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M Ccba LB 02
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Manual de
Técnicas para Análisis
Bacteriológico en
Veterinaria
Manual de Técnicas para Análisis Bacteriológico en Veterinaria
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Fecha de emisión: Fecha de modificación:
19 de abril de 2010 31 de agosto de 2016
ÍNDICE
Objetivo / Pág. 4
Alcance / Pág. 4
Políticas / Pág. 4
Contenido, Introducción / Pág. 5
Conceptos Generales / Pág. 5
Técnicas de Siembra o Inoculación para el cultivo de bacterias / Pág. 8
Esterilización a la flama / Pág. 9
Aislamiento puro de un cultivo bacteriano / Pág. 10
Morfología de las colonias bacterianas / Pág.12
Elaboración de frotis fijo / Pág. 13
Técnicas de tinción para el cultivo de bacterias / Pág. 16
Tinción de Gram/ Pág.16
Tinción de esporas/ Pág. 18
Tinción de cápsula / Pág. 20
Técnicas para el aislamiento de bacterias / Pág.21
Bacteriológico de vísceras o general/ Pág. 21
Bacteriológico de agua (Coliformes Totales y Fecales, Conteo de Mesófilos y
Determinación de Salmonella / Pág. 23
Estimación del NMP de organismos coliformes / Pág.25
Recuento de Bacterias Mesofílicas Aerobias (BMA) / Pág. 38
Determinación de Salmonella spp en muestras de Agua / Pág. 46
Bacteriológico alimento (Cuantificación Coliformes Totales, Cuantificación
Mesófilos, Cuantificación Staphylococcus y Determinación de Salmonella)/
Pág. 47
Cuantificación de Coliformes Totales por el método de vaciado en placa/
Pág. 47
Cuantificación de Mesófilos por el método de vaciado en placa (BMA) en
alimentos/ Pág. 52
Cuantificación de Staphylococcus aureus / Pág. 53
Determinación de Salmonella / Pág. 57
Bacteriológico de Leche (Diagnóstico Mastitis, Cuantificación
Staphylococcus, Cuantificación Mesófilos y Cuantificación Coliformes) /
Pág.64
Diagnóstico Mastitis / Pág. 64
Cuantificación Staphylococcus / Pág. 66
Cuantificación Mesófilos / Pág. 66
Cuantificación Coliformes / Pág. 66
Urocultivo / Pág. 66
Coprocultivo /Pág. 68
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I. OBJETIVO
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II. ALCANCE
III. POLÍTICAS
IV. CONTENIDO
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INTRODUCCIÓN
CONCEPTOS GENERALES
medio de cultivo. Bajo este contexto, la formación de colonias visibles con características
particulares permite diferenciar a los microorganismos, así como detectar contaminantes en
los cultivos puros. Las colonias provenientes de un mismo microorganismo deben ser
iguales en forma, tamaño y color; al microscopio deben presentar las mismas características
morfológicas y tintoriales. Para poder observar las características de las bacterias, es
necesario realizar técnicas de siembra o inoculación para el cultivo de bacterias de acuerdo
al tipo de muestra que se analizará, este proceso se realiza de la siguiente manera:
1. Esterilización a la flama
La muestra biológica que se desea analizar, es preparada para su inoculación con el
objetivo de recuperar las bacterias. Las técnicas de preparación de la muestra varían según
el tipo de muestra, en el caso de los tejidos, la esterilización a la flama es importante, para
una optima obtención de microorganismos. A partir de una muestra de tejido se realizan
los siguientes pasos:
a) Se calienta a la flama (se mantienen remojados en alcohol una espátula, una tijera
y pinzas) la espátula sin que quede al rojo vivo y se pasa sobre la superficie del tejido
afectado.
b) Con la ayuda de una tijera y pinzas esterilizadas a la flama se corta un cuadrante
del tejido de aproximadamente 1 cm 2, esta se coloca en una bolsa estéril, adicionando 5 mL
de Caldo BHI (Caldo Infusión Cerebro Corazón). Posteriormente la preparación es
macerada y del producto generado se realiza la siembra en estrías para el aislamiento puro
del cultivo. La preparación se mete a incubación junto con la caja de petri sembrada, esto
con el objetivo de realizar la resiembra correspondiente, si se necesita.
c) Si el tejido es muy pequeño, puede no ser cortado, este se pasa de forma directa a
la flama y posteriormente se realiza el mismo proceso descrito en el punto 2.
En muestras tomadas con hisopo, colocadas en recipientes o bolsas (fluidos,
agua, heces, leche, alimento o cualquier otro tipo de muestra) la esterilización a la flama
para análisis bacteriológico, se realiza en un área estéril generada por una campana de flujo
laminar o en un área próxima al mechero de bunsen tal como se muestra en la Fig. 2.
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b. Inocular en el primer cuadrante con la muestra realizando estrías muy juntas (Fig.
3).
c. Esterilizar el asa y continuar con estrías muy juntas en el segundo cuadrante
partiendo de las primeras estrías (no se vuelve a tomar de la muestra).
d. Continuar de la misma forma esterilizando el asa entre cada cuadrante hasta que la
placa entera se ha sembrado (Fig. 4).
e. Asegurarse de que haya contacto entre las estrías de cada cuadrante.
f. Incubar a 37°C. por 24 horas
Después de incubarlas, estas células individuales, se dividen repetidamente hasta
formar una masa visible sobre el Agar, las cuales se originaron a partir de una sola célula
dando lugar a una colonia bacteriana.
Fig. 5. Aspectos más comunes de las diversas colonias aisladas sobre medio sólido
1. Fijar con calor frotis bacterianos calentando suavemente con una llama una
película de bacterias secadas previamente al aire. Este método conserva
adecuadamente la morfología general, pero no las estructuras internas de la
célula.
