LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

DOCENTE: Dra. Celia Bowen Fernández

1. DATOS INFORMATIVOS

MATERIA O MÓDULO: LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PRÁCTICAS

CARRERA: MEDICINA
NIVEL: CUARTO
N° CRÉDITOS: 5
-CRÉDITOS TEORÍA: 4
-CRÉDITOS PRÁCTICA: 1
DATOS DEL PROFESOR:
Nombre: Celia Annabel Bowen Fernández
Grado Académico o Título Profesional: Dra. Bioquímica y Farmacia opción Bioq. Clínica
Breve indicación de la línea de actividad académica: Docencia en diferentes en diferentes ramas de la
patología clínica (Laboratorio clínico y Microbiología), coordinadora de los laboratorios en el área de
Destrezas Clínico Quirúrgicas
Indicación de horario de atención a estudiantes: Martes, Miércoles y Viernes 12:00 a 13.00 horas
Correo Electrónico: bowencelia@yahoo.es
Teléfono: 084678618

PROFESOR:
Grado académico o título profesional: Dra. Bioquímica y Farmacia opción: Bioq. Clínica/ Diplomado
Superior en Pedagogías Innovadoras

2. DESCRIPCIÓN DE LA MATERIA:
La unidad tiene como propósito facilitar el aprendizaje de los principales métodos de diagnóstico
microbiológico, en lo que se refiere a las enfermedades infecciosas humanas: medios de cultivo,
tinciones, pruebas inmunológicas y de microscopía y relacionarlos con los objetivos de la teoría
de Microbiología.
3. OBJETIVO GENERAL:
Introducir al estudiante de medicina en los métodos de identificación de microorganismos patógenos
responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
4.1. ACTITUDINALES:
a. Cumplir las normativas de bioseguridad
b. Escoger las pruebas de laboratorio adecuadas de acuerdo al tipo de infección
c. Compartir conocimientos y experiencias durante el proceso de aprendizaje
4.2. COGNITIVOS:
a. Identificar los diferentes microorganismos como bacterias, parásitos, hongos y virus
causantes de enfermedades
b. Conocer los principales métodos de análisis inmunológico
c. Revisar los principales métodos, medios de cultivos y coloraciones empleados para la
identificación de microorganismos infecciosos
4.3. PROCEDIMENTALES:
a. Ejecutar correctamente la toma y recogida de muestras para análisis microbiológicos
b. Reconocer a través del microscopio, los principales microorganismos patógenos a través de
tinciones y montajes básicos
c. Realizar siembras en los medios de cultivos comunes
d. Observar las características de crecimiento y multiplicación de los microorganismos

5. CONTENIDOS

PARALELO 1,2,3,4

1. Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología:

Primera semana
2. Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa:

1
 Segunda semana
3. Medios de cultivo, requerimientos nutricionales, clasificación y técnicas de
siembra; utilización de asas y campanas microbiológicas:
Tercera Semana
4. Técnica para realización del antibiograma: medios apropiados y
antimicrobianos:
Cuarta semana
5. Estudio microbiológico del esputo: coloraciones, siembras e interpretación.
Quinta semana
6. Identificación de cocos gram positivos: estafilococos y estreptococos.
Streptococos del grupo A (Bacitracina, Optoquina, Catalasa, coagulasa):
Sexta semana
PRIMERA EVALUACIÓN: Séptima semana
7. Urocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra, siembra, identificación
e interpretación:
Octava semana
8. Identificación bioquímica y serológica de bacilos gram negativos; grupo
bacterianos de importancia médica
Novena semana
9. Coproparasitario, identificación microscópica de parásitos
Décima semana
10. Exámen de Heces-Coprocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra,
siembra, identificación e interpretación. Coproparasitario, identificación
microscópica de parásitos
Décima primera semana
11. Infecciones de transmisión sexual: Principales microorganismos que la producen,
diagnóstico por laboratorio
Décima segunda semana
12. Micosis.Toma de muestras y observación de hongos: montajes y preparaciones
Décima tercera semana
13. Técnicas básicas de inmunología: aglutinación, floculación, micro-ELISA
Décima cuarta semana
14. Investigación de hematozoario: frotis, tinción e identificación microscópica
Décima quinta semana
SEGUNDA EVALUACIÓN: Décima sexta semana
TERCERA EVALUACIÓN (PRÁCTICA): Décima séptima semana
6. METODOLOGÍA, RECURSOS:
6.1. Métodos didácticos
a. Charla de fundamentación teórica
b. Explicación práctica y observación
c. Realización de prácticas de pruebas de laboratorio
d. Lectura e interpretación de resultados
6.2. Recursos
a. Uso del manual de prácticas de Laboratorio Microbiología
b. Uso de Atlas de Microbiología
c. Equipos de Laboratorio de Microbiología (Microscopio, incubadora,
esterelizadora, etc.)
d. Medios de cultivo
e. Reactivos varios
f. Muestras biológicas varias
7. EVALUACIÓN:

