INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA ADN

POLIMERASA γ DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y SU USO

COMO HERRAMIENTA BIOTECNOLÓGICA

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

PRESENTA

RAYMUNDO MONDRAGÓN MARTÍNEZ

DIRECTOR EXTERNO: DR. LUIS G. BRIEBA DE CASTRO

México D.F., Mayo de 2007

i
 Lugar de Realización del Proyecto:

Laboratorio de Bioquímica Estructural; Departamento de Bioquímica del Centro de

Investigaciones y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

Asesor Externo
(Director del proyecto) Dr. Luis G. Brieba de Castro

Asesor Interno
M.C. Gloria López Jiménez

Sinodal
M.C. Patricia Vázquez Lozano

Alumno sustentante
Raymundo Mondragón Martínez

ii
 AGRADECIMIENTOS

A mis padres Rafael y Beatriz por ser los padres que han sido, por
creer siempre en mi y por haberme dado la educación más sólida junto con los
mejores fundamentos para no flaquear y así poder mantenerme siempre a la altura de mis sueños…

A cada una de mis tías, -Vicky, Shofi y Luz- por haber sido cada
una como una madre más en toda mi vida, ya que sin
ustedes es un hecho que no lo hubiera logrado…

A los que ya no están a mi lado…

A mis abuelitos Benja y Elena, simplemente porque al A mi tío Quique porque estoy seguro que le
recordarlos, el único sentimiento que me hubiera encantado ver como terminaba
embriaga, es el amor… con éxito…

A la que parece que siempre estará conmigo, Mi Beatricita…

A mis hermanos Rafa y Rochy, por ser los hermanos que han sido
¡¡ya lo logramos los 3!!…

A mis amigos

A Mario, simplemente mi hermano para siempre, por abrirme las puertas

de su casa, así como a sus padres, por tratarme como
a un hijo más, es algo que jamás olvidaré…
A Cuau, por hacer parecer que la escuela era tan sencilla
y de igual forma, por abrirme las puertas de su
casa y también a sus padres…

A mi muy querido hermano Leo, por enseñarme esa leve actitud

de omnipotencia jaja y por siempre animarme y enseñarme
lo que necesitaba sin necesidad de hablar…
A Paquito, por enseñarme lo verdadero Merol…
Al buen Alex Fernández por ser un hermanito
y por demostrarme la verdadera
nobleza en alguien…
A mi último amigo adquirido, Dany Olguín “el chavito”,
por demostrarme su sincera amistad
tan rápido…

A mis dudes de la infancia – Pablo, Robert y Jorge –

Y a todos los que me faltan discúlpenme pero solo dejé está hoja…

Al Dr. Luis G. Brieba, ya que a pesar de ser una persona

muy exitosa, me hizo sentir bien y me ayudó siempre
en lo que necesité…

A la que se robó mi corazón y me dijo que siempre lo querrá para ella, la que
me enamoró con una ida a comer y de quien me enamoré como
siempre deseé enamorarme de alguien, en un concierto
de U2… Para ti, mi preciosa Virginia D. Osorio A.
Gracias por todo tu amor y apoyo…

iii
 ÍNDICE

1. RESUMEN 1
2. INTRODUCCIÓN 2
3. ANTECEDENTES 4
3.1. Replicación de ácidos nucleicos 4
3.2. Replicación mitocondrial 5
3.2.1. Mecanismos de replicación del ADN mitocondrial 6
3.3. ADN polimerasas 7
3.4. Expresión recombinante de ADN polimerasas mitocondriales 8
3.4.1. Características de las ADN polimerasas mitocondriales 9
3.5. Investigaciones previas en la elaboración de quimeras 10
4. JUSTIFICACIÓN 12
5. OBJETIVOS 13
5.1 Objetivo General 13
5.2 Objetivos Específicos 13
6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 14
7. MATERIALES Y MÉTODOS 15
7.1. Obtención del ADN genómico de S. cerevisiae 15
7.2. Diseño in silico de las construcciones a realizar del ADN polimerasa γ 15
7.3. Diseño de los iniciadores para amplificar las tres construcciones de la
ADN polimerasa γ 16
7.4. Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) del
gen completo y las dos deleciones de la ADN polimerasa γ 16
7.5 Obtención de los cassettes 18
7.6 Obtención del vector 18
7.7. Subclonación de la ADN polimerasa γ de Saccharomyces cerevisiae
en el plásmido pET28a(+) 19
7.8. Obtención de clones positivos conteniendo el gen de la ADN
polimerasa γ de S. cerevisiae en vectores de expresión de procariontes 19
7.9 Corte con enzimas de restricción 20
7.10 Electroforesis de ADN en gel de agarosa 20
7.11 Expresión recombinante de la ADN polimerasa γ de S. cerevisiae
en Echerichia coli 21
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 22
8.1. Diseño de construcciones 22
8.2. Diseño de oligonucleótidos 23
8.3. Amplificación del gen completo y de dos mutantes de deleción de
la ADN polimerasa γ de S. cerevisiae por medio de la PCR 24
8.4. Reacción de ligación del gen completo y de las mutantes de deleción
de la ADN polimerasa γ de S. cerevisiae en el vector pET28a(+) 25
8.5. Identificación de clones positivos 26

iv
 8.6. Expresión recombinante de la ADN polimerasa γ en E. coli 27
9. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO 28
10. CONCLUSIONES 31
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32
ANEXOS

v
 ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS

Cuadro 1. Similitudes entre las ADN polimerasas que intervienen en la

replicación 3
Cuadro 2. Reactivos y concentraciones finales para la amplificación del gen
completo y las dos deleciones de la ADNpolγ 5
Cuadro 3. Programa para el termociclador 5
Cuadro 4. Proporción inserto:vector en la subclonación de la ADNpolγ en el
plásmido pET28a(+) 25

Figura 1. Similitudes estructurales entre la ADN polimerasa γ y la T7 ADN

polimerasa 13
Figura 2. Dominio de sitio de unión de la tioredoxina en el bacteriófago T7 y
la ausencia de éste en la ADN polimerasa I de E.coli 17
Figura 3. Superposición del dominio del pulgar de la Taq ADN polimerasa
(azul) con la T7 ADN polimerasa (rosa). Las flechas indican el sitio de inserción
de la T3 TBD (amarillo). La secuencia primaria de aminoácidos de la Taq ADN
polimerasa desde el residuo 470 – 507 se indica debajo (azul) con la secuencia
de la T3 TBD (amarillo) y la región deletada en rojo. 18
Figura 4. Metodología para la subclonación y expresión de la ADNpolγ de
Saccharomyces cerevisiae 14
Figura 5. Diseño de construcciones a partir de la secuencia de aminoácidos
de la ADNpolγ y el fragmento Klenow 22

