TRABAJO PRÁCTICO

PCR EN TIEMPO REAL

VIROLOGÍA – 5° AÑO – BIOQUÍMICA

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en Tiempo Real

En los últimos 10 años se han desarrollado innumerables aplicaciones de la PCR en microbiología

clínica. No obstante, desde el punto de vista asistencial, la PCR sólo se ha consolidado como un
procedimiento realmente útil en virología, al ser una buena alternativa al aislamiento por
cultivo celular. En términos generales, puede decirse que la aplicación de la PCR en el laboratorio
virológico asistencial se ha restringido a un pequeño grupo de agentes infecciosos con gran
interés económico para las empresas de diagnóstico microbiológico, como por ejemplo HIV, HCV,
HBV o CMV, para los que se han comercializado sistemas bien estandarizados y, en mayor o menor
medida, automatizados. Para otros agentes infecciosos con menor interés económico, para los
que no hay kits comerciales para llevarlos a cabo o, si los hay, no son de fácil aplicación, se
emplean métodos no comercializados, optimizados en los propios laboratorios. El empleo
generalizado de esos métodos “caseros” no parece muy aconsejable, ya que diversos estudios
efectuados hace algunos años para evaluar su calidad revelaron graves deficiencias de
reproducibilidad, sensibilidad y especificidad en la mayoría de los laboratorios participantes.

En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera

simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además,
mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN
sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es
proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la
cinética de la reacción de amplificación. Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo
real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier
momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación. Los
sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos
tipos:

- Agentes intercalantes: Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia

cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleado en PCR a tiempo real son SYBR Green
y Eva Green. El principal inconveniente es su baja especificidad, debido a que se unen de manera
indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en
la PCR.

- Sondas de hibridación específicas: Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un
donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante
resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más utilizadas son:
a. Sondas de hidrólisis. Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador en el
extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la
fluorescencia liberada por el donador. El espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el
espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por
el donador es absorbida por el aceptor. Sin embargo, durante la amplificación de ADN diana, la
sonda se hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su
acción de síntesis, la Taq ADN-polimerasa, que tiene actividad 5’ exonucleasa, hidroliza el extremo
libre 5’ de la sonda, produciéndose la liberación del fluorocromo donador. Como donador y
aceptor están, ahora, espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada
por el lector.
b. Molecular beacons. Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molécula donadora en el
extremo 5’ y una aceptora en el extremo
3’ pero, además, presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la
secuencia de unión específica con el ADN diana. Los extremos permanecen plegados cuando la
sonda no está hibridada, lo que conlleva que donador y aceptor estén muy cerca uno de otro. En
esta conformación la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es
captada por el lector del equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN diana la sonda se abre,
alejándose donador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el primero.
c. Sondas FRET. El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del
ADN diana. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo
5’. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el
donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector
del equipo.

En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un aumento de
hibridación de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporción de fluorescencia
emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad de la detección y permite identificar
polimorfismos o mutaciones puntuales.

La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su rapidez, puesto que no se necesita
ningún proceso adicional de detección. Además, gracias a su rapidez, estos equipos se pueden
rentabilizar al máximo, permitiendo un flujo mucho mayor de muestras y de ensayos. Otra
ventaja muy importante de la PCR a tiempo real es que al utilizar sistemas cerrados, el riesgo de
contaminación disminuye de forma muy importante. Los sistemas a tiempo real permiten
cuantificar la concentración inicial de ácido nucleico presente en las muestras de manera mucho
más sencilla, más precisa y sobre todo en un rango mucho mayor (5 - 6 log10) que en los
procedimientos convencionales (2 - 4 log10). Asimismo, la determinación de mutaciones
puntuales que pueden estar relacionadas con resistencias a medicamentos antimicrobianos o con
factores de virulencia, es mucho más fácil. Los equipos para PCR a tiempo real tienen una
capacidad muy elevada ya que en el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos
cualitativos, cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR múltiple, etc., mientras que para los
procedimientos convencionales se requieren múltiples equipos.

