ Volumen:

„ Para medirlo:
„ Tubo graduado de 15 ml, cónico, tipo Falcon, con tapa
hermética,
„ testado para tóxicos celulares.
„ Volumen referencia: > 2ml
„ V < 2ml: hipospermia u oligospermia.
„ Cuando existe orgasmo y no eyaculación tras la masturbación
nos encontramos ante una aspermia (ausencia de eyaculado)
„ Aspermia sospecharemos de una eyaculación retrógrada.

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„ Protocolo para el estudio de los espermatozoides
de los pacientes con eyaculacion retrógrada

„ La OMS no tiene recomendaciones.

„ Noche anterior a la recogida de la muestra: ingerir una cucharada

sopera de bicarbonato sódico
„ Con ello alcalinizamos la orina
„ y evitamos al máximo el daño de los espermatozoides
„ Pues muchas veces estos son utilizados para TRA.

„ El día de la recogida:
„ Orina, mide osmolaridad y pH.
„ Seguidamente se toma 4 gramos o 2 cucharadas soperas de
bicarbonato sódico, y agua ½ litro, 750 ml diabéticos.
„ Se espera, recoge orina: osmolaridad de 350-400 miliosmol/Kg y
pH 7.2-8.
„ Entonces se recoge orina postorgasmo en frasco con medio de
cultivo.
„ Hacemos alícuotas, centrifugo 600g, 8 minutos y procedimiento
habitual.

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 1.Examen macroscópico
„ Viscosidad

„ Diferenciarlo licuefacción
„ Cogeremos una pipeta Pasteur con semen y dejaremos
caer su contenido
„ Valor de referencia: gotas,
„ o se forme un filamento < 2cm.

„ Si fuera mayor, anotaremos viscosidad anormal.

„ Y lo trataremos: añadiendo medio tampón

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 1.Examen macroscópico
„ pH

„ Utilizando tiras reactivas de rango 6.4-8.0

„ 1 gota de semen en la tira y 30 seg.
„ Comparamos color con la escala de colores
„ Valor de referencia: pH > 7.2

„ pH: ác
„ infección

„ pH <7.2 + azoospermia,
„ sugiere obstrucción de conductos
eyaculadores o agenesia bilateral
de deferentes

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 2.Motilidad espermática
„ Tipos de motilidad:
„ Tipo a: movilidad rápida y progresiva, > 25 micrometros/seg a
37ºC, 5 veces la cabeza en 1 segundo.
„ Tipo b: movilidad progresiva lenta o perezosa

„ Tipo c: movilidad no progresiva, < 5 micrometros/seg, 1 vez la

cabeza por segundo
„ Tipo d: inmóvil

„ Valor de referencia (60 minutos):

„ > 50% de los espermatozoides con movimiento tipo a + b.
„ Ó >25 % con movilidad tipo a.
„ < 50% Astenozoospermia

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 2.Motilidad espermática
„ 10 microlitros
„ Porta atemperado 37ºC Tipo a: 3%
„ Se deja estabilizar unos 60 seg. Tipo b: 32%
Tipo c: 5%
„ Observamos a 100 aumentos Tipo d: 60%
„ muestra homogénea.
„ A continuación pasamos a 400 X con contraste de fase.
„ Contamos, 1º los móviles tipo a y b,
„ y a continuación los c y d.

„ Se contaran 200 esp. en un porta, con contador de laboratorio.

„ Repetimos con otro porta.
Tipo a: 20%
Tipo b: 40%
Tipo c: 5%
Tipo d: 35%
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 2.Motilidad espermática
„ Valoraremos si la diferencia entre los contajes esta dentro
del 95% de i.c. de error debido al azar.

Tipo a: 3 y 20%
Tipo b: 32 y 40%
Tipo c: 5 y 5%
Tipo d: 60 y 35%

M: 47.5%
D:25%
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 2.Motilidad espermática
„ En el momento de la valoración, pueden surgir inconvenientes:
„ Las colas sueltas no se cuentan.

„ Puede a ver aglutinaciones.

„ La muestra este muy concentrada.