Figura 6. Diseño de oligonucleótidos para amplificar el gen de la ADNpolγ y

deleciones en el N-terminal 23
Figura 7. Amplificación del gen completo y de dos mutantes de deleción de
la ADNpolγ de S. cerevisiae. Línea 1) gen completo de 3762 nucleótidos,
2) Deleción Δ102 de 3 456 nucleótidos, 3) Deleción Δ124 de 3390 nucleótidos.
El marcador de peso molecular de 1 kb (New England Biolabs) muestra que los
productos de amplificación corresponden al tamaño esperado 24

vi
 Figura 8. Reacción de ligación de dos mutantes de deleción y el gen completo
de la ADNpolγ. Línea 1) plásmido pET28a cortado con NheI y SacI, 2) plásmido
pET28a superenrrollado, 3) marcador de peso molecular de 1 kb NEB, 4) producto
digerido de la deleción II, 5) producto digerido de la deleción I, 6) producto digerido
del gen completo de la ADNpolγ de S. cerevisiae 25
Figura 9. Doble digestión con NheI y SacI de la mutante de deleción II
de la ADNpolγ de S. cerevisiae. Líneas 1 a la 6 representan 6 colonias
(en este caso todas positivas), se observan dos bandas, una inferior y
otra superior que corresponde al plásmido pET28a de 5 369 nucleótidos
digerido. La banda más intensa del marcador de peso molecular corresponde
a 3 kb y la inmediata superior a 4 kb 26
Figura 10. Gel SDS-PAGE que muestra la expresión recombinante de la
ADNpolγ de S. cerevisiae. Líneas 1 y 2 muestran la construcción completa,
líneas 3 y 4 construcción ΔNterm124. Líneas 2 y 4 después de la inducción.
La expresión de la proteína se muestra con dos asteriscos 27
Figura 11. Metodología para la construcción de la quimera Taq ADN pol / γ 29
Figura 12. Esquematización más detallada para la construcción de la
quimera Taq ADN pol / γ 30

vii
 1. RESUMEN

Desde que Arthur Kornberg obtuvo de forma sintética y describió por primera vez a la ADN
polimerasa de Escherichia coli, a la fecha se han descrito cinco tipos más. Estas
polimerasas, aunque muy semejantes llevan a cabo diferentes funciones en lo que a la
síntesis del ADN respecta, ya que mientras unas sirven de iniciadores de este proceso (α),

otras la llevan a cabo (δ), así como unas más lo reparan (β, ε). Sin embargo se encontró
que ciertos organelos que llevan a cabo una función importante en la célula como la
respiración celular y el metabolismo energético en general, poseen su propio material
genético. Uno de estos organelos es la mitocondria, que a su vez cuenta con la ADN
polimerasa γ como la encargada de la síntesis total de su material genético en eucariontes.

Esta polimerasa γ se encuentra únicamente en humanos y levaduras, además es una

enzima sumamente fiel. A diferencia de S. cerevisiae, la de humano necesita un factor de
procesividad para que funcione eficientemente, sin embargo esta polimerasa guarda una
gran similitud con la polimerasa del bacteriófago T7, por lo cual es de gran interés nuestro
su comparación para el análisis funcional y estructural de nuestra polimerasa.

De lo anterior parte el interés acerca del estudio de esta polimerasa, ya que el modelo
tomado como estudio, el de Saccharomyces cerevisiae, es altamente procesivo y no
necesita de ningún factor extra para llevar a cabo la replicación total. De esta forma es
importante comprender el funcionamiento de esta unidad enzimática para así vislumbrar
las interacciones en el núcleo del resto de las polimerasas. Además de que se tiene un
especial interés en la mitocondria ya que a ella se le atribuyen múltiples enfermedades en
humanos, como la diabetes tipo II, disfunciones cardiacas, así como el envejecimiento
mismo.

De esta forma el interés fue expresarla de forma recombinante en E. coli en la cepa

BL21/DE3 Rosseta II para así producirla en grandes cantidades y facilitar su estudio futuro.

1
 2. INTRODUCCIÓN

En los organismos eucarióticos la mayor parte de la extensa información genética reside

en el núcleo, sin embargo poseen organelos con su propio material genético, mismos que
cumplen el papel primordial de principales proveedores de energía para la célula, ya que
llevan a cabo reacciones de fosforilación oxidativa en mitocondria o fotosíntesis en
cloroplastos. El plan es contribuir en el entendimiento de cómo el metabolismo del ADN es
llevado a cabo en los organelos. Se tiene un especial interés en las transacciones llevadas
a cabo por el ADN mitocondrial (mtADN), usando como modelo a Saccharomyces
cerevisiae. La mitocondria es especialmente interesante ya que guarda una relación con el
envejecimiento en humanos.

A pesar del tamaño relativamente pequeño del material genético en la mitocondria, debido
a la transferencia mitocondrial al núcleo, el mtADN está asociado a una multitud de
enfermedades, incluyendo diabetes tipo II, anormalidades musculares y cardiacas y
envejecimiento. Las transacciones del mtADN son realizadas por una sola subunidad
enzimática la cual desplaza a las subunidades múltiples enzimáticas bacterianas más
complejas presentes en el endosimbionte original, levaduras y en humanos. Todas las
enzimas implicadas en las transacciones del ADN son codificadas en el núcleo e
importadas por la mitocondria. Entendiendo como trabaja una sola subunidad de las
polimerasas es importante para comprender estas transacciones del ADN que ocurren en
la mitocondria, pero también para entender el rol de las polimerasas en el núcleo, como
nuevos miembros de esta familia, como la ADN polimerasa Q y la ARN polimerasa IV que
se localizan en éste [1,2].

En el presente trabajo escogimos estudiar las funciones del mtADN usando como modelo
a la levadura S. cerevisiae por sus obvias ventajas, ya que puede crecer de forma
anaerobia además de la enorme cantidad de herramientas genéticas en levaduras. Pero
para el sistema bioquímico es un sistema particularmente atractivo ya que las enzimas
envueltas en estas funciones del ADN son similares a los sistemas clásicos que posee el
bacteriófago T7. Para el caso, la transcripción mitocondrial es realizada por una ARN
polimerasa similar a la ARN polimerasa del bacteriófago T7, así como también posee
similitudes respecto a la replicación. Este bacteriófago tiene el replisoma más simple
conocido a la fecha, con solo cuatro proteínas implicadas para llevar a cabo la síntesis

2
coordinada de ADN, por lo que supondremos varias similitudes entre éste y nuestra
levadura. En el cuadro 1 mostramos la similitud replicativa mitocondrial entre S. cerevisiae
y la humana, así como las del bacteriófago.

Cuadro 1. Similitudes entre las ADN polimerasas que intervienen en la replicación

Partiendo de lo anterior, se pretende estudiar las interacciones existentes en el mtADN así

como a la ADN polimerasa γ (ADNpolγ) de S. cerevisiae, la cual será el centro de atención
en el presente trabajo ya que es la encargada de llevar a cabo la replicación del mtADN y
se ha estudiado que le confiere alta procesividad a este fenómeno.

3
 3. ANTECEDENTES

3.1 Replicación de ácidos nucleicos

Una vez que Watson y Crick elucidaron la estructura del ADN fue más sencillo comprender
su funcionamiento. Una de las ideas que surgió inmediatamente debido a la
complementariedad de ambas hélices fue que si por medio de estas hebras se transmitía
la información genética, entonces cada una de las bases en su orden tan preciso y estricto
debían de funcionar como un código, mismo que a mediados de los 50’s ya se sabía que
su información llevaba hacia las proteínas.

Con el conocimiento de que las proteínas se sintetizaban fuera del núcleo, fue entonces
que Crick hizo la interrogante de ¿Cómo era posible eso? Así es que propuso a un posible
intermediario llamado ARN que se encuentra en el citoplasma, el cual poseía ciertas
características que cada vez lo llevaban a asegurar sus hipótesis, entre las cuales estaban
que poseía un esqueleto de azúcares y fosfato tomando en cuenta que en vez de ribosa
tenía desoxirribosa, que usaban las mismas bases nitrogenadas solo que tenía uracilo en
vez de timina, sin embargo éste se podía unir a la adenina como lo hacía la timina y que
era de cadena sencilla. A toda esta idea condensada Crick le llamó dogma central de la
biología, especificando que el ADN se traducía a ARN y a partir de éste se producían las
proteínas. Lo que hoy en día conocemos perfectamente como la replicación, transcripción
y traducción respectivamente.