2. La fijación química para proteger la subestructura fina y la morfología de
microorganismos delicados de mayor tamaño, en esta clase de fijación se
utilizan fijadores químicos que penetran a las células y reaccionan con
componentes celulares, normalmente proteínas y lípidos, para inactivarlos y
convertirlos en insolubles e inmóviles
En el laboratorio de Bacteriología del CCBA se emplea la fijación por calor. Este
método consiste en:
La realización de un frotis fijo, que consiste en depositar sobre una laminilla una capa
delgada de bacterias mismas que quedarán adheridas a la laminilla por medio de calor.
Utilizar el marcador, dibujar dos círculos debajo de la superficie de la laminilla, un
cuadrado o un círculo grande, el frotis deberá quedar adecuadamente identificado Fig. 6.
Fijar los frotis al calor pasándolos rápidamente por la flama del mechero (Fig.9).
Es importante que la laminilla no se caliente demasiado ya que se pueden modificar las
características morfológicas y tintoriales.
1. Tinción de Gram
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con tinción simple esto es,
utilizando sólo un colorante, o con tinción diferencial utilizando dos colorantes. Los
métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus
propiedades de tinción. La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian
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Alcohol – Cetona
Interpretación Agua Safranina Agua
2. Tinción de Esporas
Diversas bacterias Grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva, de
resistencia, denominada endospora (espora). Las endosporas se desarrollan dentro de
células bacterianas vegetativas de varios géneros: Bacillus y Clostridium (bacilos),
Sporosarcina (cocos), entre otros.
Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse tanto
intracelularmente, como liberadas de la bacteria (célula vegetativa). Por su localización
dentro de la célula pueden estar situadas centralmente, cerca de un extremo (subterminal) o
claramente terminales, presentan además variación en su tamaño. Estas estructuras son
extraordinariamente resistentes a situaciones ambientales estresantes, como calor, radiación
ultravioleta, desinfectantes químicos y desecación. Estas características son de utilidad
taxonómica para la identificación de algunas especies de los géneros, capaces de esporular.
Las endosporas se pueden examinar con los microscopios óptico y electrónico.
Como las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, a menudo se han
observado como áreas incoloras en bacterias tratadas con azul de metileno y otros
colorantes; se han utilizado tinciones especiales para esporas con el fin de poder verlas
mejor. En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen como
cuerpos refringentes sin teñir, para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer y Fulton, en la
que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del verde de malaquita (colorante
primario) y una vez que este ha penetrado, al lavar la preparación y agregar safranina
(colorante de contraste), las células vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece
teñida de color verde.
La técnica de la tinción de esporas se realiza de la siguiente manera:
a. Preparar un frotis a partir del cultivo que se desea analizar y fijarlo a la
flama.
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Interpretación
Espora: Se tiñe de color verde (Fig.13).
Célula vegetativa (resto de la célula): Se tiñe de color rosado.
Espora
Espora
libre
3. Tinción de Cápsula
La estructura más externa de algunas células bacterianas es la cápsula, que es una
substancia gelatinosa no bien definida, que forma una capa que envuelve a la célula, la cual
es sintetizada por la membrana citoplasmática y excretada al exterior a través de los poros
de la pared celular. La cápsula tiene compuestos como los polisacáridos, pero se encuentran
también otras muchas clases de substancias características de cada una de ellas de las
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Cápsula
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han sido bien tratadas. La flora bacteriana que pudiera considerarse autóctona del agua, no
está bien conocida, y esto es debido, en parte a que muchos de los miembros de él, crecen
difícilmente en los medios artificiales del laboratorio. Existe una flora bacteriana del agua
como son: Chlamydiobacteriales (bacterias del azufre, hierro y otras), Espirilos, Bacilos
pigmentados como Serratia marcescens y Chromobacter violaceum, cocos pigmentados
como Sarcina lútea, bacterias fijadoras de nitrógeno como Azotobacter. Los
microorganismos llamados alóctonos existentes en el agua pueden proceder de la propia
agua, del aire y de la tierra (aerógenos esporulados y no esporulados), de las heces los
cuales pueden ser: colibacilos, Streptococcus como saprófitos aerobios, Clostridium.
welchii como saprófito anaerobio y como patógenos los bacilos tíficos, paratíficos, colérico
y disentérico. Los microorganismos propios del agua tienen una temperatura de crecimiento
de 22 grados C, mientras que los procedentes del intestino del hombre y de los animales
crecen mejor a temperatura de 37-44 grados C. Esta flora microbiana puede ser aumentada
o disminuida por los siguientes factores: químicos, físicos y otros agentes vivos como
parásitos (protozoarios) bacteriófagos.
Las enfermedades bacterianas que más se transmiten por el agua son disentería,
cólera, fiebre tifoidea y gastroenteritis como estas afecciones son intestinales, sus agentes
causales se encuentran en el contenido intestinal: por lo tanto, la contaminación de las
aguas con materias fecales significa que aquellas pueden contener estos gérmenes
patógenos y ser en potencia peligrosas para el consumo humano. La fiebre tifoidea y las
distintas disenterías bacterianas abundan en las aguas negras. Los estragos causados por la
proliferación de estos gérmenes hicieron que se tomaran medidas como la cloración de los
abastos de agua. Teóricamente, lo mejor sería examinar las aguas en busca de gérmenes
patógenos, a fin de determinar su potabilidad desde el punto de vista bacteriológico. Sin
embargo esto tropieza con serias dificultades, a causa del corto tiempo que viven los
microorganismos patógenos en las aguas y al número relativamente pequeño de ellos, por
lo cual generalmente no se les detecta en las aguas destinadas a consumo público.