„ En muestras muy viscosas pueden producirse falsas

astenozoospermias…

„ De todos modos, lo conveniente es q los miembros del equipo que

se van a dedicar al contaje, se entrenen a través de videos para
poder realizar un control de calidad.

„ Método alternativo:
„ ASAC, CASA: incluye el análisis de espermatozoides asistido por
computadora

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 3.Vitalidad espermática
„ Nos permite evaluar los espermatozoides vivos.
„ Según la OMS se estudiaría cuando la < 50% movilidad

„ Se hace de manera indirecta, estudiando el estado de la mmb.

„ Los vivos tiene la mmb plasmática intacta

„ y los muertos dañada.

„ Tinción supravitales, eosina –negrosina.

„ y los basados en la capacidad

osmorreguladora de la membrana:
„ Solución hipoosmótica, 37ºC, 5min.
„ Valor de referencia > 60% hinchados

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 4.Aglutinaciones y agregaciones
„ Aglutinación: visualización de espermatozoides móviles unidos por las
cabezas, colas, cabeza-cola.
„ Agregación: unión de esp. a espermatozoides inmóviles, generalmente
muertos, a otras cél, a restos, fibras mucosas.

„ Se valora a la vez que la movilidad

„ Se anota en el seminogramas con una escala semicuantitativa:
„ No aglutinación (-), pequeñas aglutinaciones pueden ser normales (< 10%)
„ Totalidad (+++)

„ La presencia de aglutinaciones:
„ sugiere presencia de anticuerpos,
„ causa inmunológica de infertilidad,
„ infección,
„ aparece con + frecuencia en eyaculados
hiperconcentrados.

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5.Morfología espermática

„ Técnica de tinción recomienda: Papanicolau, Shorr, Diff-Quick.

„ Cabeza: azul
„ Pieza intermedia: rojiza
„ Cola: azul o rojiza
„ Deben de evaluarse 200 espermatozoides.
„ 2 extensiones.
„ Observar con objetivo de inmersión.
„ Sólo se cuentan los espermatozoides completos.
„ y valorar la diferencia de los porcentajes y este debe de estar
dentro del 95% de i.c. de error debido a azar.

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 Criterios de la OMS 1999
Cabeza Forma Ovalada
Acrosoma Bien definido, ocupé
40-70% de la cabeza
Longitud 4-5micras
Anchura 2.5-3.5 micras
Pieza intermedia Longitud 1.5 * L cabeza
Anchura < 1 micra
Forma Delgada unida
axialmente a la cabeza
Flagelo Recto, uniforme, + delgada P intermedia.
Desenrollado. 45 micras
Restos citoplasmáticos < 1/2 cabeza
en la pieza intermedia
Valores limitantes Se consideran anormales
% de normalidad > 15% para FIV
Morfología anómala.

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 6.Concentración espermática
„ Valor de referencia: > 20 millones /ml.
„ Para medir la concentración espermática la OMS recomienda:

Contaje Dilución Semen, Diluyente

400x microL microL
<15 1:5 100 400
15-40 1:10 50 450
40-200 1:20 50 950
>200 1:50 50 2450

Diluyente es una solución fijadora: solución salina + formalina

„Si hay menos de 2 *campo, centrifugo 3000g, 15 minutos.
„y anotaremos < 2 millones*campo, y si son móviles, o no.

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 6.Concentración espermática
„ Hemocitómetro: cámara de NEUBAUER Improved.
„ Makler, Microcell.
„ M de contraste de fases (200 a 400x)
„ Solo espermatozoides completos.
„ Se debe de realizar por duplicado

< 10 esp * cuadro grande: contamos 25 cuadros

10-40 esp: contamos 10 cuadros
> 40 esp: 5 cuadros

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 „ Si contamos:
„230 espermatozoides
„Dilución 1:20
„Hemos contado 10 cuadros

„Para determinar la concentración en millones /ml.

