UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

PROYECTO
DE
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA:

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS

SACHAROMYCCES CEREVISIAE TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A
ELEVADAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION DE
AGUARDIENTE

INTEGRANTES:

ALVEAR SANDRA

BASANTES FERNANDA

FIENCO ESTEFANÍA

GUEVARA DIANA

HERAS DIANA

ANTECEDENTES:
 1. TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIOÓ N Y CARACTERIZACION DE CEPAS
SACHAROMYCCES CEREVISIAE TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A ELEVADAS
CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION DE AGUARDIENTE

2. OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GENERAL:

 Aislar, seleccionar y caracterizar cepas termotolerantes y resistentes a altas

concentraciones de alcohol de Saccharomyces cerevisiae para el mejoramiento de
la produccioó n de aguardientes, teniendo como materia prima melaza de canñ a de
azuó car y residuos de la etapa de fermentacioó n de canñ a de azuó car.

2.2. OBEJTIVOS ESPECIFICOS:

 Obtener melaza de canñ a de azuó car mediante la preparacioó n, extraccioó n del jugo,
clarificacioó n, evaporacioó n, cristalizacioó n y centrifugacioó n
 Aislar las cepas de Saccharomyces cerevisiae fermentadoras y de melaza de canñ a
de azuó car en agar malta.
 Seleccionar las cepas de Saccharomyces cerevisiae termotolerantes y resistentes a
etanol del cultivo aislado de melaza de canñ a
 Obtener cultivos axeó nicos de Saccharomyces cerevisiae
 Caracterizar morfoloó gicamente las cepas aisladas de Saccharomyces cerevisiae

3. ANTECEDENTES

Para realizar el presente trabajo nos hemos basados en publicaciones cientíóficas y

rendimientos actuales para tener una idea clara de los estudios realizados y por ende
poder mejorar la calidad del aguardiente.

Los fenoó menos relacionados con la tolerancia teó rmica y la tolerancia a etanol de los
microorganismos han sido investigados exhaustivamente. La temperatura optima de
crecimiento especialmente de saccharomyces cereviciae es de 30° a 35 °C, la temperatura
afecta el crecimiento de manera notable, principalmente porque los microorganismos de
una especie dada solo pueden crecer en un rango restringido de temperatura, seguó n
estudios realizados se ha reportado que la tolerancia a el etanol y altas temperaturas son
interactivos, porque las concentraciones altas de alcohol disminuyen la temperatura
optima de crecimiento y el aumento de la temperatura incrementa el efecto inhibitorio de
etanol por lo tanto afecta directamente al rendimiento.

Los efectos toó xicos de la temperatura y el etanol estaó n relacionados con alteraciones de la
permeabilidad de las membranas celulares, la desnaturalizacioó n de proteíónas
intracelulares, asíó como la inhibicioó n del transporte de nutrientes.
El mecanismo de respuesta celular al estreó s por temperatura y por etanol es
esencialmente similar y consiste en cambios en la composicioó n lipíódica de las membranas
y en síóntesis transitoria de proteíónas. Entre las estrategias para mejorar la tolerancia
teó rmica se encuentran la seleccioó n de cepas, adaptacioó n de cepas mediante incubacioó n a
temperaturas crecientes.

Las cepas nativas dan un rendimiento de 0.39 g de etanol por cada gramo de azuó cares a
35°C pero a 40°C (cepas termotolerantes) se obtiene0.41g de etanol por cada gramo de
azuó cares, mejorando asíó su rendimiento y a la par dando una disminucioó n de tiempo de
fermentacioó n.
 4. JUSTIFICACION

De acuerdo al reporte de consumo de bebidas alcoholicas Overview 2008, elaborado por

Ipsa Group, el 76% de los compradores prefieren consumir agua ardiente sobre otro tipo
de bebidas, Quito es la ciudad donde se realiza el mayor nuó mero de adquisiciones de este
producto, ya que el estudio determina que el 56,9% de los capitalino consume este tipo de
bebidas frente al 43,1% de los guayaquilenñ os.