El objeto de interés principal en este trabajo es la replicación, por lo que es importante

señalar que ésta no es un proceso espontáneo y pasivo ya que se requiere que la doble
hélice se abra y se sinteticen las nuevas cadenas de ADN, así que es un proceso llevado a
cabo por un conjunto de enzimas especializadas.

En el inicio de la replicación, las topoisomerasas son las enzimas encargadas de evitar el

superenrollamiento de las cadenas mientras las helicasas logran desenrollar la cadena
original doble rompiendo los enlaces de Hidrógeno, por lo que necesita de ATP para este
fin. Las proteínas de unión de cadena sencilla (SSB) se unen a las cadenas sencillas
evitando que se unan de nuevo, mientras que la ADN polimerasa lleva a cabo la
elongación de la cadena nueva mediante la unión de los dNTP’s libres y colocándolos con

4
sus complementarios formando un enlace fosfodiester. Existen varias ADN polimerasas,
donde la responsable de la procesividad en la síntesis de la cadena nueva es la ADN
polimerasa III. También interviene la primasa que es parte de un agregado de proteínas
llamado primosoma que fija un pequeño iniciador de ARN a la cadena sencilla de ADN
como sustituto de 3’ OH para que inicie la síntesis la ADN polimerasa además de la ligasa
que cataliza la formación de los enlaces fosfodiester.

Por supuesto que la explicación anterior es muy vaga, sin embargo es suficiente ya que lo
que nos interesa aquí es el estudio de las polimerasas, en especial la ADN polimerasa γ
encargada de replicar el mtADN de S. cerevisiae que se explicará a continuación.

3.2 Replicación mitocondrial

La ADN polimerasa γ es la única ADN polimerasa mitocondrial en humanos y levaduras

[3,4], esta característica es conservada en la mayoría de las células eucariontes, con la
excepción de la mitocondria de Tripanosoma la cual contiene al menos 5 ADN polimerasas
[5]. En S. cerevisiae el gen MIP1 expresa un polipéptido de 1255 aminoácidos compuesto
de dos subdominios: el dominio exonucleasa 3’ – 5’ y el dominio arquetipo (pulgar, palma y
dedos), en contraste con la ADN polimerasa γ en humanos que no necesita una proteína
accesoria (subunidad p55) para realizar la procesiva síntesis de ADN.

A la fecha, la única familia ADN polimerasa A trabaja como el replisoma T7 ADN

polimerasa. Sin embargo la deleción de seis aminoácidos en su dominio exonucleasa de la
T7 ADN polimerasa produce un mejor cristal, que será utilizado en experimentos
posteriores ajenos al presente. La reciente estructura del cristal de la doble mutación
puntual (D5A, E7A) muestra una conservación en la exonucleasa y confirma noción de que
la tioredoxina le confiere procesividad (Brieba and Ellenberger, manuscrito en
preparación).

En comparación con la T7 ADN polimerasa, la polimerasa γ de S. cerevisiae contiene una

extensión de alrededor de 170 aminoácidos en su dominio amino terminal y una secuencia

de alrededor de 40 aminoácidos en el subdominio del pulgar, que es análogo al lazo de
unión de tioredoxina del T7 (Figura 1).

5
3.2.1 Mecanismos de la replicación del ADN mitocondrial

Las ADN polimerasas necesitan un iniciador (primer o cebador) para comenzar la

replicación. Está bien documentado que en los bacteriófagos, bacterias y humanos la
actividad enzimática de la primasa es la que comienza el iniciador para la síntesis de la
hebra discontinua, mientras que existe un mecanismo múltiple para la síntesis de la hebra
líder. También está bien documentado que en la mitocondria de S. cerevisiae la ARN
polimerasa mitocondrial (mtARNP) transcribe un híbrido ARN:ADN en la secuencia ori/rep
que es usada como cebador inicial para la ADN polimerasa γ [6].

Figura 1. Similitudes estructurales entre la ADN polimerasa γ y la T7 ADN

polimerasa

La ADN polimerasa γ humana es una transcriptasa reversa eficiente, así es capaz de usar
este híbrido ARN:ADN para iniciar la replicación. La región 5’ rica en G:C en contraste con
la secuencia rica en A:T de levaduras mutantes sin secuencias transcripcionales ori/rep en
un origen secundario, conducen a la replicación [7]. El sitio ori es aproximadamente de 270
pares de bases y se divide en 3 partes (A, B y C). Un modelo propuso que la subunidad β

6
está implicada en ambos iniciadores recombinantes de la polimerasa γ completa, que tiene

poca expresión y es insoluble. Sin embargo el fragmento ΔNterm124 es soluble y puede

ser purificado con cromatografía de afinidad, y es activa en la extensión del iniciador.

Calculamos que se pueda obtener aproximadamente 1 mg de proteína purificada por litro
de cultivo bacteriano.

3.3 ADN polimerasas

Las ADN polimerasas de la familia A conservan un mismo plegado y mecanismo, donde su

estructura se puede comprender mejor si lo comparamos con nuestra mano derecha, ya
que éstas poseen esta forma, como ya se mostró en la figura 1, de esta forma conocemos
diversas ADN polimerasas entre las más comunes tenemos a la ADN pol I (Klenow) y Taq
ADN polimerasa (TaqADNpol) que se encargan de los fragmentos de Okasaki, a la
ADNpolγ y la T7 ADN polimerasa (T7ADNpol) quienes se encargan de la replicación total
de un genoma, así como la ADN polimerasa Q (ADNpolQ) que se encarga de reparar al
ADN.

Cuando nos referimos a polimerasas, la procesividad se refiere al número de nucleótidos

que son adicionados a la cadena naciente durante un ciclo de unión/disociación del
iniciador/templado o molde. La procesividad de las ADN polimerasas está íntimamente
ligado a su rol biológico. Enzimas que copian genomas completos presentan una mayor
procesividad, la reparación de largos huecos debe proceder con una menor procesividad
mientras que un modo distributivo de catálisis parece el adecuado para los huecos
pequeños [8].

El deslizamiento ocurre durante la síntesis de secuencias microsatélites repetidas y se

caracteriza por la expansión o deleción en el número de unidades repetidas. Un
mecanismo propuesto para este deslizamiento envuelve la disociación de la cadena en
crecimiento y la formación del lazo (loop) consistiendo de una o más unidades repetidas en
cualquiera del templado como de la cadena naciente, la cual es estabilizada por puentes
de Hidrógeno con elementos adyacentes repetidos [9,10]. Ha sido previamente establecido
que la procesividad de la T7ADNpol se relaciona con la reducción en el deslizamiento
durante la repetitiva copia de las secuencias de ADN, esto presumiblemente ya que sus

7
resultados son de alta procesividad y baja probabilidad de la disociación de la enzima
durante la replicación de las secuencias nucleotídicas repetidas.

Ya que empezamos a hablar acerca de la procesividad de las ADN polimerasas, y

partiendo de que esta procesividad está en función de su rol biológico como ya se
mencionó, nos podríamos preguntar el qué es lo que le confiere la procesividad a las
polimerasas así como el por qué varían estas si es que pertenecen a una misma familia de
polimerasas. La respuesta aún para cada polimerasa es incierta, sin embargo nosotros

pensamos que lo que le confiere procesividad a la ADNpolγ es el subdominio que

pertenece al pulgar, permitiendo anclarse firmemente a la cadena de ADN, ya que no se

sabe otro motivo por el cual esta polimerasa sea tan fiel.