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La valoración del contenido microbiano de una muestra de agua por el método del
NMP supone la utilización de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua
y las cantidades de tubos sembrados en una ó más series. Realmente consiste en tratar
estadísticamente el número de tubos de cada serie sembrada que resulten positivos después
de su incubación.
En cuanto a la investigación de patógenos en agua, no existe un método único que
permita aislar e identificar todos estos microorganismos. En general, los métodos con los
que se obtienen mejores resultados comprenden una fase de concentración, seguida de
técnicas de enriquecimiento y aislamiento específicas para cada microorganismo.
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse lo más pronto posible
después de su recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el
análisis, se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en
ningún caso, este lapso debe exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros
tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis.
Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la
muestra a 4 °C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados
falsos o dudosos.
Fundamento: Determinar la presencia de bacterias coliformes en una muestra de
agua.
Procedimiento:
La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa.
Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica
necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales,
Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presunción, que habrá de
confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite
dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada
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prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para cualquier grupo de
bacterias, mientras que la prueba confirmativa es específica.
Interpretación:
Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando
la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para
Coliformes Totales y Fecales.
Interpretación:
Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del
NMP.
Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe
turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo
del NMP.
a. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli). (Fig. 18)
b. Incubar durante 24 horas a 44 °C (±0.5 °C), observar presencia de turbidez y gas.
(Fig. 19)
Interpretación:
Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del
NMP.
Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se
reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.
En general se tiene:
NMP/C = NMP leído en la tabla_________________
Volumen real de muestra inoculada en cada
tubo de la serie central (ml)
Ejemplos:
1) La lectura de los resultados obtenidos en el análisis del agua de un grifo es la
Siguiente:
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Para coliformes fecales con el mismo razonamiento se establece el código: 2,1,0 que
en las tablas del NMP correspondientes se observa un valor de 7, por lo tanto se
tiene:
7 / 0.01 = 7 x 100 = 700
El resultado se expresará: NMP DE COLIFORMES FECALES: 700/100 mL
Confiabilidad
El procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por su
facilidad y economía. El resultado de esta prueba se expresa por “el número más probable”
(NMP), pero debe entenderse que este método no es exacto ya que sólo nos da la probable
densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada. La
confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de confianza al
95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 mL, no obstante, es una indicación
importante para evaluar
Tabla 1. Índice del NMP la ycalidad
límite sanitaria
confiabledel
deagua
95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con
porciones de 1 cm3 y 5 con porciones de 0.1 cm3
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Tabla 2. Índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 cm3, 3 con porciones de 1 cm3
y 3 con porciones de 0.1 cm3
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Desde el punto de vista fisiológico podemos encontrar una amplia gama de especies
y de otros grupos cromógenos, proteolíticos, fermentativos, lipolíticos, psicotrópicos,
termodúricos, patógenos, saprofitos, etc.
Este grupo de microorganismos se utiliza como un indicador de la posible presencia
de gérmenes patógenos, así como de las condiciones higiénicas en que ha sido manejada el
agua y para conocer la calidad del agua.
Los recuentos de Mesófilos Aeróbicos en placa son útiles para determinar la
potabilidad de un agua, así como también la eficiencia de las operaciones para eliminar
microorganismos, como la sedimentación, filtración y cloración.
Las cuentas se deben hacer antes y después del tratamiento específico. Los
resultados indicarán la medida en que ha sido reducida la población microbiana.
Lo usual es que el agua de buena calidad, para consumo humano, tenga cuentas
bajas: < 100 UFC por mililitro.
La determinación del conteo de bacterias mesófilas aerobias en una muestra de agua
se realiza, normalmente, por siembra en una placa, de un volumen determinado de agua,
por incubación a una temperatura concreta y en un tiempo determinado, y por recuento
posterior de las colonias desarrolladas y con la aceptación implícita de que cada colonia es
originada por una bacteria de la muestra inicial, por lo tanto, el número de colonias
equivaldrá al número de bacterias en el volumen sembrado.
Fundamento: La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o
UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra.
Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección
después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un
microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo
o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC.
Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para
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determinar las colonias por caja; multiplique este número por el recíproco de la dilución
para determinar las UFC/g estimadas.
Procedimiento:
a. En caso de que la muestra sea líquida (agua, leche, refrescos, etc.), agitar la
muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de
30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Se tomarán 10 mL de la
misma, colocarla en un matraz o recipiente estéril, adicionar 90 mL del
diluyente y mezclar de tal forma que la solución sea homogénea.
NOTA 7: Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable,
fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y
homogeneizar agitando vigorosamente.
b. Si la muestra es sólida o semisólida, pesar asépticamente 10 g,
posteriormente colocarla en una bolsa estéril, adicionar 90 mL del diluyente
(Solución Reguladora de Fosfatos o Agua Peptonada) y homogeneizar de 1 a
2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea. Permitir
que las partículas grandes se sedimenten y transferir la cantidad deseada
tomando de las capas superiores de la suspensión
c. Independientemente del tipo de muestra (sólida, semisólida o líquida), de la
suspensión o solución generada, tomar 1 mL de esta dilución (101) y verterlo
en el segundo tubo, quedando una dilución de 102. Repetir este
procedimiento tantas veces como diluciones decimales se quiera sembrar,
utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución. Se recomienda que
para alimentos se realicen hasta 7 diluciones.
d. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles debidamente identificadas, 1
mL de cada dilución del alimento homogeneizado, utilizando para tal
propósito una pipeta estéril.
e. Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA (Agar Bilis Rojo Violeta) fundido o
de Agar Mac Conkey fundido, mantenidos a 45 ± 1.0°C en baño de agua.
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1. Seleccionar el número de colonias (3, 5 o 7) y sembrar cada una en tubos con 0.5
mL de caldo de infusión cerebro-corazón.