En ecuador el uso de melaza como sustrato para la produccioó n de saccharomyces

cerevisiae es utilizado para la obtencioó n de aguardiente, existe alrededor de 78 000
hectaó reas cultivadas de canñ a destinadas a la produccioó n de azuó car. Unas 30 000 hectaó reas
de canñ a de azuó car estaó n destinadas a la produccioó n de aguardiente y otros productos
artesanales.

El rendimiento de una fermentacioó n con la utilizacioó n de las cepas nativas de

saccharomyces cerevisiae se puede ver incrementado con la utilizacioó n de cepas
termotolerantes, ya que se logra producir mayor cantidad de etanol con menor consumo
de azucares, se economisa la materia prima por lo tanto disminuyen costos de produccioó n
que generaran un incremento de ingresos de una fabrica productora de agua ardiente.

Tomando en cuenta los datos citados anteriormente, se puede establecer que la

elaboracioó n de aguardiente como bebida alcoholica es rentable en nuestro paíós y aunque
no se pretende competir con las grandes faó bricas productoras, se sugiere la
optimizacioó n del proceso, con la utilizacioó n de cepas termotolerantes que aumenta la
resistencia al etanol, disminuyen el tiempo de fermentacioó n, y aumenta la produccioó n.

5. MARCO TEORICO:

5.1 CAÑA DE AZÚCAR

La canñ a de azuó car es una gramíónea tropical, en cuyo tallo se forma y acumula un jugo rico
en sacarosa, compuesto que al ser extraíódo y cristalizado forma el azuó car.

5.2 MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

Las melazas, mieles finales o melazas “blackstrap”, suelen ser definidas, por muchos
autores como los residuos de la cristalizacioó n final del azuó car, de los cuales no se puede
obtener maó s azuó car por los medios fíósicos.
La melaza es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azuó car invertido, sales y otros
compuestos solubles en aó lcali que normalmente estaó n presentes en el jugo de la canñ a
localizado, asíó como los formados durante el proceso de manufactura del azuó car. Ademaó s
de la sacarosa, glucosa, fructosa y rafinosa los cuales son fermentables, las melazas
tambieó n contienen sustancias reductoras no fermentables.
Estos compuestos no fermentables reductores del cobre, con principalmente caramelos
libres de nitroó geno producidos por el calentamiento requerido por el proceso y las
melaniodinas que si contienen nitroó geno derivadas a partir de productos de condensacioó n
de azuó car y aminocompuestos.

5.2.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA (%) DE LA MELAZA DE LA CAÑA DE AZÚCAR

COMPONENTES CONSTITUYENTES CONTENIDO (p/p)

 Materia seca 78%
Proteíónas 3%
sacarosa 60-63%
COMPONENTES MAYORES Azuó cares reductores 3-5%
Sustancias disueltas 4-8%
(azuó cares diferentes)
Agua 16%
grasas 0.40%
Cenizas 9%
Calcio 0.74%
CONTENIDO DE magnesio 0.35%
MINERALES foó sforo 0.08%
potasio 3.67%
SALES Orgaó nicas 3.0-3.4%
inorgaó nicas 1.5-4.5%
AÓ cidos orgaó nicos 1-3%
COMPONENTES MENORES Aminoaó cidos 1.5-5.5%
Almidones 0.001-0.050%

Las melazas se obtienen como un subproducto final en la elaboracioó n de la canñ a de azuó car.

5.3 MICROORGANISMOS DE LA MELAZA

Mediante ensayos adecuados con soluciones diluidas de malazas, se ha demostrado que

estas, a pesar de su bajo contenido de foó sforo, constituyen un buen medio de cultivo para
muchos microorganismos, tales como levaduras hongos y bacterias.