3.4 Expresión recombinante de ADN polimerasas mitocondriales

Uno de los problemas con los que se enfrenta un bioquímico es el poder contar con
grandes cantidades de enzima relativamente pura para realizar los ensayos. La primera
ADN polimerasa se obtuvo a partir de cientos de litros de cultivo para obtener microgramos
de polimerasa [16,17]. Esta era la forma clásica en la cual se obtenía una proteína, es
decir a partir de un cultivo (ya sea de células animales, vegetales, de levadura, de E. coli o
de un tejido) se lograba fraccionar la proteína por medio de cromatografía y precipitación
en sales como sulfato de amonio.

Todo este tipo de trabajo cambio en 1977 (hace 30 años) con la producción recombinante
de la hormona somatostatina en E. coli. [18]. A lo largo de 30 años la técnica del ADN
recombinante ha cambiado muy poco, todo parte de la idea de poder contar con la versión
“sintética” del gen a expresar y un vector de expresión. La primera polimerasa de ácidos
nucleicos de la cual se obtuvo su secuencia completa de nucleótidos y aminoácidos
además de su sobreexpresión de forma recombinante fue el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I de E. coli. Hasta la fecha se ha reportado la expresión recombinante de las
ADN polimerasas mitocondriales de Homo sapiens, Drosophila melanogaster y Xenopus
laevis, sin embargo esta expresión se basa en el sistema de baculovirus el cual es
sumamente costoso y difícil de manipular. También se ha expresado a la ADN polimerasa
mitocrondrial de Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe sin embargo el

8
sistema ha sido en levadura, siendo también un sistema costoso y no tan sencillo de
manipular como el sistema de expresión en E. coli.

3.4.1 Características de las ADN polimerasas mitocondriales

Las ADN polimerasas mitocondriales, como todas las polimerasas de la familia A,

presentan alta fidelidad. Sin embargo hay dos características que las hacen únicas, su alta
procesividad y la capacidad de desplazar hebras de ADN.

Respecto a la procesividad se sabe que las ADN polimerasas de S. cerevisiae y S. pombe

no necesitan de la unión de una proteína accesoria para aumentar su afinidad al templado.
Lo anterior es en marcado contraste con las ADN polimerasas mitocondriales de H.
sapiens, Drosophila o Xenopus, las cuales necesitan de una proteína accesoria para unirse
al ADN con alta afinidad. Las ADN polimerasas mitocondriales de S. cerevisiae y S. pombe
tienen alrededor de 120 aminoácidos extra en el subdominio del pulgar cuando se le
compara con polimerasas como el fragmento Klenow a la Taq DNA polimerasa. Nosotros
especulamos que debido a la localización de estos 120 aminoácidos en el subdominio del
pulgar su función puede ser la de abrazar al ADN durante la replicación.

Es útil remarcar que lo que hace única a esta secuencia es que no necesita de proteínas
accesorias como es el caso del “Thioredoxin Binding loop” o lazo de unión a tioredoxina
que estabiliza la unión de la T7ADNpol con el ADN, pero solamente si el factor de
procesividad accesorio es decir la tioredoxina se encuentra presente, así como en el caso
de las ADN polimerasas de mitocondria de H. sapiens, Xenopus o Drosophila que también
cuentan con una proteína accesoria para estabilizar su unión al ADN.

Las ADN polimerasas de mitocondria en S. cerevisiae también tienen la capacidad de ir

desdoblando al ADN de cadena doble, esta característica es sumamente deseada en el
ámbito biotecnológico, para lograr la meta de secuenciar un genoma completo con una
sola enzima.

9
3.5 Investigaciones previas en la elaboración de quimeras

Investigaciones previas realizadas sobre lo que le confiere alta procesividad a la T7ADNpol

es que posee en su estructura un sitio de unión a la tioredoxina o TBD, de sus siglas en
inglés Thioredoxin Binding Domain, La unión de la tioredoxina a la T7ADNpol incrementa
su afinidad por el iniciador/templado además de conferir la habilidad de extender el
iniciador en la cadena sencilla de ADN por miles de nucleótidos sin disociarse [10].

La estructura tridimensional del fragmento de E. coli ADN polimerasa I (Fragmento Klenow)

es conocido. El sitio activo de la polimerasa y el dominio de unión al ADN se encuentran en
el carboxilo terminal (C-terminal), a la mitad de la molécula y la exonucleasa 3’-5’ con
actividad de corrección se localiza a la mitad del amino terminal (N-terminal). Comparando
ambas secuencias, la T7ADNpol y la E.coli ADN polimerasa I revela un segmento de
alrededor de 76 aminoácidos en la T7ADNpol (residuos 258 - 333) que no se encuentran
en la E.coli ADN polimerasa I. En la estructura de la E.coli ADN polimerasa I, esta región
corresponde a un inserto que se encuentre entre las hélices H y H1 (Figura 2). Estas dos
hélices se localizan en la región referida como “el pulgar” que se piensa es importante para
la interacción del ADN de doble cadena [11].

Figura 2. Dominio de sitio de unión de la tioredoxina en el bacteriófago T7 y la

ausencia de éste en la ADN polimerasa I de E.coli

A partir del conocimiento anterior, fue construida una quimera de E.coli ADN polimerasa I
con el subdominio de la T7ADNpol, lo cual resultó positivo, ya que aumentó la procesividad
de esta última de forma excepcional [12].

10
Otro trabajo que se ha realizado respecto al aumento de procesividad ha sido la inserción
de este mismo dominio de unión a la tioredoxina (TBD) de igual manera perteneciente al
subdominio del pulgar, pero en este caso del bacteriófago T3, de la T3 ADN polimerasa
TBD a la Taq ADN polimerasa en un sitio análogo, aumentando su procesividad (Figura 3).
Este sitio de unión convierte la procesividad de la enzima de un valor <15 nucleótidos
hasta una procesividad >2 000 nucleótidos, incrementando la afinidad del
iniciador/templado y aumentando el grado de elongación [13,14].

Figura 3. Superposición del dominio del pulgar de la Taq ADN polimerasa (azul) con la T7
ADN polimerasa (rosa). Las flechas indican el sitio de inserción de la T3 TBD (amarillo). La
secuencia primaria de aminoácidos de la Taq ADN polimerasa desde el residuo 470 – 507 se
indica debajo (azul) con la secuencia de la T3 TBD (amarillo) y la región deletada en rojo.

11
 4. JUSTIFICACIÓN

La ADNpolγ es una enzima altamente procesiva, sin embargo la obtención de ADN

polimerasas se obtiene solamente a partir de cultivos celulares de levadura o en forma
recombinante utilizando baculovirus. Como un punto de partida inicial deseamos construir
un vector de expresión en donde células de E. coli sinteticen a la ADNpolγ de S.
cerevisiae. Hasta la fecha no se ha reportado la expresión en bacteria de esta enzima ya
sea de levadura o de humano. Además, debido a que en el diseño y construcción de
quimeras existe un proceso bastante establecido en proteínas expresadas en bacteria,
deseamos ser los primeros en expresar a la ADNpolγ para tener un modelo de estudio que
nos permita su modificación.

A partir de ese modelo se tiene planeado a futuro la construcción de una quimera de la Taq
ADN polimerasa con los subdominios funcionales de la ADNpolγ. Partiendo del
conocimiento de que la ADNpolγ es altamente procesiva y que el factor que le confiere
esta procesividad es el subdominio del pulgar, pensamos que se pudiera construir una
quimera de la Taq polimerasa en la cual su subdominio del pulgar sea cambiado por el
subdominio del pulgar de la ADNpolγ, brindándonos una enorme ventaja sobre las
quimeras Klenow y Taq ADNpol/TBD, ya que éstas necesitan forzosamente a la

tioredoxina para ser funcionales, al contrario de lo estudiado en la ADNpolγ, ya que se

sabe que ésta es altamente procesiva y no utiliza tioredoxina u otro factor accesorio para
tener esa alta procesividad.