2. Incubar a 35 ºC durante 24 horas.
3. Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo.
4. Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0,3 mL de cada
cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El
resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa.
Ejemplo 1:
Si la placa de la dilución 1:1000 tiene 80 colonias y 4 de 5 colonias seleccionadas
dieron positivas en las pruebas, el cálculo es:
80 x 4/5 x 10,000 = 640,000
Ejemplo 2:
Si la placa de la dilución 1:100 tiene 14 colonias y 2 de 3 colonias seleccionadas
dieron positivas, el cálculo es:
14 x 2/3 x 100 = 933 = 930
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Según ejemplo 2:
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado = 930 x
10 5 UFC por g o mL valor estimado.
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias
probadas, informar como:
0 UFC/g en muestras directas
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100
En la práctica los resultados pueden variar, esto dependerá del técnico que trabaje el
método y el grado de confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ±
52%.
c) Determinación de Salmonella
De suma importancia resulta el aislamiento e identificación de Salmonella spp. en
alimentos, dado que es una de las bacterias patógenas mayormente implicadas en la
transmisión de enfermedades por consumo de alimentos y causante de miles de brotes a
nivel mundial de dos enfermedades bien conocidas: salmonelosis y fiebre tifoidea. El éxito
en la determinación de este patógeno comienza con el debido tratamiento de la muestra, el
cual es puntual para ciertos tipos de alimentos. Salmonella es miembro de la familia
Enterobacteriaceae y siempre se considera como patógeno cuando se aísla de productos
alimenticios o de humanos.
Las especies de Salmonella son Gramnegativas en forma de bastoncillo, anaerobias
facultativas, algunas son móviles por medio de flagelos, otras no poseen flagelos. Crecen
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Coliformes, especies del género Proteus y Pseudomona cuyo crecimiento superaría al de las
Salmonellas, en particular si estos organismos competidores están presentes en el alimento en
un número mayor que las Salmonellas.
Los medios sólidos a base de agar selectivos contienen por lo general sustancias
inhibidoras, así como un sistema indicador que colorea específicamente determinados tipos de
colonias y da un color peculiar al agar que las rodea permitiendo de este modo el
reconocimiento de las colonias sospechosas de Salmonella.
Fundamento: La preparación de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo
establecido en este manual, el cual toma como referencia la NOM-114-SSA1-1994,
“Método para la Determinación de Salmonella en alimentos”.
Procedimiento:
Alimentos congelados: colocar el producto en refrigeración durante una noche.
No descongelar por inmersión en agua.
Alimentos o productos líquidos: inocular directamente la alícuota medida en el
medio correspondiente, previa homogenización. Si se trata de leche se sumerge una torunda
en 1-2 litros de muestra, agitándola durante 2 horas con algún dispositivo mecánico; una
vez escurrida la torunda puede inocularse directamente a los caldos de enriquecimiento.
Alimentos sólidos: separar la muestra y pesar la cantidad necesaria.
Homogeneizar en Stomacher® con el medio (de enriquecimiento o preenriquecimiento)
durante 1 minuto.
Alimentos en polvo: pesar la alícuota asépticamente y adicionarla al medio de
enriquecimiento o preenriquecimiento. Agitar vigorosamente antes de incubar.
Preenriquecimiento:
a. Determinar el pH del medio de preenriquecimiento con el potenciómetro. Ajustar, si
es necesario, a pH 6.8 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles.
Mezclar y cerrar ligeramente el recipiente.
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Enriquecimiento:
a. Después de la incubación, transferir respectivamente 1 mL de la mezcla del
preenriquecimiento, a 10 mL de Caldo Tetrathionate con 0.2 mL de solución de Lugol-
Yodo, (esta solución se añade al momento de utilizar el medio) puede utilizarse
también en lugar de Caldo Tetrathionate, Caldo Selenite-Cisteína, homogeneizar e
incubar de 18 a 24 h a 37ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por
el mismo periodo.
b. Después de la incubación, agitar los tubos y pasar 0.1 mL con un hisopo a un tubo con
10 mL de caldo Rappaport. Incubar a 37° C. por 24 horas.
Aislamiento:
a. Después de la incubación, resembrar por el método de aislamiento en cultivo puro en
Agar verde Brillante con Sulfadiazina (BGS) o en Xilosa-Lactosa- Tergitol (XLT-4).
Incubar 24 horas a 37 °C.
b. Observar los cultivos para identificar las colonias sospechosas de Salmonella spp. En
BGS las colonias son rosadas, grandes, lisas y transparentes y en XLT-4 las colonias
son grandes con centro negro y borde amarillo. Tener cuidado al seleccionar las
colonias procediendo de la siguiente manera: tomar del centro de la colonia con un asa
de punta para confirmar. Si se trata solamente de determinar la presencia o ausencia de
Salmonellas, bastan solo dos colonias para llevar a cabo con ellas las pruebas de
identificación.
Pruebas Bioquímicas:
a. Seleccionar al menos dos colonias típicas de Salmonella que se encuentren bien
aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con
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agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la
superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 37ºC.
Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es
necesario retomar más colonias. Observar el crecimiento en los tubos y considerar
presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes
reacciones:
b. Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más
intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la
sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la
punción debido a la producción de ácido sulfihídrico
c. Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la
descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan
claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de
Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo
largo de la punción.
d. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones
en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en
estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de
Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que
muestren reacciones atípicas en ambos medios.
e. Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo
presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas
de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas
nuevamente.
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Identificación Serológica:
a. Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
b. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI o en
agar nutritivo (base).
c. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar
con el asa o empleando aplicadores de madera.
d. Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente
un min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. Considerar
cualquier grado de aglutinación como positiva. La prueba positiva resulta cuando se
presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero, y no aglutinación en la
gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa aglutinación en
ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas
bioquímicas complementarias.
e. Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse
el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D
y E, suelen ser los más frecuentes). Si la aglutinación con el antisuero O es negativa,
utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el
cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.