Factores de conversión
Nº de cuadrados grandes contados
Dilución 25 10 5
1:5 20 8 4 „ 230/2= 115 millones/ml.
1:10 10 4 2
1:20 5 2 1
1:50 2 0.8 0.4

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 7.Cel redondas
„ Cél epiteliales, las de la espermatogénesis y leucocitos.

„ Valor normal < 5 millones/ml

„ La concentración de estas células se puede medir directamente a

partir de la siguiente fórmula

„C = (N x S)/100
„N = 10 células inmaduras 100 espermatozoides contados
„S = 20 millones de espermatozoides/ml
„C = (10 x 20) /100 =2 millones de células/ml

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„ ↑ leucos, son indicativos de infección (cultivo), y mala calidad
espermática.

„ No debería exceder 1 millón/ ml.

„ Las técnicas para la detección esta basada en la presencia:
„ de la peroxidasa intracelular
„ de antígenos específicos de leucocitos

„ ↑ células inmaduras, desordenes de la espermatogénesis:

„Hipoespermatogénesis, varicocele, alteración de las células

de Sertoli.
„Para diferenciarlas de los leucos tinción Bryan-Leishman,
diferente morfología, y ausencia de peroxidasa.
„Asocia ↓éxito FIV.

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 Resumiendo
Normalidad Anomalía
Volumen > 2ml Aspermia:ausencia de
eyaculado
Hipospermia <2ml
Viscosidad < 2cm
Licuefacción Completa
pH > 7.2
Concentración esp > 20 millones esp/ml
Nº esp eyaculados > 40millones esp
Movilidad > 50% tipo a+b Astenozoosspermia
Morfología < 15% anormales FIV Teratozoospermia
Vitalidad > 75% de formas no
teñidas
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Estudio de post-vasectomías
„ Solo determinaremos el volumen, pH <7, recuento.

„ Según la Sociedad Británica de Andrología:

„ Pasado 3-4 meses
„ Y 24 eyaculaciones

„ La OMS requiere un examen exhaustivo de todo el sedimento

„ obtenido por centrifugación durante 15 min a 800g, para
clasificar a un paciente de azoospérmico.

„ Debido a que la imprecisión de la cámara es alta.

„ No debe indicarse “ 0 espermatozoides”
„ Mejor “no se observan espermatozoides”
„ Dilución 1:1, Nebubauer Improved, afirmar 95% seguridad
„ Que tiene < 30.000 espermatozoides / mL

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 Técnicas de recuperación
„ 1.SWIM-UP
espermática
„ Técnica de selección que se basa en la capacidad de los espermatozoides
con movilidad progresiva para desplazarse en un medio de cultivo adecuado
„ Se recuperan menos pero más móviles

Echamos medio Echamos medio

de cultivo 1:1 de cultivo

lavamos
Centrifugación Lo dejamos a 37ºC
Elimino
10 min, 500g sobrenadante
Desde 30- 90 min
botón
REM

Recupero el
sobrenadante Se hace recuento
espermático
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 Técnicas de recuperación
espermática
„ 2. Gradientes de densidad

„ Selección de los mejores que pueden vencer los gradientes y llegar al

fondo del tubo.
„ Gradientes discontinuos, disminuyen a saltos.
„ 3 capas (45/ 70/ 90), 2 capas (45/ 90)
„ Volumen de la capa es variable: 0.3/ 0.5/ 1.0 mL.
„ Centrifugamos 5 min, 300-600g, recogemos el botón del fondo.

„ Lavamos, centrifuga 5min, 300-600g.

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 8.Anticuerpos antiespermatozoides
(AAE)

• Ensayo obligado en cualquier seminograma básico

• Presentes hasta en el 40% de los casos de infertilidad
inexplicada
• Origen femenino o masculino
• Barrera inmunológica : producción de Ac al entrar en
contacto con el sistema inmune
• Causas masculinas:
• trauma (vasectomía…)
• reacciones inflamatorias
• criptorquidia...