CRONOGRAMA DE EVALUACIONES:
a. 1ra. Evaluación: Séptima semana
b. 2da. Evaluación: Décima sexta semana
c. 3era. Evaluación: Décima séptima semana
SISTEMA DE CALIFICACIÓN:
EVALUACIONES PARCIALES PRÁCTICA Y TEÓRICA: 30 puntos
10 puntos de cada prueba parcial (dos parciales) más 10 puntos entre examen práctico al
microscopio (6 puntos) y trabajos (consultas, reportes, otros) (4 puntos)

2
 Nota final: 20 puntos
Primera parte: 10 puntos con un examen final del Área de Prácticas en la semana 18 de la
rotación
Segunda parte (examen integrador de la Macroárea de Morfofunción): semana 18
de la rotación

8. BIBLIOGRAFÍA:
TEXTOS DE REFERENCIA:
 Forbes-Sahm-Weissfeld, Diagnóstico Microbiológico (Bailey & Scott), 11 a edición,
Editorial Médica Panamericana, Argentina, 2004
 Ángel M., G. y M. Ángel R., Interpretación Clínica del Laboratorio, 6ª. edición, Editorial
Médica Panamericana, Bogotá, 2.001
 Álvarez, M. V., et al, Manual de Técnicas en Microbiología Clínica, Asociación Española de
Farmacéuticos Analíticos, Salamanca, 1.995
 Henry, J. B., Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio, 9ª. Edición, Editorial
Salvat Médica, México, 1.993
 OPS/OMS, Manual de Técnicas Básicas en Bacteriología Clínica, 1.995
TEXTOS RECOMENDADOS:
 Atlas y apuntes de Microbiología de la Dra. Celia Bowen disponibles en la página web
ftp.puce.edu.ec
 Francisco Javier Pérez Pazmiño-Elena Granda Moreno, Manual de Prácticas de Laboratorio
de Microbiología, para estudiantes de Medicina

PRÁCTICA No. 1
TEMA: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología
EL MECHERO DE BUNSEN
La llama más utilizada en el laboratorio es la producida por la combustión de un gas
(propano, butano o gas ciudad), con el oxígeno del aire.
La combustión completa (con exceso de oxígeno) produce agua y dióxido de carbono,
una llama poco luminosa y de gran poder calorífico.
La combustión incompleta produce, además de dióxido de carbono y agua, carbono,
nonóxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder
calorífico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partículas de
carbono que se producen).
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir
diversos tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos.

Esencialmente constan de un tubo, llamado cañón, a cuya base llega la entrada de gas a
traves de un pequeño orificio (chiclé).
En esta zona existen unas aberturas, regulables mediante una anilla (virola), que
permiten la entrada del aire al cañón.
La expansión del gas a través del pequeño orificio succiona el aire exterior
produciendose, de este modo, una mezcla gas-oxígeno que asciende por el cañón hasta
la boca del mismo que es donde se produce la llama.

3
Sosteniendo con unas pinzas una cápsula de porcelana en la parte superior de la llama
producida con la entrada de aire cerrada, se observa un ennegrecimiento producido por
el depósito de carbón, lo que indica que la combustión es incompleta.
Sosteniendo con unas pinzas una cápsula de porcelana en la parte superior de la llama
producida con la entrada de aire abierta, se observa el depósito de pequeñas gotitas de
agua, lo que indica la combustión completa del gas a dióxido de carbono y agua.