Sorbitol - - D
Manitol - - +
Gram Negativos (bacilos)
Identificación de KLIGER SIM
LIA CITRATO RM VP UREA
bacterias S F H2S G H2S I M
Escherichia coli A A + - + - - + - + - -
Enterob. aerógenes A A + - + - - - + - + -
Enterob. cloacae A A + - - + - - + - + -
Klebsiella spp. A A + - + + - + - - + +
Otros microorganismos que pueden crecer en medios como Agar Sangre y Agar
Sangre con Azida de Sodio son Corynebacterias, estas forman colonias muy pequeñas
similares a Streptococcus pero tardan 48 horas en crecer. Una Tinción de Gram nos mostrara
bacilos cortos con uno de sus extremos redondeados, dispuestos en letras chinas o en
empalizada, Grampositivos (Tabla 7).
En Agar Sangre y Mac Conkey pueden crecer colonias de Pseudomona y Bacillus sp.
Las colonias de Pseudomona son grises, alargadas, opacas y hemolíticas. Las colonias de
Bacillus sp. generalmente son grandes, hemolíticas, opacas, rugosas, en frotis con tinción de
Gram se observan bacilos grandes Gram (+) (Tabla 7).
Tabla 7. Identificación bioquímica de bacilos pequeños y grandes
Manitol - -
b) Cuantificación Staphylococcus
La elaboración de la prueba y la interpretación de los cálculos se realizan de la
misma manera que en la prueba descrita de cuantificación de Staphylococcus en el
bacteriológico de alimento.
c) Cuantificación de mesófilos
La elaboración de la prueba y la interpretación de los cálculos se realizan de la
misma manera que en la prueba descrita de cuantificación de mesófilos en el bacteriológico
de alimento.
d) Cuantificación de coliformes
La elaboración de la prueba y la interpretación de los cálculos se realizan de la
misma manera que en la prueba descrita de cuantificación de coliformes en el
bacteriológico de alimento.
3. Urocultivo
Fundamento: El objetivo del Urocultivo es el recuento del número de unidades
formadoras de colonias (UFC) que crecen por mililitro de orina sembrada (Urocultivo
cuantitativo) y la identificación del microorganismo responsable (Urocultivo cualitativo)
(Tabla 8).
Existen dos métodos para el estudio microbiológico de la orina; uno es por el
método del asa calibrada y el otro por el método de conteo en placa o recuento de colonias
por medio de una dilución previa de la orina antes de ser sembrada, la finalidad de ambas
técnicas es reportar el número de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro. El
método que se usa en el laboratorio de bacteriología es el de asa calibrada.
Es importante que el procedimiento utilizado para el cultivo de orina proporcione el
máximo de información en un mínimo de tiempo. La muestra debe ser sembrada máximo 2
horas después de su recolección, si no es así pueden refrigerarse, ya que el recuento bacteriano
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permanece estable a 4°C hasta por 24 horas. Las muestras que no son procesadas
inmediatamente o que no se refrigeran pronto deben ser consideradas como no satisfactorias
para el estudio. Para el procesamiento de la muestra utilizar asa calibrada de platino color
negra 0.01 mL (1 colonia = 100 UFC/mL) o asa calibrada de platino color rojo 0.001 mL (1
colonia = 1,000 UFC/mL).
Procedimiento:
a. Agitar la muestra para obtener homogeneidad, puede utilizarse sedimento de orina
centrifugada durante 10 minutos a 2000 rpm, algunos bacteriólogos prefieren utilizar
0.01 mL de orina no centrifugada como inóculo.
b. Centrifugar 10 mL de orina en un tubo estéril tapado.
c. Desechar la orina menos 0.5 mL de la que sobrenadante y resuspender el sedimento.
d. Realizar un montaje húmedo de este sedimento y debe examinarse en la busca de
cilindros, células blancas o rojas y bacterias. Es necesario utilizar una técnica aséptica
porque el sedimento debe emplearse subsecuentemente como inóculo para varios
medios de cultivo.
e. Inocular una placa de Agar Sangre y en un medio general o de baja selectividad (Agar
Mac Conkey y Agar Baird Parker).
f. Esterilizar el asa de platino y enfriarla. Para enfriar el asa se sumerge verticalmente y
se retira asegurándose llevar una gota de orina para luego desecharla, esto se realiza 3
veces y la cuarta se utiliza para sembrar en los medios de cultivo.
g. La inoculación se realiza tomando con el asa calibrada de platino color negra 0.01 mL
la muestra y sembrar primero en línea recta sobre el medio y después realizar estrías
separadas. Incubar las placas en posición invertida 24 horas a 37 °C, si no hay
crecimiento a las 24 horas dejar incubar 24 horas más.
h. Observar las colonias, describirlas y contarlas. Realizar frotis para tinción de Gram.
Interpretación
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Para el reporte cuantitativo considerar que con un asa de 0.01 mL, una colonia
equivale a 100, y con el asa de 0.001mL, una colonia equivale a 1000. La cifra resultante se
expresa en:”Unidades Formadoras de Colonias”, o bien UFC/ mL
Debido a que se usa un asa calibrada de 0.01 mL el número de colonias halladas en las
placas deberá multiplicarse por 100 y el informe del cálculo final será el número aproximado
de microorganismos por mL de muestra de orina.
Un recuento de menos de 10,000 UFC/mL hace sospechar una contaminación de la
muestra, especialmente si hay varios tipos distintos de colonias, pues las infecciones urinarias
son casi siempre debidas a un sólo microorganismo.