Respecto a la obtención de un dominio mínimo de la ADNpolγ, así como la medición de

sus parámetros cinéticos podrá brindar información muy útil, ya que la deleción de
alrededor de 124 aminoácidos en el extremo N-terminal posiblemente pertenezcan a una
región aparentemente no conservada y posiblemente innecesaria para su función. Además
se sabe que este dominio es indispensable para la actividad de la polimerización y se
especula que al truncarlo se aumentará la expresión de las proteínas recombinantes,
siendo importante para futuros experimentos de cristalografía que nos permitirán conocer

la longitud mínima del polipéptido que le confiere procesividad a la ADNpolγ de S.

cerevisiae.

12
 5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo General:

Obtención de la ADN polimerasa γ de S. cerevisiae de forma recombinante en E. coli

5.2 Objetivos Específicos:

5.2.1 Diseño in silico de dos construcciones recombinantes de la ADNpolγ

5.2.2 Amplificación por PCR del gen completo y de las dos deleciones de la

ADNpolγ

5.2.3 Subclonación de la ADNpolγ y de las dos construcciones recombinantes de

Saccharomyces cerevisiae en el plásmido pET28a(+)

5.2.4 Expresión recombinante de la ADNpolγ de S. cerevisiae en E. coli

13
 6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Obtención del ADN genómico de

S. cerevisiae

Diseño de oligonucleótidos

Amplificar gen de la Amplificar construcción

ADNpolγ de S. cerevisiae Δ124

Subclonar en vector de expresión

pET28a(+) (colita de histidinas)

Sitios de restricción: NheI y SacI

Identificación de clones
positivos

Identificar un sistema de
expresión

Analizar el sistema Analizar el sistema

BL21/DE3 BL21/DE3/RossetaII

Comparar,
analizar y concluir

Figura 4. Metodología para la subclonación y expresión de la ADNpolγ de

Saccharomyces cerevisiae

14
 7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1 Obtención de ADN genómico de S. cerevisiae

EL ADN genómico se obtuvo a partir de 1 L de cultivo de S. cerevisiae cepa S288c (cepa

secuenciada originalmente) [15], usada como punto de referencia para trabajar con
levadura. El cultivo de levadura se realizó en medio líquido y se incubó a 30 ºC. La pared y
membrana celular fue rota utilizando perlas de vidrio. En breve se crecieron en 5 mL de
medio de cultivo para levadura (medio YPD) y a partir de una sola colonia se crecieron a
30 ºC. Se transfirió el cultivo a un tubo de vidrio de 13 x100 mm. Las células se
centrifugaron durante 2 min en una centrifuga de mesa, desechándose posteriormente el
sobrenadante. Las células se lavaron con 5 mL de H2O, se centrifugaron durante 2 min
más y se volvió a desechar el sobrenadante. Éstas se resuspendieron en 500 μL de buffer
de lisis (0.1 M Tris pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS), a esta pastilla se le agregó perlas de
vidrio (400 - 500 μm) hasta antes del menisco y se mezclaron en vortex por 30 s mientras
se añadían 25 μL de una solución 5 M de NaCl. Se centrifugó por 2 min para disminuir la
espuma. El lisado fue removido con una pipeta de 1000 μL y se transfirió a un tubo de
microcentrífuga de 1.5 mL. A este lisado se le añadió 400 μL de buffer TE con fenol
saturado y se centrifugó por 4 min. La fase superior se transfirió a un tubo de
microcentrífuga nuevo (400 μL aprox.) y se añadieron 400 μL de fenol:cloroformo (4:1), se
mezcló en vortex, se centrifugó y se transfirió la fase superior a un tubo nuevo. Se añadió 1
mL de etanol al 95% y se mezcló. Se centrifugó por 6 min y se decantó el etanol. Se dejó
secar al ambiente y se resuspendió en 50 μL de buffer TE. La concentración de ácido
nucleico total fue determinada al medir la absorbancia a 260 nm.

7.2 Diseño in silico de las construcciones a realizar de ADN polimerasa γ

Con base a una alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa γ

de S. cerevisiae y la secuencia del fragmento Klenow se determinó que las dos deleciones
a realizar eran de 102 y 124 aminoácidos respectivamente. En el ANEXO I se observa una
superposición de las secuencias de aminoácidos del Fragmento Klenow y la ADN
polimerasa γ de S. cerevisiae. En esta superposición es evidente que el Fragmento Klenow
tiene por los menos 120 aminoácidos extras en el domino N-terminal en comparación con

15
el Fragmento Klenow. Nosotros suponemos que estos aminoácidos no juegan un papel en
la catálisis además de que no son importantes para interacciones proteína - proteína que
ocurren en el replisoma mitocondrial y por lo tanto son un buen punto de partida a eliminar.

7.3 Diseño de los iniciadores para amplificar las tres construcciones de la ADN
polimerasa γ

Los oligonucleótidos tuvieron como base la secuencia del ADN genómico de S. cerevisiae.
Un análisis in silico indicó la ausencia de intrones en el gen de la ADN polimerasa γ de S.
cerevisiae, por lo que la amplificación directa del gen puede llevarse a cabo. Para diseñar
los oligonucleótidos se utilizó una longitud de entre 18 y 26 nucleótidos para así llegar a
una Tm superior a los 55 ºC. En el extremo 5’ de los oligos se añadió el sitio Nhe I (5’
gtcgac 3’) dado que deseamos introducir los segmentos amplificados en el vector
pET28a(+) (el mapa del vector se encuentra en el ANEXO IV) y el sitio Nhe I esta cercano
al 5’ del sitio de clonación múltiple. Lamentablemente no podemos utilizar el sitio de
restricción Nde I porque nuestros segmentos a amplificar pueden ser digeridos por esta
enzima, principalmente hablando de nuestra deleción dos (ANEXO III). El oligo C-terminal,
el cual es un oligo consenso se diseñó para amplificar hasta el aminoácido 1254 y se
incluyó un codón de paro, además del sitio de restricción Sac I (5’ aagctt 3’). Los cuatro
oligonucleótidos a utilizar se diseñaron con 5 nucleótidos extra para asegura el corte con
las enzimas de restricción (ANEXO II-B)

7.4 Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) del gen completo
y las dos deleciones de la ADN polimerasa γ

Para llevar a cabo la PCR se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo de 600 μL en
el orden y proporciones marcadas en el cuadro 2.

16
 Cuadro 2. Reactivos y concentraciones finales para la amplificación del
gen completo y las dos deleciones de la ADN pol γ

Cantidad
Reactivo Concentración final
(μL)
Agua MiliQ 33 -------
Amortiguador 10X 5 1X
dNTP’s 2,5 mM 4 0,2 mM
-1
Iniciador N-terminal (12,5 pmol μL ) 2 0,5 μM
Iniciador C-terminal (12,5 pmol μL-1) 2 0,5 μM

ADN genómico ~45 ng μL-1 2 ~90 ng

Polimerasa Pfu 5 2,5 unidades

Los tubos se centrifugaron por 5 s y se colocaron en un termociclador MyCycler Biorad.

Para llevar a cabo la reacción se utilizó el programa estipulado en el cuadro 3.

Cuadro 3. Programa para el termociclador

Paso Temperatura (ºC) Tiempo
1 95 3 min
2 55 1 min
3 72 1,5 min
4 94 45 s
Regresar al paso 2 y repetir por 28 veces
5 72 5 min
6 4 ∞

Posteriormente se tomaron 5 μL de las PCR’s y se corrieron en un gel de agarosa al 1%

con marcadores de 1 kb de New England Biolabs (NEB).