Si el mechero arde con la entrada de aire cerrada, la combustión es incompleta y la

llama presenta un color anaranjado debido a la presencia de partículas incandescentes
de carbono.
Al abrir el paso de aire, la combustión es completa y en la llama se aprecian dos zonas
claramente separadas por un cono azul pálido.
En el exterior del cono la combustión es completa, existe un exceso de oxígeno y se
producen altas temperaturas (zona oxidante).
En el interior del cono los gases todavía no se han inflamado y en el cono mismo hay
zonas donde la combustión no es todavía completa y existen gases no oxidados a
dióxido de carbono y agua por lo que se tiene una zona reductora de la llama

ENCENDIDO DEL MECHERO

Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de paso del gas y
acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del cañón. Regular la llave hasta
obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire. No
abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.

Para obtener mayor temperatura, abrir más el flujo de gas y la entrada de aire.
EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.

4
 PRÁCTICA No. 2

TEMA: Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa (ver pág. 8 del manual de

prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de
práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

PRÁCTICA No. 3

TEMA: Medios de cultivo (ver pág. 13 del manual de prácticas Lab.

Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica
correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

Metodología para realizar un cultivo bacteriano:

Antes de realizar un cultivo es necesario contar con todo el material debidamente
esterilizado, además de tener la precaución de trabajar junto a una fuente de calor que
impida tanto un contagio de la persona que procesa la muestra, así como una posible
contaminación del cultivo donde se va a trabajar.

Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego

para que se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a
estudiar; abrir la caja petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la
muestra se efectúa un pequeño inóculo en el borde, de allí se parte la primera
estriación; luego de la esquina de una de las estrías de la primera estriación se realiza
la segunda estriación y finalmente de la esquina de una de las estrías de la segunda
estriación, se realiza la tercera estriación, procurando hacer las estrías mucho más
separadas de las dos primeras, con la finalidad de separar las colonias que sean
sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora, colocándola de lado contrario al
que se sembró y se la deja en las condiciones apropiadas para el crecimiento de cada
bacteria (temperatura, atmósfera, potencial rédox, tiempo, etc.)

5
6
 PRÁCTICA No. 4

TEMA: Técnica para la realización del antibiograma (ver pág. 23 del manual de
prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de
práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

DISCOS DE ANTIBIÓTICOS USADOS PARA GÉRMENES GRAM

POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE
AMBULATORI
GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS
Oxacilina (ox) Ampicilina (am)
Eritromicina (E) Cefuroxima (cxm)
Clindamicina (cc) Ampicilina + sulbactam (sam)
Cefoxitin (fox) Gentamicina (gm)
Sulfas (sxt) Norfloxacina (nor)
Ciprofloxacina (cip) Nitrofurantoína (fm)
Vancomicina (va) Sulfas (sxt)

PRÁCTICA No. 5

1. TEMA: ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DEL ESPUTO: Coloraciones,

siembras e interpretación (ver pág. 26 del manual de prácticas Lab.
Microbiología del Dr. F. Pérez)

PRÁCTICA No. 6

2. TEMA: IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS:

7
 Estafilococos y estreptococos (ver pág. 44 del manual de prácticas Lab.
Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica
correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

Catalasa: la catalasa es una enzimaque descompone el peróxido de hidrógeno

(H2O2) en oxígeno y agua.El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los
productos finales del metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de
carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células
bacterianas.
2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy
comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de
estafilococos (positivos).

Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteíca de composición química

desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible en un
sistema analítico adecuado. En el laboratorio, la prueba de la coagulasa se
utiliza más comúnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de
otros estafilococos y micrococos.

La coagulasa se halla en 2 formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales

posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas separadas:

Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia

semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos.
Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en
partes iguales con una pequeña cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se
forma un coagulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de
la coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina.

Bacitracina:Las pruebas presuntivas en la identificación del EbHGA

(Estreptococo beta hemolítico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e
inhibición del crecimiento en una placa de agar sangre, y que tienen la mayor
parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto con discos que contienen dosis
bajas (0.04U) de bacitracina.

Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae

(sensibles) y otras especies de estreptococos a hemolíticos (resistentes). La
sensibilidad a la optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana
celular bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de etilhidrocupreína.