Un recuento de más de 100,000 UFC/mL es indicativo de infección (el número no se
correlaciona con la gravedad de la misma). Las cifras intermedias entre 1,000 y 10,000
UFC/mL son dudosas, y requieren la repetición del análisis.
Si no se observa crecimiento de colonias se reporta de la siguiente manera: “sin
desarrollo después de incubar 48 horas”.
4. Coprocultivo
Fundamento: La familia Enterobacteriaceae está formada por bacilos
Gramnegativos aerobios y anaerobios facultativos que fermentan la glucosa, son oxidasa
negativa y crecen en medios usuales. Habitan como comensales en el tubo digestivo del
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5. Bacteriológico Semen
Fundamento: El cultivo de semen consiste en analizar el semen en busca de
infecciones causadas por bacterias, hongos, etc. Los bacterias causantes pueden ser:
Escherichia coli, Klebsiella pneumonie, Proteus mirabilis, Pseudomona aeruginosa y
Staphylococcus aureus. La muestra debe ser enviada al laboratorio en un recipiente estéril.
Procedimiento:
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a. Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate,
Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
b. Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas. Si no hay crecimiento
incubar 24 horas más.
c. Realizar la identificación de las colonias observadas.
d. Reportar los resultados.
6. Antibiograma
Fundamento: El estudio de la sensibilidad a antimicrobianos de las diferentes
bacterias aisladas en muestras biológicas tiene 2 objetivos fundamentales: guiar al clínico
en la elección del mejor tratamiento individual, y monitorizar la evolución de la resistencia
bacteriana. Se basa en la formación en el gel de agar de un gradiente de concentración de
antibiótico. A partir de un disco impregnado con una determinada cantidad, se le conoce
como el método de Kirby-Bauer. Al crecer las bacterias inoculadas previamente sobre la
superficie de la placa se forman halos de inhibición alrededor de los discos, que define la
zona en la que la concentración de antibiótico es mayor que la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI). Por lo tanto, su diámetro está directamente relacionado con la CMI del
antibiótico, y permite determinar la sensibilidad o resistencia siempre que se respeten una
serie de parámetros: espesor del medio en la placa, su composición, inóculo bacteriano y
tiempo de incubación, principalmente. No puede utilizarse para bacterias de crecimiento
lento (>24 horas), porque desaparece el gradiente de concentraciones.
Procedimiento:
a. Transferir aproximadamente 5 colonias de microorganismos a prueba con el
asa de platino a 5 mL del medio de cultivo Caldo Infusión Cerebro Corazón
(BHI). Puede utilizarse también Solución Salina Fisiológica estéril.
b. Cuando se utiliza BHI incubar 2 a 5 horas a 37°C hasta lograr el desarrollo de
la misma turbidez al estándar 0.5 de densidad óptica de Sulfato de Bario
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Campylobacter en alimentos
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a. Se hace una suspensión de la materia fecal en PBS y con un hisopo se estría sobre la
placa de Agar Preston.
b. Se incuban las placas a 42°C durante 24-48 horas bajo condiciones microaeróbicas.
3. Condiciones microaeróbicas
Existen varios métodos para obtener una atmósfera adecuada para el desarrollo de
estos microorganismos.
Sobres generadores de gases especiales para Campylobacter: Son sobres que se
consiguen en el comercio (BBL, OXOID, Bio-Meriux) que aportan una atmósfera aproximada
de 5 a 10% de oxígeno y 5 a 12% de dióxido de carbono.
Jarra con vela: La combustión de la vela aporta una atmósfera aproximada de 17-19%
de oxígeno y de 2-4% de dióxido de carbono. Con este sistema el aislamiento de
Campylobacter se mejora si se incluyen el medio de cultivo el suplemento FBP que aumenta
alrededor de 10 veces la aerotolerancia del microorganismo. Se postula que el rendimiento de
este método es mayor a 42-43°C que a 37°C.
4. Identificación bioquímica
Al igual que para otros agentes bacterianos, la identificación bioquímica del genero
Campylobacter es muy importante, a continuación se mencionan las pruebas más comunes a
realizar (Tabla 9):
Prueba de la catalasa: Es una prueba de identificación presuntiva. Las
Campylobacterias termofílicas son catalasa positiva.
Reacción de la oxidasa: Se transfieren unas colonias a un papel de filtro con el
reactivo oxidasa, la aparición de un color azul intenso dentro de los 10
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Catalasa + + V + + d/- - - - +
Reducción de + + - + + + + + + +
NO3
H2S - +/- - - + - + - 0 +
Requerimiento - - - - - - + - + V
de H2
Hidrólisis de - + V - - - - - - -
-Hipurato
-Indoxilacetato - + + + - + - + - -
Crecimiento a: + - - - - - - - - +
25 grados C
30 grados C + - - - - - - - +
37 grados C + + + + + + + + +
42 grados C - + - + + V V + + V
Sensible a: R S S S R R R S R R
-ac. Nalidíxico
-cefalotina S R S R R V R S S S
oxidan al reactivo para formar un compuesto coloreado, indo fenol. Esta es una forma rápida
de esta prueba y no se desperdicia reactivo, ya que este se oxida muy rápidamente y es difícil
de conservar. Contribuye a la identificación de Neisseria y Aeromonas (+), Pseudomonadales
(generalmente +), y Enterobacteriaceae (-).
Reactivo: Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (denominado también N-
dimetil-p-fenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina).
Preparación del reactivo: En una caja de Petri chica se colocan algunos cristales del
reactivo y se le añade un poco de agua destilada, aquí mismo se deja caer un pedazo de papel
filtro. Esta preparación es para uso inmediato.
Procedimiento: Con un aplicador de madera se toma una colonia bacteriana y se
prueba en el papel filtro humedecido con el reactivo. Se puede observar al microscopio
estereoscópico.