17
7.5 Obtención de los cassettes

Los productos de PCR presentaron una banda única, por lo que solamente se limpiaron
con el PCR Cleanup Kit de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para la
obtención de las construcciones se realizaron reacciones de corte de los productos de
PCR de las 2 construcciones. Esta reacción consistió en colocar en un tubo Eppendorf lo
siguiente:

44 μL de la PCR
5 μL de Buffer de Reacción # 2 NEB
0,5 μL (5 unidades) de enzima NheI
0,5 μL (5 unidades) de enzima SacI
Dejándolo incubar toda la noche a 37 ºC.

Una vez realizado el corte, se eliminaron las enzimas de restricción con el PCR Cleanup
Kit de Qiagen y se determinó la concentración de ADN por medio de la lectura a 260 nm en
un espectrofotómetro.

7.6 Obtención del vector

El plásmido pET28a(+) se transformó en la cepa de Escherichia coli DH5α y las bacterias

se crecieron en un medio de LB/agar con Kanamicina. De esta transformación se tomó una
colonia de la placa y se creció un cultivo bacteriano de 10 mL en LB/kanamicina. El ADN
plasmídico del plásmido pET28a(+) necesita ser de alta calidad por lo cual se realizó su
extracción utilizando el DNA Miniprep Kit de la compañía Qiagen de acuerdo a las
instrucciones del proveedor. A partir de 10 mL de cultivo celular obtuvimos
aproximadamente 5 μg de ADN. Este ADN plasmídico fue linearizado de acuerdo al
siguiente protocolo:
85 μL del miniprep
10 μL de Buffer de Reacción # 2 NEB
2,5 μL (5 unidades) de enzima NheI
2,5 μL (5 unidades) de enzima SacI

18
Y se dejó incubar toda la noche. Para separar las poblaciones digeridas versus las no
digeridas se procedió a preparar un gel preparativo de agarosa al 1%.

7.7 Subclonación de la ADNpolγ de Saccharomyces cerevisiae en el plásmido

pET28a(+)

Para lograr una subclonación eficiente es importante la proporción de inserto/vector. En el

presente trabajo se realizaron diversas relaciones molares y llevadas a volúmenes finales
de 20 μL, incubándose a 16 ºC por 12 h, de acuerdo al cuadro 4.

Cuadro 4. Proporción inserto: vector en la subclonación de la

ADNpolγ en el plásmido pet28a(+)

Relación Molar 1:3 1:6 1:12

Vector 12 ng 12 ng 12 ng
Inserto 12 ng 24 ng 48 ng
Buffer 2 μL 2 μL 2 μL
Ligasa NEB 10 unidades 10 unidades 10 unidades
Temperatura de la reacción - 16 ºC -

Se realizó una transformación con vector sin ligasa como testigo negativo y uno de vector
superenrrollado como testigo positivo.

7.8 Obtención de clones positivos conteniendo el gen de la ADNpolγ de

Saccharomyces cerevisiae en vectores de expresión de procariontes

El proceso del aislamiento y purificación de plásmidos o Miniprep consistió en transferir 1,5

mL del medio de cultivo bacteriano a un tubo Eppendorf estéril y centrifugar a 12 000 rpm.
Se procedió a desechar el sobrenadante y se repitió la operación hasta completar 3 mL de
medio de cultivo. La pastilla bacteriana se resuspendió en 100 μL de solución de lisado (50
mM de glucosa, 25 mM de Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA). Se incubó por 5 min a
temperatura ambiente y se añadió 200 μL de un solución alcalina recientemente preparada
(0.2 N NaOH, 1% dodecil sulfato de sodio). El contenido del tubo se mezcló por inversión
de 5 a 6 veces hasta que la solución se tornó transparente y viscosa. Después de 5 min se

19
agregaron 150 μL de una solución 7.5 M de acetato de amonio a pH 7.8 y se mezcló el
tubo por inversión. Se procedió a centrifugar el tubo por 10 min a 14 000 rpm a
temperatura ambiente. El sobrenadante que contenía el plásmido de interés se transfirió a
un microtubo limpio y se añadió 0,6 volúmenes (250 μL aproximadamente) de isopropanol.
Esta solución se incubó a temperatura ambiente por 10 min y posteriormente se centrifugó
a 14 000 rpm por 10 min. Al decantar el sobrenadante se obtuvo una pastilla que contenía
el plásmido y el ARN, ésta se lavó con etanol al 70% y se dejó secar al aire. Esta pastilla
se disolvió en 100 μL de agua miliQ estéril y se agregó 1 μL de RNAsa A en una
concentración de 10 mg mL-1 y se incubó por media hora a 37 ºC. La RNAsa A fue
eliminada por medio de una extracción fenol/cloroformo y se procedió a precipitar el
plásmido con etanol. La pastilla obtenida fue resuspendida en 50 μL de agua miliQ estéril.

7.9 Corte con enzimas de restricción

Para liberar los insertos de las construcciones de la DNA polimerasa gamma. Se utilizó el
ADN plasmídico y se realizó un corte con las enzimas de restricción NheI y SacI, el cual
consistió en colocar en un tubo Eppendorf de 600 μl los siguientes reactivos:
7 μL de H2O MiliQ
10 μL del miniprep
2 μL de Buffer de Reacción # 2 NEB
0,5 μL (5 unidades) de enzima Nhe I
0,5 μL (5 unidades) de enzima Sac I

7.10 Electroforesis de ADN en gel de agarosa

Para efectuar una electroforesis de ADN se montó la cámara de electroforesis con un

peine de 8 pozos, dejando un espacio de aproximadamente 0,2 cm entre el final del peine
y la cámara. Se agregaron aproximadamente 35 mL de agarosa al 1% en buffer TAE a la
cámara. Al alcanzar una completa gelificación se removió cuidadosamente el peine así
como los sujetadores y se montó el gel en el tanque de electroforesis con suficiente buffer
para cubrir el gel. Se mezclaron las muestras de ADN con el buffer de carga y se cargó la
mezcla en el gel sumergido utilizando una micropipeta. Se colocó la tapa del gel de

20
electroforesis y se sometió a un flujo eléctrico de 90 V. Se corrió el gel en relación al
corrimiento del azul de bromofenol.

7.11 Expresión recombinante de la ADNpolγ de Saccharomyces cerevisiae en E. coli

En este método pondremos a crecer en matraces de 1L en caldo LB las cepas de E. coli

BL21DE3 y BL21DE3 Rosseta II a 37 ºC, cuando la densidad óptica alcanza 600 se añade
IPTG a una concentración final de 0,5 mM y se deja incubar en hielo durante toda la
noche, proceso conocido como inducción.

Previamente a la inducción se toma una alícuota del cultivo bacteriano sin IPTG (cultivo sin
inducir). Una vez finalizada la inducción (aproximadamente 15 h) se centrífuga el cultivo
bacteriano en una centrifuga Sorvall utilizando un rotor JA-10. Se decanta el sobrenadante
y se guarda la pastilla bacteriana a -20 ºC. La pastilla se resuspende en 25 mL de un buffer
de lisis conteniendo 25 mM Tris pH 8.0. 175 mM NaCl y 0.1 mM PMSF. Esta resuspensión
se somete a un proceso de sonicación por 45 s y una pausa de 1 min. Este proceso se
repite 6 veces. Las células sonicadas se centrifugan por 30 min a 17 000 rpm en un rotor
Sorval JA-20. El sobrenadante se pasa a través de un filtro de 0,2 μm.