2. PARTE EXPERIMENTAL :
2.1.Técnica o procedimiento: Estudio microbiológico del esputo
Nota: Se utilizan tres medios de cultivo para el esputo que son: agar Macconkey,
agar sangre y caldo de tioglicolato. En la práctica haremos con agar sangre y caldo
de tioglicolato
a. Siembra en agar sangre (para identificación de bacterias gram-negativas y
gram-positivas):

8
  Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y esperamos a que adquiera
la temperatura ambiente
 Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras
de esputo cerca del mismo
 Tomamos un cotonete de algodón estéril y tomamos un poco de muestra
de esputo en una lado del agar, luego tomamos el asa lo esterelizamos
en el mechero y luego de enfriar lo pasamos por el agar, justo en el sitio
por donde paso el cotonete, estriamos en tres direcciones alrededor de la
caja
 Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35º- 37ºC y
dejamos por 24 a 48 horas en la misma
 Una vez transcurrido el tiempo de incubación se realiza la lectura de la
siembra y la interpretación de la misma
b.Siembra en caldo de tioglicolato
Con el cotonete de algodón que se tomó la muestra de esputo y se sembró en agar
sangre, introducir un poco de la misma en el caldo e incubar de 35° a 37°C durante
48 horas.

Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento
microbiano. Un tubo con medio semisólido contiene tioglicolato para reducir el
potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del
tubo.

Si el microorganismo es aerobio estricto crecerá en la parte de arriba del tubo, si es

anaerobio estricto no crecerá en la parte más alta del tubo y si es anaerobio
facultativo crecerá por todo el medio.

c. Observación de placas coloreadascon coloración gram de muestra de esputo

Mirar al microscopio con el lente de gran aumento (100 x) y con aceite de
inmersión, las colonias de Stafilococcus, de Streptecoccus, de otras bacterias y
otros elementos patógenos presentes anotar el color y las formas que presentan.

2.2. Técnica o procedimiento: Identificación de cocos gram positivos

2.2.1. Catalasa
En una placa portaobjetos añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%
(diluir la solución al 30% con agua destilada), transferir células del centro de una
colonia bien aislada y mezclar. La rápida aparición y producción sostenida de
burbujas de gas o efervescencia indica una reacción positiva.

2.2.2.Coagulasa
Prueba en tubos (coagulasa libre):
1.- colocar asépticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de
un tubo estéril.
3.- mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
4.- colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formación de un
coagulo visible.

La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible

dentro del tubo.

9
 2.2.3. Prueba de la Bacitracina
Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en forma
continua la cepa de estreptococo beta hemolítico, con una pinza estéril se coloca el
disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de agar sangre es
incubada a 35-37° C durante toda la noche. Los resultados son cualitativos y es
positiva para estreptococo beta hemolítico del grupo A si se encuentra cualquier
halo de inhibición alrededor del disco.

2.2.4. Prueba de la optoquina

Método: se toma una suspensión de colonias puras en caldo Mueller Hinton o

tioglicolato y con un hisopo se estría una placa de agar sangre de carnero al 5 %.
Sobre la estría se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al
5 % ( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35° C.
Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se considera
como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm).
Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de
halos intermedios deben resolverse por acumulación de pruebas a favor o en
contra.

3. MATERIALES Y REACTIVOS (este literal no necesita ser memorizado):

Materiales Reactivos
Asas microbiológicas Placas coloreadas por
método de gram
Incubadora a temperatura Agar sangre
35º-37º C
Mechero de Bunsen Caldo de tioglicolato
Cajas petri Muestras de esputo
Hisopos estériles Peróxido de hidrógeno
Microscopio Plasma de conejo
Placas portaojetos Discos de bacitracina
Tubos de ensayo
Palillos de dientes

PRÁCTICA No. 7

TEMA: UROCULTIVOS (ver pág. 29 del manual de prácticas Lab.

Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica
correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina para EMO

a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la

farmacia uno estéril apropiado para la recolección de orina.
b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la mañana.
c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabón, sin dejar residuos. Esto es
especialmente importante en la mujer que debe lavarse el área entre los labios
de la vagina y evitar la contaminación de la muestra con crema, antisépticos y
secreciones vaginales. Los hombres y niños deben limpiarse la cabeza del pene

10
 d. Deje escapar la porción inicial de la micción al inodoro, a continuación
recolecte en el frasco la porción media (10 ml) y descarte la porción final de la
micción nuevamente en el inodoro.
e. Tape bien el frasco y entréguelo rápidamente al Laboratorio (máximo dos horas
luego de tomar la muestra).
f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual

2. Método para el análisis de orina macroscópico y químico:

a. Después de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea

posible. Antes del análisis las muestras de orina deben estar a la temperatura
ambiente
b. Realizar la homogenización de la orina
c. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio
(bien mezclada y no agitada)
d. Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 ml
e. Determinar el color, aspecto (nitidez)
f. Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormales de espuma
coloreada
g. Sumergir brevemente la tira reactiva, no más de un segundo (evitar tocarla con
los dedos, ya sea antes o después de sumergirla)
h. Eliminar el exceso de orina en la tira,: limpiar el borde de la misma con el
reborde del tubo o con papel secante
i. No permitir que los reactivos de la tira se junten
j. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajo
k. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test
químico
l. Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena
iluminación
m. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada
prueba con la tira reactiva

1.1.Parámetros que se observan en el examen macroscópico :

En el examen macroscópico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente,

ligeramente turbia, turbia, espesa, opaca y el color de la orina que puede ser amarilla
pálida, amarilla oscura, ámbar, roja, verde, azul entre otros.

1.2.Parámetros que se observan en el examen químico:

 Densidad (ó gravedad específica): Registra la concentracuión iónica de la

orina (es decir, qué tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la
liberación de protones por un formador de complejos en presencia de
cationes. Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de
azul hacia amarillo, pasando por verde azulado
 pH: Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH más
frecuentes en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test
es específico para la detección de iones hidronio, siendo el valor pH el
logaritmo decimal negativo de la concentración de iones hidronio. El papel
reactivo contiene los indicadores rojo de metilo, fenolftaleína y azul de

11
 bromotimol.
 Leucocitos: Comprueba la actividad esterásica de granulocitos. Esta enzimas
desdoblan un éster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de
diazonio formando un colorante violeta. se detectan leucocitos intacto y
también los lisados (indicio de IVU)
 Nitrito: Los agentes patógenos más frecuentemente causantes de infecciones
de las vías urinarias, E. coli y la mayoría de los gérmenes patógenos
urinarios, transforman el nitrato absorbido con la alimentación en nitrito. Este
es detectado por una coloración del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo
se basa en el principio de la prueba de Griess y es específico para el nitrito.
(indicio de IVU)
 Proteínas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de
pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albúmina.
 Glucosa: La detección de glucosa se efectúa según el método específico de la
glucosa-oxidasa-peroxidasa.
 Cuerpos cetónicos: La detección se realiza en el principio de la prueba de
legal y reacciona más intensamente al ácido acetilacético que a la acetona.
Las cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con
inanición y diabetes.
 Urobilinógeno: Es un producto de degradación de la bilirrubina. El test se
basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilinógeno, casi
instantáneamente un colorante azóico rojo
 Bilirrubina: En la orina es un producto de degradación de la hemoglobina.
La detección se basa en la copulación de una sal de diazonio con bilirrubina
para formar un colorante azoico. Incluso los más leves matices rosa ya deben
ser considerados como positivos.
 Hemoglobina: Es un indicio de hemólisis. La mioglobina cataliza la
oxidación del indicador por el hidroperóxido orgánico contenido en el papel
reactivo. Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva
amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina así
como los eritrocitos hemolizados o la mioglobina son indicados por una
coloración verde homogénea de la zona reactiva.

2. Método para realizar el examen microscópico del sedimento urinario

a. Una vez realizado el examen microscópico y químico de la orina, se la
centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente
homogenizada
b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para
resuspender el sedimento puede variar según el sistema estandarizado que
se use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado.
c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y
colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un
cubreobjetos. Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos.
d. Observar al microscopio con objetivos de pequeño y gran aumento. Para
detectar algunas entidades del sedimento con un índice bajo de refracción
será necesaria una luz amortiguada o una iluminación de contraste de fase.
El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina. Progresar
de manera sistemática a lo largo de toda la placa, teniendo cuidado de
examinar los bordes en busca de cilindros.