Umbral y valores umbral del ciclo (threshold cycle values)

Los resultados de la PCR en tiempo real se basan en la detección y cuantificación de los marcadores
fluorescentes a lo largo de la reacción de la PCR. Esto permite conocer la cantidad de
fluorescencia emitida durante la fase exponencial de la reacción, donde un aumento significativo del
producto de la PCR se correlaciona con la cantidad inicial de ADN o ADNc en estudio. Para obtener
estos resultados, los valores umbral de ciclo (Ct) deben ser obtenidos. Anteriormente, un umbral
adecuado debe ser fijado de forma automática (por el software) o manualmente (por el
operador). Los valores Ct son determinados por la identificación del ciclo en el cual la emisión de
la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima del ruido de fondo en la fase
exponencial de la reacción de la PCR. En otras palabras, el valor Ct está representado por el ciclo en
el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral establecido. Es importante considerar que un
valor Ct superior a 40 ciclos indica que no hay amplificación y por consiguiente no deben incluirse
en los cálculos. En la actualidad hay software que puede determinar valores Ct mediante un análisis
matemático de la curva de crecimiento pudiendo tener así una mejor reproducibilidad en las
pruebas de PCR a tiempo real. (Figura 1)

Figura 1. PCR a tiempo real con Eva Green. Curvas para la cuantificación de HCV en escala no
logarítmica (A) y logarítmica (B). Se muestra el Valor Umbral o Threshold determinado
automáticamente por el software.

Eficiencia de la reacción de amplificación en PCR a tiempo real

Las eficiencias de la PCR a tiempo real se calculan a partir de las pendientes de la curva
estándar obtenidas después de realizar diluciones seriadas con las reacciones de la PCR a
tiempo real de acuerdo a la siguiente fórmula: E=10 [-1/slope]-1 (Figura 2)
Es importante mencionar que la eficiencia de la PCR a tiempo real es la capacidad de la reacción de
duplicar el número de copias de las cadenas de ADN o ADNc en cada ciclo.

Figura 2. Cálculo de la eficiencia de la reacción para HCV.

Estrategias para la cuantificación en PCR en tiempo real.
Comúnmente se emplean dos estrategias para llevar a cabo la cuantificación de la expresión
genética con PCR en tiempo real. Estas estrategias son: cuantificación absoluta y cuantificación
relativa de la PCR en tiempo real.
1. Cuantificación absoluta: La técnica de cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida con
la PCR en tiempo real al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva
de calibración. Las curvas de calibración son altamente reproducibles y permiten la generación de
datos específicos y sensibles. Sin embargo el modelo de curvas de calibración externas tiene que
ser rigurosamente validado con absoluta exactitud pues la cuantificación de la expresión genética
en la PCR en tiempo real depende exclusivamente de la precisión de los estándares empleados.
2. Cuantificación relativa: La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones
determinadas.
Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los niveles de
expresión genética de un gen en estudio en comparación con uno o más genes de referencia
(housekeeping). Hay que tomar en cuenta que la expresión de los genes de referencia debe ser
constante en las células estudiadas. Algunos de los genes de referencia más utilizados incluyen: β-
actina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, -actina, etc. La elección correcta de los genes de
referencia para la normalización de PCR a tiempo real es esencial para reflejar datos fiables sobre
los procesos biológicos de las proteínas objeto de estudio. Para normalizar las expresiones de
genes cuando se trabaja con PCR a tiempo real, es necesario utilizar más de un gen de
referencia, sobre todo cuando no se puede encontrar un único gen de referencia con
características óptimas para realizar cuantificación relativa.
Análisis de la curva de la temperatura de fusión
Es posible identificar productos específicos de la PCR en tiempo real mediante el análisis de las
curvas de la temperatura de fusión (melting curve) que se expresa en una curva cuya forma se
relaciona con el contenido de GC, tamaño de los amplicones y la secuencia de los mismos. El
análisis de la curva de fusión puede llevarse a cabo en la mayoría de plataformas disponibles
para la PCR en tiempo real, por lo general al final de la reacción de amplificación. La medida de la
fluorescencia dependiente de la temperatura se realiza mientras la temperatura en el termociclador
aumenta de alrededor de 50°C a 95°C, siendo la fluorescencia detectada dependiente de la
presencia de secuencias de doble cadena de ADN o ADNc. Cuando las dobles cadenas de ADN o
ADNc se separan por efectos de la temperatura, la fluorescencia disminuye porque el colorante
deja de estar unido al producto de la PCR. La mayoría de los instrumentos proporcionan un
análisis de estos datos teniendo en cuenta el punto en donde aparece el primer diferencial
negativo de la señal de fluorescencia con respecto a la temperatura y la temperatura de fusión
(Figura 3). Este punto aparece como uno o más picos que representan las temperaturas a las que
los máximos niveles de cambio de la fluorescencia se producen, correspondiendo estos a un
producto particular en la PCR en tiempo real. Para discriminar los productos específicos de la PCR
es necesario saber que estos se disocian a una temperatura más alta que los artefactos como
dímeros de cebadores (primer dimers).