Interpretación:
Prueba positiva.- La colonia toma un color púrpura.
Prueba negativa.- La colonia no cambia de color o toma un color diferente al
purpura.
2. Catalasa
Esta prueba comprueba la presencia de la enzima catalasa.
Reactivo: Se utiliza como reactivo el peróxido de hidrógeno al 3%.
Reacción: 2 H2O2 ------> 2 H2O + O2
Procedimiento: Sobre un porta-objetos se coloca una gota de H 202 y con una pipeta
Pasteur o aplicador de madera se pica una colonia del cultivo y se suspende en la gota de
H2O2.
Interpretación:
Prueba positiva.- Se observa la formación de burbujas.
Prueba negativa.- No se forman burbujas.
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3. Hidróxido de potasio al 3%
Esta prueba es para confirmar la tinción de Gram.
Procedimiento: Mezclar bien una colonia con una gota de KOH al 3% en un porta-
objetos.
Interpretación:
Gram positivas: No se observa viscosidad.
Gram negativas: Si la colonia se transforma viscosa o gelatinosa en 5 a 60
segundos. "Elástico”.
5. Prueba de Coagulasa
Esta prueba detecta la presencia de la enzima coagulasa, producida por una cepa de
Staphylococcus sobre el plasma sanguíneo. La coagulasa aumenta la velocidad de coagulación
del plasma; el resultado final es la formación de un coágulo de fibrina. La concentración de la
coagulasa influye sobre la velocidad de la coagulación del plasma, cuanto más alta la
concentración más rápidamente se formará el coágulo.
Reactivo: Plasma de conejo o plasma humano.
Procedimiento:
En placa.- Una colonia característica de Staphylococcus es emulsionada en una gota
de plasma de conejo o humano sobre un porta-objetos.
En tubo.- Consiste en colocar 0.1ml del plasma, 0.3ml de Solución Salina Fisiológica
y aproximadamente tres colonias caracteristicas de Staphylococcus, esta preparación se incuba
a 37°C por 24 horas.
Interpretación:
En placa.- La formación de pequeños coágulos o grumos en un tiempo de 2 minutos
indica la presencia de coagulasa y constituye un resultado positivo. Una excepción de falsa
negativa es cuando hay cepas resistentes, en estos casos hay que realizar la prueba de
coagulasa en tubo.
En tubo.- La prueba es positiva si existe formación de un coágulo en el fondo del tubo
y negativa si no se forma coágulo. En esta prueba puede hacerse una primera lectura a las 4
horas de incubación, ya que algunas cepas de Staphylococcus son altamente positivas.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS SECUNDARIAS
Permite identificar en forma presuntiva bacterias Gram negativas. Se basa en que estos
microorganismos, pueden ser diferenciados sobre la base de la fermentación ácida de azucares,
(glucosa, lactosa y sacarosa) producción de sulfuro de hidrógeno y la producción de gas.
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capaz de utilizar la lactosa, que se encuentra en cantidades 10 veces mayor que la glucosa,
entonces el ácido generado superaría la reacción alcalina producida por la pendiente, y todo el
tubo tendría condiciones ácidas (amarillo).
Principio de formación de H2S:
El medio además de los carbohidratos contiene una sal, citrato férrico de amonio y una
sustancia química el tiosulfato de sodio, que algunos microorganismos tienen la capacidad de
reducir a sulfuro de hidrógeno (gas incoloro) que al reaccionar con el citrato férrico se hace
visible su producción dando un precipitado negro insoluble. Al reducirse en condiciones de
acidez el azufre de los aminoácidos azufrados y del tiosulfato de sodio se genera H 2S, que en
presencia del hierro del sulfato ferroso forma un precipitado negro de sulfato ferroso.
Producción de gas:
Como producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono puede producirse
gas, la bacteria en este caso se denomina aerogénica. Se observan en el medio burbujas o
desplazamiento total del medio del fondo del tubo dejando un área clara, o una ligera muesca
en el medio en el costado del tubo. Las bacterias que no producen gas se denominan
anaerogénicas, los gases producidos son anhídrido carbónico e hidrógeno
Método de siembra:
Se toma la colonia a probar con un asa recta y se inocula el medio por picadura hasta el
fondo y estrías en la superficie.
Interpretación: Lectura después de 18-24 horas de incubación. Formas de
fermentación básica:
1. Amarillo todo el medio (A/A): Fermentación de la glucosa y de la lactosa o
sacarosa.
2. Rojo todo el medio (K/K): No fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa.
3. Roja la pendiente, amarillo el fondo (K/A): no fermentación de la lactosa o
sacarosa-fermentación de glucosa.
4. Precipitado negro en el medio: Producción de ácido sulfhídrico.
5. Desplazamiento del medio, burbujas, muesca en la pared del tubo: producción de
gas a partir de glucosa.
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2. Citrato de Simmons
Determina si un organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono
para el metabolismo provocando alcalinidad. Las bacterias al utilizar el citrato, liberan
residuos de sodio, que al unirse con radicales OH alcalinizan el medio. Bajo estas condiciones
el indicador de pH cambia de color verde a color azul. El medio que se utiliza es un Agar que
contiene 2% de citrato de sodio, al cual se le adiciona un indicador de pH, (azul de
bromotimol) es envasado en tubos y queda con superficie inclinada.
Método de siembra: El medio se siembra por estría. La incubación se realiza a
37°C/24-48 horas y en ocasiones es necesario prolongar este período hasta 7 días.
Interpretación:
Prueba positiva.- Cambio del medio a color azul.
Prueba negativa.- El medio permanece verde.
5. Leche tornasolada
Determina la capacidad de un organismo de precipitar la caseína y fermentar la lactosa
en la leche, así como de la digestión de la caseína y producción de reductasas que eliminan O 2,
el medio es líquido de color azul grisáceo.