12
 e. Recuento del número de cilindros por lo menos en 10 campos de pequeño
aumento (10x) y anotar en el informe el número de cilindros por campo.
Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a 2, 2 a 5, 5 a 10, etc. Usar
el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se
apreciarán si se utiliza microscopio de contraste de fase.
f. Identificación y recuento de los eritrocitos, leucocitos y células epiteliales
renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento
por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como células por
campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable.
g. Reportar:
h. Las células epiteliales (bajas) y altas si están presentes en gran número o
como fragmentos (células transicionales)
i. Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a
pequeño aumento puede expresarse por lo menos como 2 +.
j. Los cristales se cuantifican bajo pequeño aumento. La presencia de cristales
anormales debe confirmarse químicamentey correlacionarse con la historia
del paciente
k. Grandes cantidades de moco

OBSERVACIÓN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo
nivel ubicado en el internet cuya página es ftp.puce.edu.ec

2.1.Elementos que se observan en el examen microscópico:

 Las bacterias y otros microorganismos (normalmente no están presentes)

 Cilindros urinarios
 Cristales
 Grasa
 Moco
 Glóbulos rojos (un indicio de daño en los túbulos)
 Células tubulares renales
 Células epiteliales de transición
 Glóbulos blancos (un indicio de infección del tracto urinario)

3. PARTE EXPERIMENTAL PARA REALIZAR UN UROCULTIVO:

3.1. Siembra en agar Mc conkey (para identificación de bacilos Gram
negativo):
3.1.1. Sacamos el agar Mc conkey de la refrigeradora y esperamos a que adquiera
la temperatura ambiente
3.1.2. Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras de
orina cerca del mismo
3.1.3. Tomamos el asa calibrada la esterelizamos en el mechero y luego de enfriar
metemos en la muestra de orina retirando los excesos en el borde del envase
que contiene la orina
3.1.4. Tomamos el agar Mc conkey y realizamos la siembra estriando en cuatro
direcciones alrededor de la caja (colocar el estudiante el gráfico de forma
de estriado en el informe)
3.1.5. Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35º- 37ºC y

13
 dejamos por 24 horas en la misma
3.1.6. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se realiza la lectura de la
siembra y la interpretación de la misma

3.2. Siembra en agar sangre (para cuantificación de colonias bacterianas

U.F.C./ml)

3.2.1. Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y realizamos el mismo

procemiento anterior hasta el literal 4.1.6, variando la técnica de
estriado
3.2.2. Para el contaje de las colonias que crecieron, contamos las mismas
como U.F.C. (unidad formadora de colonias) en uno de los cuatro
cuadrantes de la caja de agar sangre, multiplicamos por cuatro y
obtenemos el U.F.C contenido en 0.001 ml que nos proporcionó el asa
calibrada a ese volumen, luego efectuamos una regla de tres, ejemplo:
350 U.F.C 0.001 ml
X 1 ml
X= 350.000 U.F.C./ml
3.2.3. El resultado obtenido se lo compara con los rangos de valores
normales siguientes:
 Menos de 10.000 U:F:C/ml se considera contaminación
 Entre 10.000 y 100.000 U.F.C./ml se considera sospecha de
infección
 Mayor a 100.000 U.f.c./ml se considera infección

B. Materiales y reactivos:

Materiales Reactivos
Asas calibradas 0.001 ml Agar Mc conkey
Incubadora a temperatura 35º-37º C Agar sangre
Mechero de Bunsen Muestras de orina
Cajas petri

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 PRÁCTICA No. 8

TEMA: IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACILOS GRAM

NEGATIVOS (mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado
en la página ftp.puce.edu.ec)

A. Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de

cultivo para reacciones bioquímicas.
B. Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos
gramnegativos selecionadas como sospechosas a los medios para bioquímicas
 En los medios inclinados sembrar por estrias
 En los medios verticales sembrar por picadura
 En los medios líquidos sembrar por emulsión
C. Etiquetar con los datos correspondientes. Llevar a la incubadora por 24 horas.
D. Retirar las series de tubos con las reacciones bioquímicas.
E. Interpretar las reacciones bioquímicas en cada uno de los tubos, de la siguiente
manera.

1. ENSAYO DEL ROJO DE METILO

I. Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un
microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia
Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de
Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen
ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el
camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador
del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil
para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo
metilo negativo).