Previamente se estabiliza una columna de Hi-Trap con Níquel utilizando el mismo buffer de
lisis. Se hace pasar el sobrenadante a través de la columna Hi-Trap y se lava con 15 mL
de buffer de lisis. El primer lavado se realiza con 15 mL de buffer de lisis pero con 20 mM
de Imidazol pH 8 y el segundo con buffer de lisis con 50 mM de imidazol pH 8. Finalmente
se eluye con 2 mL de buffer de lisis y 500mM de imidazol. La elusión se dializa en un litro
de 25 mM Tris pH 8.0, 175mM NaCl y 50% glicerol y se almacena a -20 ºC.

21
 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1 Diseño de construcciones

El gen de la ADNpolγ de S. cerevisiae codifica para una proteína de 1254 aminoácidos. La

ANDpolγ tiene alta homología con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli,
tanto en el dominio con actividad exonucleasa como en el dominio con actividad de
polimerasa. En comparación con el fragmento Klenow de aproximadamente 600
aminoácidos, la ADNpolγ tiene el doble de tamaño, como responsables de lo anterior se
encuentran dos extensiones en la parte amino y carboxilo terminal de cerca de 150
aminoácidos respectivamente, así como una más en el subdominio del pulgar que es
análogo al dominio de unión a tioredoxina de la T7ADNpol. Previos estudios en otras ADN
polimerasas han indicado que la presencia de extensiones en las regiones amino o
carboxilo terminal son importantes para interacciones proteína-proteína e indispensables
para la función de polimerización.

Figura 5. Diseño de construcciones a partir de la secuencia

de aminoácidos de la ADNpolγ y el fragmento Klenow

Con base a este racional se diseñaron 2 deleciones en el N-terminal, la 102 y la 124. La

deleción 124 es similar al sitio proteolítico del Fragmento Klenow y al sitio de inicio del
dominio N-terminal de la T7ADNpol.

22
8.2 Diseño de los oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se diseñaron para amplificar el gen completo y las dos deleciones de
102 y 124 aminoácidos respectivamente. Éstos se diseñaron en base a la secuencia de
nucleótidos de la ADNpolγ (ANEXO II)

Figura 6. Diseño de oligonucleótidos para amplificar el gen

de la ADNpolγ y sus deleciones en el N-terminal

Dado que deseamos amplificar una zona especifica de ADN, los oligonucleótidos son fijos,
es decir tienen un principio determinado. Lo único con lo que podemos experimentar es
con la longitud de los mismos. El oligonucleótido N-terminal completo y la deleción I tienen
una longitud de 20 nucleótidos que se aparean a la secuencia de la ADNpolγ. El
oligonucleótido N-terminal correspondiente a la deleción II tiene una longitud de 23
nucleótidos. Fue necesario darle una extensión extra de 3 nucleótidos debido a que la
secuencia de nucleotídica donde se ubica ésta es muy poco heterogénea. Los
oligonucleótidos N-terminal fueron diseñados para incorporar el sitio de restricción NheI y
el C-terminal para incorporar el sitio de restricción SacI (sitios subrayados) y una secuencia
extra de 5 nucleótidos para hacer mas eficiente el corte con las enzimas de restricción.

23
8.3 Amplificación del gen completo y de dos mutantes de deleción de la ADNpolγ de
S. cerevisiae por medio de la PCR

Para llevar a cabo nuestros experimentos se decidió amplificar el gen completo así como a
dos deleciones N-terminal de la ADNpolγ por medio de una PCR.

Figura 7. Amplificación del gen completo y de dos mutantes de

deleción de la ADNpolγ de S. cerevisiae. Línea 1) gen completo de
3762 nucleótidos, 2) Deleción Δ102 de 3 456 nucleótidos, 3) Deleción
Δ124 de 3390 nucleótidos. El marcador de peso molecular de 1 kb
(New England Biolabs) muestra que los productos de amplificación
corresponden al tamaño esperado

Entre las múltiples ADN polimerasas para llevar a cabo la amplificación del gen se decidió
utilizar la enzima Pfu (Stratagene) ya que es superior a enzimas como la TaqADNpol,
primero porque tiene mayor fidelidad y segundo porque no tiene propiedad 3’ terminal (es
decir no agrega poli-Adeninas de forma no especifica al final del templado). El producto de
la PCR se puede observar por medio de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.
En la línea uno se observa una banda de 3762 nucleótidos que corresponde al gen
completo de la ADNpolγ de S. cerevisiae, en la línea 2 se observa una banda que
corresponde a un peso aproximado de 3456 nucleótidos que corresponde a la Deleción I
(Δ 102 aminoácidos) y en la línea 3 se observa una banda que corresponde a 3390
nucleótidos que corresponde a la Deleción II (Δ 124 aminoácidos). Los pesos relativos se
pueden deducir al comparar la migración electroforética en relación a un marcador de peso
molecular de 1 kb (New England Biolabs).

24
8.4 Reacción de ligación del gen completo y las dos mutantes de deleción de la
ADNpolγ de S. cerevisiae en el vector pET28a(+)

Para llevar a cabo la ligación de genes recombinantes en vectores de expresión es

necesario el obtener ADN plasmídico de forma pura (Figura 8, línea 2), una vez obtenido el
plásmido de forma pura se procede a cortar con las dos enzimas NheI y SacI en las cuales
se desea subclonar, previamente se corrió el ADN cortado en un gel de agarosa.

Figura 8. Reacción de ligación de dos mutantes de deleción y el gen

completo de la ADNpolγ. Línea 1) plásmido pET28a cortado con
NheI y SacI, 2) plásmido pET28a superenrrollado, 3) marcador de
peso molécular de 1 kb NEB, 4) producto digerido de la deleción II,
5) producto digerido de la deleción I, 6) producto digerido del gen
completo de la ADNpolγ de S. cerevisiae

El peso molecular de un plásmido superenrrollado es relativamente menor a su peso real

(el cual corresponde al plásmido linear), esto se puede observar al comparar la migración
electroforética de las líneas 2 y 1. Los insertos a ser subclonados se cortan con las
enzimas de restricción NheI y SacI y se eliminan las enzimas por medio de una
precipitación en etanol. Una vez obtenidos tanto el inserto como el vector de forma pura
se procedió a mezclarlos en diversas concentraciones molares. Es importante el
mencionar que típicamente se necesita un concentración de aproximadamente 10 veces
mas inserto que vector para lograr una ligación eficiente. La reacción de ligación se llevó a
cabo a 16 ºC debido a que se aumenta la formación y estabilidad de enlaces de puente de
Hidrógeno débiles entre los extremos cohesivos del inserto y del vector, esto puede ser no
muy intuitivo porque la ADN ligasa tiene una actividad optima a 37 ºC, pero ¿de qué
serviría que fuera óptima si no tiene sustrato?

25
8.5 Identificación de clones positivos

Una vez llevada a cabo la reacción de ligación se procedió a llevar a cabo una
transformación, es decir pasar este ADN a una bacteria. En nuestro caso se decidió utilizar
a la bacteria DH5α que ha sido transformada por medio de un protocolo con CaCl2. El
plásmido pET28 confiere resistencia a la kanamicina, por lo cual solamente las bacterias
que hayan atrapado el plásmido lograran sobrevivir en un medio ambiente con el
antibiótico Kanamicina. Como es de esperarse obtuvimos un mayor número de colonias en
la ligación que tuvo una proporción de 1:12 de inserto versus vector.