Método de siembra:
Por agitación del asa. Se incuba 1 a 14 días/37°C examinar diariamente y anotar
cualquier cambio que se presente.
Interpretación:
Acidificación.- color rosado
Grumos ácidos.- coágulo firme color rosa no retraído y que se disuelve
al agregar un pH alcalíno.
Alcalinización.- color azul intenso o morado.
Reducción.- color blanco.
6. Rojo de Metilo:
El rojo de metilo es una prueba que determina la capacidad de las bacterias de producir
ácido a partir de la glucosa de tal forma que el valor del pH del medio desciende a menos 4.4,
esta distinción puede hacerse visible mediante la adición de un indicador como el rojo de
metilo. Si la acidez es mínima, ésta se neutraliza por la acción de la solución amortiguadora
del medio. Se utiliza un medio líquido a base de peptonas, dextrosa y fosfatos.
Método de siembra: Inoculación de la bacteria con asa recta en el caldo RM. Se
incuba a 37°C / 24hrs.
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7. Reducción de Nitratos
Determina la capacidad que tienen algunos microorganismos para reducir nitratos a
nitritos o un desdoblamiento mayor de este último. Se utiliza un caldo Peptonado con 0.1% de
nitrato de potasio, algunas bacterias poseen la enzima nitratasa que reduce los nitratos (N0 3) a
nitritos (N02) o a otros productos de reducción como hiponitritos, hidroxilaminas, amoníaco,
óxido nitroso o nitrógeno gaseoso.
Método de siembra: Se inocula el caldo mediante la agitación del asa. Se incuba
37°C /18 a 24 hrs., si no hay crecimiento aparente incubar hasta 5 días, obteniendo
asépticamente 1 ml cada 24 hrs. para efectuar la lectura.
Interpretación:
Añadir 5 gotas de Solución A (Ácido Sulfanílico 0.8%).
Añadir 5 gotas de Solución B (Dimetil alfa naftilamina 0.6%).
Mezclar y leer después de 1 a 2 minutos.
Positivo.- color rosado o rojo intenso (presencia de nitritos).
Negativo.- sin cambio de color (ausencia de nitritos).
Si la prueba es negativa es posible que la reacción de reducción haya
continuado hasta otros productos; en este caso es necesario adicionar una pizca de polvo de
zinc para confirmar la ausencia de nitratos.
8. Fermentación de Carbohidratos
Determina la utilización de los carbohidratos por las bacterias produciendo ácido o
ácido y gas (cuando se utiliza campana de Durham). Además pueden incluirse entre estos
algunos glucósidos y alcoholes polihídricos en las concentraciones adecuadas para realizar
pruebas de fermentación. La concentración de carbohidratos para pruebas de fermentación y
oxidación es por lo general el 1%, ya que a esta concentración es menos posible de que ocurra
una reversión de la reacción.
Algunas soluciones de carbohidratos pueden esterilizarse en la autoclave pero otras es
posible que sufran descomposición.
A estos medios se les adiciona un indicador generalmente rojo de metilo para dar
evidente un cambio de pH que ocurre durante el crecimiento de las bacterias. Algunas veces es
necesario adicionar suero para pruebas especiales con microorganismos exigentes.
Método de siembra:
Agitación del asa bacteriológica. Se incuba a 37°C / 18-24 hrs.
Interpretación:
Prueba positiva.- color amarillo.
Prueba negativa.- color rosado o no cambia de color.
Cuando se utiliza con campana de Durham una prueba positiva es cuando se forma una
burbuja dentro del tubo y en una prueba negativa no hay formación de burbujas.
9. Hidrólisis de la Esculina
Determina la capacidad de una bacteria de hidrolizar el carbohidrato esculina a
esculetina y glucosa. Se utiliza un medio a base de caldo peptonado, esculina y citrato férrico.
Si la bacteria utiliza la esculina se liberará 6,7 dihidroxicumarina que reacciona con el hierro
del medio dando una coloración café obscura o negra.
Método de siembra: Por agitación del asa bacteriológica se incuba en un período de 1
a 7 días a 37°C.
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Interpretación:
Prueba positiva.- coloración café obscura o negra.
Prueba negativa.- sin cambio de color.
10. CAMP-Esculina
La prueba de CAMP, utiliza los fenómenos líticos de los estreptococos del grupo Beta
de Lancefield en presencia de toxina estafilocócica beta, es suficientemente exacta para la
identificación presuntiva sistemática de Streptococcus agalactiae. Puede realizarse al mismo
tiempo la prueba de hidrólisis de la esculina en medio sólido.
Método de siembra: Se utiliza Agar Sangre con Esculina.
a) Se inocula una cepa de Staphylococcus beta hemolítico en el centro de una placa.
b) Las cepas de Streptococcus a probar se inoculan cerca de la estría del
Staphylococcus a los lados, identificando cada una si se utilizan varios inóculos de
Streptococcus. Utilizar un control positivo.
Interpretación:
Prueba de CAMP positiva.- si se forma una especie de flecha transparente en la
región donde se encuentran el inóculo de Streptococcus a probar con el Staphylococcus.
Prueba de CAMP negativa.- no se completa la hemólisis del Streptococcus en
prueba.
Prueba de Esculina Positiva.- un halo negro alrededor de las colonias.
Prueba de Esculina Negativa.- no se forma ningún halo.
Interpretación:
Prueba positiva.- color morado.
Prueba negativa.- color rosado.
QFB Ana Ma. Rejón Magaña Dr. José Alberto Rosado Aguilar Dr. José Alberto Rosado Aguilar
Técnico Académico Responsable del Laboratorio Responsable del Laboratorio