II. Procedimiento
A. Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.

III. Resultados
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.

2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
I. Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido
pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para
formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan
el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales
acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-
Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e
KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del

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 -naftol antes del agregado de KOH.

II. Procedimiento
A. Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP
B. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas
C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tubo
-naftol
E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH
F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos
G. Observar la formación de un color rosado a rojo

III. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color

3. PRUEBA DE LA UREA
I. Principio
La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa
da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la
capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del
medio. Es una actividad característica de especies de Proteus y se usa para
diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-
); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)

II. Procedimiento
A) Con un asa estéril se toma abundante material y se inocula por punción
B) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan
diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos
miembros de la
familia, registrando los resultados día por día.
III. Resultados
Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.

4. PRUEBA DEL SIM (H2S, indol, motilidad)

 Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el
Triptófano a indol.
 Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados dando
como resultado un color negro
 Determinar si la bacteria es móvil mediante la difuminación de la misma hacia
los lados, de lo contrario, la bacteria sólo crece en la línea de inoculación

I. Principio del Indol

El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con
un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para
combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo
constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como

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indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es
especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para
diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-).

II. Procedimiento
1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que
contiene triptofano.
2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo.
4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el
reactivo.
6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

III. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo,
segundos después
de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

5. AGAR KLIGLER
I.Principio
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estría permanecerá ácida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los
organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o
producirán productos alcalinos y el medio permanecerá rojo. La producción de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.

II. Resultados
A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, lactosa
(E. coli)
B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente
(Shigella spp.)
C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas
aeruginosa)
D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp)
E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.)

6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)

I. Principio
La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. La
decarboxilación de lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilación es
una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral
estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce
una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La

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acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso
de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje
del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella
(+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-)
y Enterobacter agglomerans (-)

II. Procedimiento
A. Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los
aminoácidos
B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.
C. Incubar a 37ºC
D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por
día

III. Resultados
Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador
de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)

7. PRUEBA DEL CITRATO

I. Principio
Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato)
usado para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el
citrato como única fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un
medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento
y la alcalinización del medio Este aumento de pH se visualiza con el indicador
azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el
medio de cultivo se vuelve azul y cuando es negativo se mantiene verde.
II. Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24
horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se
pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del
inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa
crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al
azul.
III. Resultados
(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli

8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un
ácido carboxílico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen ácido
fenilpirúvico que con Fe3Cl en solución ácida produce un color verdoso ( resultado
positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).

9. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, para ver si se utiliza al malonato como fuente de
carbono.

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 PRÁCTICA No. 9

TEMA: HECES FECALES. EXAMEN COPROPARASITARIO

(ver pág. 33-41 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y
mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página
ftp.puce.edu.ec)

1. MARCO TEÓRICO:

1.1.Parásitos
NEMATODOS: Gusanos redondos
Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm,
presenta una célula rodeada por tres capas, producen una patología de dolor de
estómago y desnutrición.

Tricocéfalo: El huevo mide de 50-55 x 22-25 mm Tiene la forma de balón de

fútbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal
ocasional.

Uncinarias: Tienen una forma elíptica, están cubiertas de una membrana lisa,
transparente y fina, mide de 60 - 40 x mm producen anemia.

Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Produce diarrea, vómito,

desnutrición.

Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara convexa
y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa hialina y
mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 mm. Produce prurito en la región perianal,
insomnio, cambios de conducta.

CESTODOS: Gusanos planos

Taenia: Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa,
amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y encierra un
embrión de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos.

Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 mm tiene una membrana

interna y una externa, también puede causar trastornos nerviosos.

PROTOZOARIOS: Amebas

Entamoeba histolítica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con

cuatro núcleos. Pueden causar lesión de la mucosa intestinal.

Entamoeba coli: Son quistes más grandes que los de histolítica, tiene más de
cuatro núcleos. Es considerada como no patógena.

Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 mm presentan de uno

a cuatro núcleos.

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Iodamoeba bütschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de
yodo, no es una ameba patógena.

Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simétricamente lateral, con un

extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro núcleos y dos cuerpos
parabasales, produce una diarrea amarillenta y vómito.