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• Efectos:
• Aglutinación
• Efecto citotóxico
• Dificultad de paso a través del moco cervical y la unión y
penetración de la zona pelúcida
• Tipos:
• Ig G: por trasudación desde la sangre
• Ig A: producidas por las células inmunológicas afincadas en el
tracto genital
• Pruebas para la detección de AAE adheridos a la
membrana espermática:

IBT
• •IBT -Identificar presencia de AAE
-Caracterizar los isotipos
MAR
• •MAR
-Cuantificar la respuesta inmune

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 ™ MAR: ™ IBT:
•Partículas
de látex •Matriz de poliacrilamida
•Empleo de semen •Lavado previo del semen
completo

- Normalmente no existen IgA, si no existe Ig G: como screening

es suficiente la prueba de la IgG como screening.

™ Cálculos y resultados:
• Contar al menos 200 espermatozoides móviles
• Resultado expresado en % de espermatozoides móviles que
llevan partículas unidas
• Cuando > 50% se considera que existe factor inmunológico

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 Parámetros bioquímicos:
interpretación práctica
Semen: suspensión de células reproductivas en un
líquido complejo llamado plasma seminal

Los componentes del plasma

seminal se mezclan durante la
eyaculación y son el resultado
de la secreción de diferentes
glándulas exocrinas.

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™ Próstata:
Próstata
• ubicación: debajo de la vejiga urinaria
• produce una secreción opaca blanquecina
• pH ácido (pH: 6.2-6.8)
• 30% del volumen total
• Secreciones:
• Ác. cítrico
• fosfatasa ácida
• Espermina
• Albúmina
• Zn…
• Función:
• Liquefacción
• Movilidad espermática

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™ Vesículas seminales:
• Situación: detrás de la próstata
• Secreción opalescente viscosa ligeramente
amarillenta
• 60% del volumen total
• pH alcalino
• Secreciones:
• Fructosa
• PG
• Lactoferrina
• Bicarbonato
• Fibrinógeno
• Función:
• Producción de ATP
• Motilidad y viabilidad

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™ Epidídimos:
dimos
• Lleva espermatozoides de los testículos a los vasos
deferentes
• Mide 3.8 cm de longitud
• Dividido en:
• Cabeza
• Cuerpo
• Cola
• Secreción:
• Alfa glucosidasa
• Carnitina
• Función: Maduración de los espermatozoides.
• Tránsito: 10 – 14 días
• Almacenamiento: 1 mes
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Cambios del espermatozoide en el epidídimo:

• Disminución de la gota citoplasmática

en la pieza intermedia
• Cambios eléctricos en la superficie de
membrana
• Aumento del contenido de AMPc
• Modificación de la forma del acrosoma
• Adquisición de proteínas de superficie
• Estabilización de la cromatina nuclear

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™ Glándula de Littré:
• Localización: mucosa uretral posterior
• Producción de un líquido mucoso
™ Glándulas de Cowper:
• Localización: debajo de la próstata
• Secreción alcalina
• Secreciones:
• Mucoproteinas
• Galactosa
• Ác. oxálico
• Funciones:
• Limpia la uretra
• Lubrica la mucosa uretral

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Distribución de los marcadores bioquímicos del plasma
seminal en eyaculación fraccionada

-Primera fracción: -Segunda fracción:

-Prostática - Vesículas seminales
-Epidídimos
-Espermatozoides

Hospital 12 de Octubre
• A pesar de la gran cantidad de sustancias presentes,
ninguna aporta mayor información que el análisis
directo del número y características funcionales del
espermatozoide
• Algunos parámetros bioquímicos representativos de la
función de las principales glándulas son suficientes
para diagnosticar los principales síndromes asociados
a la infertilidad masculina
• OMS: Zn, fructosa, α- glucosidasa
• Medición del pH y del volumen seminal

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 •Función de las vesículas seminales:
-Fructosa
-Fructosa corregida
•Función de la próstata:
-Ácido cítrico
-Zinc
-Fosfatasa ácida
•Función del epidídimo:
-Alfa glucosidasa

Sustancia Lugar de producción Valor de referencia

Zn Próstata > 2.4 µmol/eyaculado
Citrato Próstata > 52 µmol/eyaculado
Fosfatasa ácida Próstata > 200 U/eyaculado
Fructosa Vesículas seminales > 13 µmol/eyaculado
α-glucosidasa Epidídimo > 20 mU/eyaculado