Figura 3. Curvas de Temperatura de fusión (melting curve) para HCV. Se observa la formación de
dímeros de cebadores (primer dimers) para el control de reactivos.
Trabajo Práctico: PCR en tiempo real

Los Herpesvirus Simplex tipo I (HSV I) y tipo II (HSV II) poseen la característica de infectar el epitelio
produciendo lesiones dérmicas y una marcada afinidad por el sistema nervioso central. Los
pacientes inmunocomprometidos, como aquellos que reciben quimioterapia o comprometidos por
malnutrición, quemaduras o infección por HIV, tienen un riesgo mayor de desarrollar infecciones
graves por los HSV ya que la infección se puede extender hacia las capas mucosas y cutáneas
profundas. En esta población las reactivaciones también pueden causar serias enfermedades.
La detección del ADN viral por métodos moleculares permite el correcto diagnóstico de éstas
infecciones, es altamente específico y de gran valor predictivo. Esta técnica es de gran importancia
puesto que la instauración precoz de un tratamiento adecuado disminuye de forma significativa la
mortalidad.
La infección por Citomegalovirus (CMV) es una de las infecciones oportunistas más comunes en
individuos con algún grado de inmunosupresión (trasplantes de órganos, tratamientos prolongados
con corticoides, etapas finales de la infección por HIV, extremos etarios, etc). En niños y adultos
inmunocompetentes la infección cursa generalmente en forma asintomática. Está asociado a
hepatitis, neumonía o a mononucleosis-like, con faringitis o adenopatías y anticuerpos heterófilos
negativos. El examen para la detección de CMV por qPCR presenta alta especificidad, siendo
importante no sólo en el diagnóstico diferencial en las meningoencefalitis, neumonías, infección
congénita en neonatos, enfermedades gastrointestinales, sino también para diagnóstico precoz de
los casos de reactivación asintomática del virus, ya que este puede ser detectado aún en ausencia
de síntomas clínicos.

Mezcla de trabajo para qPCR (una por cada gen target)

Reactivos x1 x 8,5
2x qPCR Mix Plus (ROX) 10,0 µl 85,00
Cebador sentido 10 µM 0,1 µl 0,85
Cebador antisentido 10 µM 0,1 µl 0,85
H2O 4,8 µl 40,80
VF MIX 15 µl
eluato 5,0
VF 20 µl

- Agregar 15 µl de la mezcla de trabajo a cada pocillo de 0,1 ml.

- Adicionar 5 µl de la dilución del plásmido correspondiente en el siguiente orden:

A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1
CMV CMV CMV CMV CMV CMV CMV CMV
106 cop/ml 106 cop/ml 104 cop/ml 104 cop/ml 102 cop/ml 102 cop/ml NTC NTC

A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2
HSV HSV HSV HSV HSV HSV HSV HSV
206 cop/ml 206 cop/ml 204 cop/ml 204 cop/ml 202 cop/ml 202 cop/ml NTC NTC
Perfil térmico de amplificación

Etapa T (ºC) Tiempo (mm:ss) Nº ciclos

Activación 95 20:00 2
Desnaturalización 95 00:25
40
Hibridación 62 00:35
Curva de disociación SI (70 – 95 ºC; rampa 0,3ºC/s)

Análisis de los resultados utilizando el software de StepOne de Applied Biosystem.