TREMATODOS : Forma de hoja plana

Fasciola hepática: Daño en hígado . quistes

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 1.2.Rotavirus:

Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en

niños de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada año en
los países en desarrollo y son causa de 873.000 fallecimientos anuales .

Tres proteínas estructurales de rotavirus tienen gran importancia para clasificar a

estos virus según su antigenicidad. La proteína VP6, que constituye la cápsida
interna del virión, es responsable de la existencia de siete serogrupos (A-G). Las
infecciones humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y,
en menor medida, o con otras características epidemiológicas, por los grupos B y
C. El resto de grupos de rotavirus producen infecciones en los animales, aun
cuando los del A infectan también algunas especies animales, además del hombre.
Los rotavirus humanos del grupo A se subdividen en dos subgrupos (I y II) en
función de la especificidad de la VP6.

PRÁCTICA No. 10

TEMA: HECES FECALES. Coprocultivo. Aislamiento de enterobacterias (ver

pág. 42-43 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar
atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página
ftp.puce.edu.ec)

AISLAMIENTO.
1. Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de
tetrationato. Inocular con asa por emulsión.
2. De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de
caldo nutritivo.
3. Etiquetar con los datos respectivos
4. Levar a la incubadora a 37ºC durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla, de
tal manera que se mantengan en posición vertical para evitar que el líquido se
derrame.

23
 5. A las 24 horas retirar los tubos de la incubadora.
6. Disponer sobre la mesa el medio selectivo (agar entérico Hektoen) para
resembrar el cultivo del caldo de tetrationato.
7. Resembrar en cada placa el inóculo correspondiente
8. Tapar las placas. Etiquetar con los datos correspondientes
9. Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posición invertida. Mantenerlas
durante 24 horas.
10. Al día siguiente:
11. Retirar las placas de la incubadora.
12. Efectuar análisis macroscópico de cada una para valoración de la prueba
presuntiva
13. Efectuar análisis microscópico por el método de Gram de cada una de las
placas para confirmación de la morfología de los bacilos entéricos
gramnegativos

PRÁCTICA No. 11

TEMA: INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL (ver pág. 48 del manual

de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de
práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

PRÁCTICA No. 12

TEMA: MICOSIS (ver pág. 52 del manual de prácticas Lab. Microbiología del
Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en
la página ftp.puce.edu.ec)

PRÁCTICA No. 13

TEMA: TÉCNICAS BÁSICAS DE INMUNOLOGÍA (ver pág. 55 del manual de

prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de
práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

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Durante la práctica los estudiantes se realizarán voluntariamente pruebas de ASTO,
VIH, y VDRL para poder observar la reacción Ag-Ac. Estas pruebas tienen los
siguientes fundamentos:

VIH:
La prueba VIH 1&2 es un inmunoensayo rápido de un solo uso basasdo en
inmunocromatografía. Emplea reactivos únicos para la detección rápida y segura de
anicuerpos a VIH1 y VIH2 en suero y plasma humano sin instrumental.

Las proteínas recombinantes que representan las regiones inmunodominantes de las

proteínas envoltura y gag de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizadas en la región de Prueba
de la tira de nitrocelulosa y un agente bioquímico que reconoce anticuerpos humanos
es dispersado en la región de Control de la tira. Las proteínas de VIH-1 y VIH-2,
unidas a oro coloidal, son impreganadas por debajo de la región de Prueba del
dispositivo. Una banda estrecha de la membrana de nitrocelulosa es también
sensibilizada como región de control.

Los complejos de anticuerpos de proteína VIH-oro coloidal se desplazan por

cromatografía a lo largo de la membrana nitrocelulosa hacia las regiones de pruebas.
Se indica una reacción positiva mediante la presencia de dos bandas de color (ver en la
práctica).

ASTO:
Es una prueba rápida por el método de aglutinación utilizando partículas de látex para
la detección de anticuerpos anti-estreptolisina del grupo O (ASO) en suero humano.

Los anticuerpos ASO son encontrados en el suero del paciente en respuesta a una
infección con Streptococo hemolítico del grupo A, C o G (ver el método de
aglutinación en el atlas).

PRÁCTICA No. 14

TEMA: INVESTIGACIÓN DE HEMATOZOARIOS (ver pág. 57 del manual de

prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de
práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

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