Se considera importante la presencia de microorganismos mesoó filos termoó filos dentro de

la melaza. Los organismos mesoó filos se desarrollan bien durante la dilucioó n de las melazas.

5.3.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Es la especie de levaduras utilizada por excelencia para la obtencioó n de etanol a nivel

industrial debido a que es un microorganismo de faó cil manipulacioó n y recuperacioó n, no es
exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de
etanol, en la fermentacioó n produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz
de utilizar altas concentraciones de azucares.

Las levaduras, son organismos eucarioó ticos unicelulares, por lo tanto sus estructuras se
encuentran formadas por pared celular, nuó cleo diferenciado y organelos con ribosomas y
mitocondrias.

Saccharomyces Cerevisiae es una levadura cuya colonia es de color crema o blanco,

apariencia huó meda y brillante, de bordes irregulares.

La temperatura oó ptima de crecimiento es de 25 a 30 0C. Puede producir ascosporas cuando

hay requerimientos nutricionales adecuados

6. MARCO METODOLOGICO:

6.1 PROCESO DE OBTENCIÓN DE MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

 6.2 AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE

6.2.1 AISLAMIENTO

FASE DE ENRIQUECIMIENTO

1. Inocular alíócuotas de 1 ml de crema de levadura en un erlenmeyer de 150 ml

contenidas en 50 ml de caldo de mata reforzado
2. Incubar a 45°C con agitacioó n (120rpm) durante 15 a 20 horas hasta que la turbidez
indique evidencia de crecimiento celular
3. Tomar muestras de los matraces con resultados de crecimiento positivo y realizar
diluciones seriadas hasta 10-5 con suero fisioloó gico (9 g/L de NaCl)

6.2.2 FASE DE SELECCION

1. A partir de los cultivos diluidos efectuar siembras por estriado sobre agar malta.
 2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas

6.2.3 FASE DE PURIFICACIÓN

1. Realizar una resiembra por estriado en agar malta enriquecido con ampicilina
(300mg/L) para inhibir la flora competitiva que aun puede persistir.
2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas.

6.2.4 FASE DE CONSERVACIÓN

1. Del cultivo puro obtenido en la fase anterior seleccionar las mejores colonias y
aplicar el meó todo de perlas para conservacioó n
2. Colocar en los crioviales de 10 a 20 perlas las cuales seraó n conservadas.
3. La temperatura adecuada para la conservacioó n de la cepa es de 4°C

DIAGRAMA DE FLUJO DEL AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Figura N°1

Crema de levaduras residual

Incubación en caldo malta

reforzado a 45°C de 15 a 20
horas

Crecimient NO
SI
o

Diluciones

Siembra en placa

Incubación a 35°C por 48

horas

Colonias aisladas

Colonias aisladas

Resiembra en placas

Incubación a 35°C por 48

horas
 Cultivo puro

Método de perlas

Selección de perlas y
colocación en crioviales

Crioconservación a 4°C (T
sugerida)

7. HIPOTESIS NULA

Las cepas de saccharomyces cerevisiae aisladas e identificadas no son tolerantes a estreó s

de la produccioó n (T=40°C, altas concentraciones de etanol)

7.1 HIPOTESIS ALTERNATIVA

Las cepas de saccharomyces cerevisiae aisladas e identificadas son tolerantes a estreó s

de la produccioó n (T=40°C, altas concentraciones de etanol)

8. FACTIBILIDAD

Cantidad de Cantidad
Precio
Medios y Referencia Ncesaria
Reactivos Cantidad a
mL g mL 500g
utilizar
Agar Maltosa 983 38 450 62 0.70
Caldo
1000 37 50 47 0.27
Maltosa
Suero 1000 9 50 12 0.06
Fisiológico
MATERIAL CANT UNITARIO TOTAL
Tubos 5 5 0.10 0.50
Cajas 15 15 0.15 2.25
Crioviales 5 5 1.50 7.50
Pipetas LABORATORIO
Biorreactor
TOTAL 11.28