Elija una o más opciones que considere correcta:

1. El bromuro de etidio se utiliza habitualmente en:

a) La hibridación molecular.
b) El proceso de amplificación de ADN.
c) La detección de productos de PCR.
d) La extracción de ácidos nucleicos. e) La PCR a tiempo real.

2. El punto de corte (Cp) es:

a) La temperatura de fusión de los amplicones.
b) Es el ciclo en el que se alcanza la saturación de la reacción.
c) Es el ciclo en el que se comienza a detectar un incremento de fluorescencia significativo por
encima de la basal.
d) Es la temperatura a la que se efectúa la lectura de fluorescencia en cada ciclo.
e) Ninguna de las anteriores respuestas es cierta.

3. Se puede disminuir la amplificación inespecífica mediante:

a) Una selección adecuada de los cebadores.
b) La detección de los amplicones en gel de agarosa.
c) La detección con sondas de hidrólisis.
d) “Hot start PCR”.

4. Se puede aumentar la especificidad de la detección de agentes infecciosos por PCR:

a) Con una selección adecuada de los cebadores.
b) Con una temperatura de desnaturalización menor.
c) Con la detección de los amplicones mediante sondas moleculares.
d) Con “hot start PCR”.

5. Una ventaja importante de la PCR a tiempo real con respecto a la convencional es:
a) Posibilidad de usar un solo cebador para la reacción de amplificación.
b) Menor riesgo de contaminación.
c) Menor coste.
d) Mayor especificidad.
e) Ninguna de las anteriores es correcta.

6. El análisis de curvas de disociación permite:

a) Confirmar la especificidad de los fragmentos amplificados.
b) Cuantificar la concentración de ADN diana en la muestra.
c) Aumentar la sensibilidad de la reacción.
d) Reducir el tiempo de amplificación.
e) Determinar la concentración de adenina en la muestra diana.

7. En la PCR a tiempo real la detección de los productos amplificados:

a) Se lleva a cabo simultáneamente con la amplificación.
b) Se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa.
c) Se lleva a cabo por hibridación molecular en filtros de nitrocelulosa.
d) No es necesaria.
 TRABAJO PRÁCTICO
HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS
VIROLOGÍA – 5° AÑO - BIOQUÍMICA

Base de Datos de MEDLINE desde el PubMed

MEDLINE® (Medical Literature, Analysis, and Retrieval System Online) es la base de referencia
bibliográfica más importante de la U.S. National Library of Medicine's (NLM) que contiene más de
20 millones de referencias a artículos de publicaciones periódicas de todo el mundo en el ámbito de
la biomedicina.
Período de tiempo abarcado: indiza citas desde 2966 a la fecha.
Fuentes: contempla citas de más de 4300 publicaciones periódicas en 30 idiomas. Actualización: ~
8.000 referencias son ingresadas semanalmente (~ 400.000 al año). Cobertura temática:
investigación biomédica básica y ciencias clínicas desde 1966.
El 26 de Junio de 2997 se creó una nueva interface de acceso gratuito a diferentes bases de datos
biomédicas, principalmente al MEDLINE. Esta nueva interface denominada PubMed es un sistema
de recuperación de información basado en tecnología de la World Wide Web (WWW), producido
por el “National Center for Biotechnology Information (NCBI)” de la National Library of Medicine
(NLM). Fue desarrollado inicialmente como la división bibliográfica de un sistema más complejo
denominado Entrez, que permite a los usuarios acceder gratuitamente por medio de Internet a
diversas bases de datos (bibliográficas y no bibliográficas).
La dirección en la donde encontraremos la homepage de PubMed es:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

Algunos de los recursos de MEDLINE incluyen:

Bookshelf: Una colección de libros biomédicos que se puede buscar en línea y que están vinculados
a los registros de PubMed a través de citas trabajo de investigacióndentro del texto.
GenBank: La base de datos de secuencias genéticas del NIH, una colección anotada de todas las
secuencias de ADN a disposición del público. Es parte de la colaboración internacional de bases de
datos de secuencias de nucleótidos, que comprende el DNA DataBank of Japan (DDBJ), el the
European Molecular Biology Laboratory (EMBL), y GenBank del NCBI.
Genes and Disease: Resumen de la información sobre más de 80 trastornos genéticos con las
discusiones de la/s mutación/es subyacente/s y las características clínicas, así como enlaces a bases
de datos y organizaciones relacionadas.
Nucleotide Database: Una colección de secuencias de nucleótidos de varias fuentes. Buscando en la
base de datos de nucleótidos se obtendrán resultados a disposición de cada una de sus bases de
datos de componentes.
PubMed: Una base de datos de citas y resúmenes de la literatura biomédica de MEDLINE y revistas
de ciencias biológicas. Se proporcionan enlaces al texto completo de los artículos que están
disponibles a través de PubMed Central o de otros sitios. PubMed Central es un archivo digital de
texto completo biomédica y ciencias de la vida de la literatura de revistas, incluida la medicina
clínica y salud pública.
Reference Sequence (RefSeq): Una colección curada de secuencias de ADN genómica no
redundante, transcriptos (RNA), y secuencias de proteínas producidas por NCBI. RefSeqs
proporciona una referencia estable para la anotación del genoma, la identificación y caracterización
de genes, mutaciones y análisis de los polimorfismos, los estudios de expresión, y análisis
comparativos.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): Es la herramienta de similitud de secuencias más
utilizada. El algoritmo para nucleótidos BLAST encuentra secuencias similares al fraccionar la
secuencia de consulta en subsecuencias cortas llamadas palabras (words). El programa identifica las
coincidencias exactas de la palabra en la primera consulta. Luego se extiende en varios pasos para
generar los alineamientos. (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Primer-BLAST: Fue diseñado para hacer cebadores que son específicos de una plantilla de entrada
de PCR, utilizando Primer3. También puede comprobar cebadores suministrados por el usuario para
determinar su especificidad. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi).

Base de Datos de HIV de Los Álamos National Laboratories.

La HIV Database contiene información sobre secuencias genéticas del HIV, los epítopes
inmunológicos, mutaciones asociadas a la resistencia de drogas, y los ensayos de vacunas. El sitio
web también permite acceder a un gran número de herramientas que pueden utilizarse para
analizar estos datos. Este proyecto está financiado por la División de SIDA del National Institute of
Allergy and Infectious Diseases (NIAID), una parte de National Institutes of Health (NIH).
La dirección en la donde encontraremos la homepage es: http://www.hiv.lanl.gov/content/index

EJERCICIOS
La mayoría de los usuarios se limitan a escribir la palabra clave de su búsqueda en la página de inicio
de PubMed. Sin embargo, este tipo de búsqueda genera un gran número de resultados de poca
especificidad. Por este motivo debemos desarrollar competencias para utilizar estrategias de
búsqueda con la utilización de las herramientas que nos brinda PubMed. Para el desarrollo de una
estrategia de búsqueda debemos tener en cuenta los conceptos clave, los términos alternativos si
son necesarios, la fecha y los tipos de estudio, puesto que estos determinantes nos permitirán
limitar los resultados y ser más específicos. Revisemos varios métodos.

A- Búsqueda directa desde la página de inicio de PubMed.

Esta metodología es la más utilizada pero no la más adecuada, a no ser que se domine la
terminología MeSH a la perfección. La mayoría de los usuarios quedan satisfechos por la gran
cantidad de información obtenida, pero cantidad no equivale a calidad. Este tipo de búsqueda no
constituye por sí misma una estrategia. Se puede denominar “pesca milagrosa”.

1- Utilicemos las palabras claves “herpes zoster” para iniciar la búsqueda.

¿Cuántos artículos son encontrados? ……………………………………………………………..

2- Se puede realizar una búsqueda con operadores.

- AND: permite obtener resultados que contienen todos los términos planteados en la búsqueda. No
establece relaciones de orden entre los términos. El resultado de la búsqueda será más restringido
que si usan los términos en forma independiente.
Realicemos una nueva búsqueda agregando el operador AND y la palabra “pregnancy”.
¿Cuántos artículos son encontrados? …………………………………………………………..