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 Marcadores bioquímicos de la
maduración espermática

Maduración: cambios bioquímicos producidos en la

espermiogénesis y en la migración de los túbulos
seminíferos al epidídimo:
• remodelado de la membrana: motilidad
• desarrollo de la reacción acrosómica
• remodelado nuclear
• cambios funcionales fuera del testículo: capacitación

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™ Maduración testicular:
• ROS : producción de radicales libres de oxígeno
• Cociente de isoformas de CK :
CK-MM
CK-BB + CK-MM

• Contenido de DHA : disminuye según avanza la

maduración
™ Capacitación:
• salida de colesterol de la membrana
• entrada de Ca
• ⊕ adenil-ciclasa
• ↑ AMPc
• ⊕ proteinkinasa A
• fosforilación de Tyr en proteínas flagelares

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• Hiperactivación espermática :

⊕ Adenil ciclasa ↑ AMPc Fosforilación Tyr

Cambios en el patrón
de motilidad:
VSL ⇒ VCL y ↑ AHL

Test positivo si ≥ 30% espermatozoides:

- VCL > 150 µm/sg y/o
- ALH ≥ 6 µm
• Fosforilación de Tyr
• Contenido G 6P
• Contenido NADPH

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 Control de calidad en el estudio
espermático

• Control de calidad: conjunto de procesos dirigidos a

asegurar la fiabilidad técnica
• Tipos de pruebas:
• Diagnóstica: concentración, movilidad, morfología…
• Terapéutica: técnicas de recuperación para FIV…
• Control de calidad:
• Analítico: detectar y minimizar los errores de medida
• Biológico: asegurar la viabilidad de los espermatozoides

Hospital 12 de Octubre
™ CC analítico interno:
- Distribución aleatoria
Imprecisión
de los espermatozoides

- Error de contaje:
Uso de ↓ nº de espermatozoides
representativos
Inexactitud
Cansancio del técnico,
materiales en condiciones no idoneas...

- CC interno: minimizar al máximo la imprecisión

Hospital 12 de Octubre
™ 1-5% de las muestras trabajadas → CC interno:
- Nivel intra-individual: realizar todas las muestras por
duplicado. Si la diferencia es mayor que el error de contaje
establecido, rechazar la medición.
- Nivel del observador: instruir al nuevo personal realizando
mediciones en paralelo hasta que no existan desviaciones
sistemáticas
- Seguimiento continuo de los resultados mediante el
procesamiento de especímenes conocidos:
• material de control

• muestras de pacientes

• vídeos…

Diario: ensayo por duplicado

Semanal: análisis por diferentes técnicos
Cuatrimestral: CC externo y calibración de pipetas
Anual: calibración de cámaras de contaje…
Hospital 12 de Octubre
1er contaje: 15 1er contaje: 20
total: 45 total: 45
2º contaje: 30 2º contaje: 25

Hospital 12 de Octubre
™ CC externo:
• CC interno y externo complementarios
• Analizar las muestras de CC externo como si
fueran muestras de rutina
• Muestras que abarquen la totalidad del rango
clínico
- concentración: 3-30 mill/mL
- movilidad: 10-40%
- morfología: < 20% de formas normales
• Muestras procedentes de varones seronegativos
para VIH y hepatitis

• 1999: primer programa de calidad externo

Hospital 12 de Octubre
™ CC biológico:
• Asegura la viabilidad de los espermatozoides que se
usarán en FIV…
• CCB interno: aseguran el adecuado funcionamiento
e inocuidad de los aparatos y materiales:
• Tª: estufas, incubadores…
• [CO2]
• Humedad
• Toxicidad de medios de cultivo, pipetas…: test de
supervivencia espermática o test de los embriones de
ratón
• CCB externo: evalúan la capacidad del laboratorio
para detectar materiales y medios tóxicos para el
espermatozoide

Hospital 12 de Octubre
Muchas gracias por
escucharnos.

Hospital 12 de Octubre