Figura 9. Doble digestión con NheI y SacI de la mutante de deleción

II de la ADNpolγ de S. cerevisiae. Líneas 1 a la 6 representan 6
colonias (en este caso todas positivas), se observan dos bandas, una
inferior y otra superior que corresponde al plásmido pET28a de 5 369
nucleótidos digerido. La banda más intensa del marcador de peso
molecular corresponde a 3 kb y la inmediata superior a 4 kb

En las tres construcciones que obtuvimos procedimos a seleccionar colonias individuales y

crecerlas en 5 mL de medio LB suplementado con kanamicina. A partir de estos cultivos se
extrajo el ADN plasmídico y se digirió con las dos enzimas NheI y SacI, de esta doble
digestión se esperaba obtener fragmentos de entre aproximadamente 3 300 a 3 700 pares
de bases (lo anterior dependiendo de la clonación de la enzima completa o las deleciones I
o II). Como se muestra en la figura 9, fuimos totalmente exitosos en lograr las
construcciones que buscamos. En esta figura presentamos un gel de agarosa
representativa de las 6 colonias que se ensayaron cuando buscamos clones positivos para
la Deleción II.

26
8.6 Expresión recombinante de la ADN polimerasa γ en E. coli

Nosotros nos enfocamos a estudiar la expresión recombínate de la ADNpolγ completa y la

deleción 124 (ΔNterm124) utilizando dos cepas de E. coli, la cepa BL21/DE3 y la cepa
BL21/DE3 Rosseta II. Ambas cepas expresan genes que estén bajo el control del promotor
de la T7 RNA polimerasa. La cepa BL21/DE3 Rosseta II contiene un juego extra de
codones que por lo general mejora la expresión de proteínas de eucariontes en E. coli. En
experimentos preliminares observamos una mejor inducción en la cepa BL21/DE3 Rosseta
II en comparación a la BL21/DE3.

Se llevó a cabo la expresión de la proteína truncada (ΔNterm124) en la cepa E. coli

BL21/DE3 Rosseta II en un plásmido pET28a. En la figura 10 se muestra el gel SDS-PAGE
al 10%, donde la M indica el marcador de peso molecular, en el carril 1 y 2 se muestra la
proteína completa sin inducir e inducida respectivamente y de igual forma en el 3 y 4
mostramos la proteína truncada sin inducir e inducida.

Figura 10. Gel SDS-PAGE que muestra la expresión recombinante de la

ADNpolγ de Saccharomyces cerevisiae. Líneas 1 y 2 muestran la construcción
completa, líneas 3 y 4 construcción ΔNterm124. Líneas 2 y 4 después de la
inducción. La expresión de la proteína se muestra con dos asteriscos

27
 9. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO
Una de las metas de este trabajo es construir una quimera de la Taq DNA polimerasa
utilizando las propiedades de la ADN pol γ

Construcción de la quimera
Taq ADN pol / γ

Gen de la Taq Gen de la ADN

ADN polimerasa polγ

Diseño de iniciadores para los Diseño del iniciador en

dominios flanqueantes con una colita dirección 5’ - 3’ y 3’ - 5’
complementaria de el subdominio de la del subdominio del
ADN pol γ pulgar

Amplificación de los subdominios Amplificación del

flanqueantes de la Taq ADN pol subdominio del pulgar
con colitas complementarias a la
pol γ

Reacción de PCR con los amplificados

Quimera Taq ADN pol/γ

Figura 11. Metodología para la construcción de la quimera

Taq ADN pol / γ

28
Figura 12. Esquematización más detallada para la
construcción de la quimera Taq ADN pol / γ

29
Como perspectivas del trabajo se tiene que la ADN polimerasa γ es una enzima altamente
procesiva (se enlaza muy fuertemente al ácido nucleico sin necesidad de un factor de
procesividad –Tabla 1–). Es del interés del laboratorio de bioquímica estructural el
entender como la ADN polimerasa γ es altamente procesiva y evaluar si se puede conferir
esta característica a la ADN polimerasa de Thermus aquaticus o Taq polimerasa ya que es
una de las enzimas más utilizadas en la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), interesándonos mucho ya que es una herramienta básica en la investigación
biotecnológica debido a que es utilizada para amplificar de manera selectiva una región de
ADN en la que tengamos especial interés.

Pese a que es una técnica que revolucionó en el ámbito científico, como toda técnica tiene
sus límites, y uno de ellos es el tamaño del fragmento que deseamos amplificar, por lo que
desearíamos poder darle una posible solución aplicando precisamente esta misma técnica
y apoyándonos de estudios previos parecidos respecto a la procesividad de la ADN

polimerasa γ y mezclarlos con los de la Taq polimerasa para intentar construir una quimera

que satisfaga las necesidades de los pasos agigantados de la biología molecular y por
ende los de la investigación biotecnológica.

30
 10. CONCLUSIONES

El diseño in silico de los iniciadores fue clave, ya que tuvimos la fortuna que hubiera
ausencia de intrones en el gen de la ADNpolγ de S. cerevisiae por lo que la amplificación
pudo ser directa.

La expresión se llevó a cabo en las cepas BL21DE3 y BL21DE3 Rosseta II, sin embargo
se decidió que fuera en esta última posterior a la realización de un análisis, del cual se
concluyó que esta cepa al poseer un juego extra de codones mejoraría la expresión de
nuestra enzima en un procarionte.

Nos enorgullece el logro de haber expresado por primera vez en forma recombinante en E.
coli una ADN polimerasa mitocondrial, ya que sólo se tienen reportadas expresiones de
polimerasas en baculovirus y levaduras, siendo más difícil y costoso su manejo, además
no son de origen mitocondrial.

Este trabajo representa la primera vez en la cual una ADN polimerasa mitocondrial se ha
expresado de forma recombinante en E. coli. Los logros obtenidos en esta tesis son un
avance en nuestro entender de cómo funcionan las polimerasas de ácidos nucleicos
mitocondriales y esperamos que en un futuro cercano podamos utilizar este aprendizaje en
el manipular las características de alta procesividad y desplazamiento de DNA de doble
cadena en la construcción de quimeras como herramientas biotecnológicas.

31
 11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Seki, M; Masutani C; Yang, L. W; Schuffert A; Iwai S. and Bahar, I. and Wood, R. D.

High-efficiency bypass of DNA damage by human DNA polymerase Q. Embo J, 2004.
23(22): p. 4484-4494.

2. Kravchenko, J. E; Rogozin, I. B; Koonin, E. V. and Chumakov, P. M. Transcription of

mammalian messenger RNAs by a nuclear RNA polymerase of mitochondrial origin.
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3. Foury, F. Cloning and sequencing of the nuclear gene MIPi encoding the catalytic
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32
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33
ANEXO I. SUPERPOSICIÓN DE LAS SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DEL FRAGMENTO
KLENOW Y LA ADN POLIMERASA γ DE S. CEREVISIAE
ANEXO II. DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS DE LAS CONSTRUCCIONES N-TERMINAL
DE LA ADN POLIMERASA γ DE S. CEREVISIAE.

A) DISEÑO BASADO EN LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS

Completa
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M T K L M V R S E C M L R M V R R R P L
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I N P V G I Q Y L G E S L Q R Q V F G S
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Deleción I
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L P P L Q G R S L D E H F Q K I G R F N
Deleción II
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Oligo C-terminal
taaagatctctcatgatc
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L V E L E R D I T I S R E Y -
B) LISTA DE OLIGOS

N-terminal
Completa
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Deleción I
5’ ggaag gctagc ctacaaggcaggtcgctaga 3’

Deleción II
5’ ggaag gctagc cgaccggcggaatggctgcggaag 3’

C-terminal
Constante
5’ ggaag aagctt ctagtactctctagaaat 3’
ANEXO III. SITIO DE CORTE DE LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN NheI (catatg) EN
NUESTRA CONSTRUCCIÓN (DELECIÓN II - Δ124)

Completa

atgacgaaattgatggttagatctgaatgcatgctgcgaatggtgcggcggcggccgctg
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Deleción I
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Deleción II
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Oligo C-terminal
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ANEXO IV. MAPA DEL VECTOR pET28a(+)