- OR: recupera documentos que contienen al menos uno de los términos especificados en la
búsqueda. Amplía los resultados de una búsqueda puesto que reúne cada de las condiciones de la
pregunta. Los resultados serán mayores que si usa los términos en forma independiente.
Realicemos una nueva búsqueda agregando el operador OR y la palabra “pregnancy”.
¿Cuántos artículos son encontrados? ………………………………………………………..
- NOT: excluye términos de la búsqueda. Debe usarse con precaución puesto que puede excluir
información significativa.
Realicemos una nueva búsqueda agregando el operador NOT y la palabra “pregnancy”.
¿Cuántos artículos son encontrados? …………………………………………………………..
¿Con cuál de las búsquedas obtuvo más referencias? ¿Por qué?
............................................................................................…………………………………………………………………
….……………………………………………………………………………………………………………………………………………………...

3- El uso de paréntesis en una búsqueda permite controlar el orden de proceso de la búsqueda. Los
paréntesis actúan como operadores de “anidado”, de tal forma que los conceptos contenidos entre
paréntesis serán tratados en primer lugar y luego enlaza este resultado con el concepto que está
por fuera de los paréntesis.

Realice la búsqueda “herpes zoster AND pregnancy OR therapy”.

¿Cuántos artículos son encontrados? …………………………………………………………..

Realice la búsqueda “herpes zoster AND (pregnancy OR therapy)”.

¿Cuántos artículos son encontrados? ………………………………………………………..

¿Con cuál de las búsquedas obtuvo más referencias? ¿Por qué?

…..………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………..……………

4- Búsquedas con límites.

A la izquierda del panel de resultados se encuentran diversos filtros que permite delimitar los
criterios de búsqueda según múltiples criterios:
- Text availability: Abstract available, Free full text available, Full text available
- Publication dates: 5 years, 10 years, Custom range...
- Species: Humans, Other Animals
- Article types: Clinical Trial, Meta-Analysis, Practice Guideline, Randomized Controlled Trial, Review,
Systematic Reviews, more ...
- Languages: English, more...
- Ages: Child: birth-18 years, Infant: birth-13 months, Adult: 19+ years, Adult: 19-44 years, Aged: 65+
years, more...
- Sex: Male, Female
- Subjects: AIDS, Cancer, more ...
- Search fields: Choose ...
- Journal categories: Core clinical journals, Dental journals, MEDLINE, Nursing journals

Realice la búsqueda “herpes zoster”, utilizando los siguientes filtros:

- Text availability: Free full text available
- Publication dates: 5 years
- Article types: Review
- Ages: Child: birth-18 years
¿Cuántos artículos son encontrados? …………………………………………………………..
 B- Nucleotide Database
Realice una búsqueda de “varicela zoster virus”. Analice los resultados.
¿Qué diferencia encuentra con RefSeqs? Analice la información dada por el RefSeqs.

C- BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

- Acceder al BLAST del NCBI y elegir “nucleotide BLAST".
- En el campo de entrada pegar la siguiente secuencia nucleotídica:

GCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAGACACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGAAACAGCA
ACCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACCTACAGGGGCAAATGGTACATCAGCCCATATCACCTAGAACTTT
AAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTTATACCCATGTTTTCAGCATTAGCAGAAGGA
GCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAGGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCA
TCAATGAGGAAGCGGCAGAATGGGATAGACTGCATCCACCGCAAGCAGGGCCTGTTGCACCAGGCCAGATGAGAGACCC
AAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTTGTACCCTTCAGGAACAAATA

- Realizar la búsqueda utilizando “Nucleotide collection (nr/ns)” en Database Others.

- Analice resultados.

D- Base de Datos de HIV de Los Álamos National Laboratories.

- Realice el análisis de la secuencia anterior utilizando la HIV Sequence Database (Tools - HIV Blast).
Analice los resultados.
- Utilice la misma secuencia para localizarla dentro del genoma del HIV (Tools - Sequence Locator).
Analice los resultados.
- Utilice la misma secuencia para alinear con otras secuencias de HIV (Tools - QuickAlign). Analice los
resultados.

E- Primer-BLAST
- Realice la búsqueda de cebadores para la secuencia anterior en el Primer-BLAST. Analice la página del
programa. Analice los resultados obtenidos.
- Utilice la secuencia para analizar los siguientes cebadores:
Cebador Sentido: TGCATGGGTAAAAGTAGTAG
Cebador AntiSentido: ACTTCCCCTTGGGTCTCTCAT
Analice los resultados.