Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación
espectrofotométrica de biomoléculas
Buitrago S. S. Nicolas, Rincón B. N. Andrea.
Laboratorio de Bioquímica, Edifico C, C-207, Universidad de la Sabana.
Abstract Los Polifenoles son micronutrientes,
que abundan en nuestra alimentación diaria, se han
hallado más de 80 000 Polifenoles, que se
encuentran en alimentos como el té, vino,
chocolate, frutas, vegetales, etc. (1) Por
consecuente, nuestro objetivo principal de este
laboratorio era determinar la cantidad de
polifenoles que se hallaban es una muestra de
hierbabuena. Para esto, fue necesario cortar la
hierbabuena en trozos muy pequeños, y se debía
agregar una cantidad específica de hierbabuena (5
g) con 20 mL en tubos falcon de 50 mL, protegidos
de la luz, esto por duplicado, ya que uno se
realizaría mediante agitación vortex y otro
mediante ultrasonido. De este procedimiento se
esperaba obtener según literatura una cantidad de
210,11 µg eq.AG/mL de fenoles totales. (3) Por otra
parte, se tenía que encontrar el % de humedad de
la hierbabuena, para esto, se tomó una cantidad
específica de la muestra de hierbabuena que fue
depositada en una estufa a 60ºC durante un día,
para después dejarle enfriar en un desecador. De
esto se esperaba obtener según literatura un % de
humedad de 82,37% (4) …
Palabras Clave: Ley de Lambert, Ley de beer,
Transmitancia, Absorbancia, Curva de calibrado,
Espectroscopia, Región Ultra-violeta, Polifenoles.
Introducción
En la vida cotidiana encontramos una gran
variedad de productos alimenticios, en los cuales
dentro de su composición química localizamos los
polifenoles, estos polifenoles son fitoquímicos, es
decir, compuestos que abundan en los alimentos
vegetales naturales con propiedades antioxidantes.
Se han identificado más de 80 000 polifenoles, que
se encuentran en alimentos como el té, vino,
chocolate, frutas, vegetales, por nombrar algunos.
Los polifenoles representan un papel importante
para mantener su salud y bienestar. Como grupo,
los antioxidantes ayudan a proteger las células del
cuerpo del daño de los radicales libres, por lo que
controlan la rapidez con la que envejece. (1) El Dr.
Paul Kroon afirma que en el cuerpo humano estos
compuestos fermentan activados por las bacterias
que habitan en nuestro sistema digestivo, creando
metabolitos que pueden ser beneficiosos, por
ejemplo, por su actividad antioxidante. Las
investigaciones indican que los polifenoles
pueden tener capacidad antioxidante con
potenciales beneficios para la salud. Podrían
reducir el riesgo de contraer enfermedades
cardiovasculares. (5) Los polifenoles son
generalmente subdivididos en taninos
hidrolizables, que son ésteres de ácido gálico de
glucosa y otros azúcares; y fenilpropanoides,
como la lignina, flavonoides y taninos
condensados. (6) Finalmente según estudios
realizados por la Dra. Sara Arranz del Consejo
Superior de Investigaciones Científicas, donde ha
puesto en manifiesto que en las frutas existe una
fracción de polifenoles «no extraíbles» (PFNE)
con propiedades bioactivas que no eran
cuantificadas durante los análisis de contenidos
sobre la base de polifenoles «extraíbles» (PFE),
superando los primeros hasta en cinco veces las
concentraciones obtenidas por las mediciones
habituales de los PFE. Se informaron valores de
112−126 mg/100 g de fruta fresca para los PFNE,
frente a 18,8−28 mg/100 g de fruta fresca para los
PFE. (7) Por esta razón mencionada anteriormente,
y por la necesidad de lograr conocer la cantidad
real de polifenoles que encontramos en las frutas
y vegetales, fue que se hizo este laboratorio, donde
gracias a avances tecnológicos, estos se pueden
cuantificar mediante métodos como lo es la
espectroscopia, esta una técnica instrumental
ampliamente utilizada por los físicos y químicos
para poder determinar la composición cualitativa
y cuantitativa de una muestra, mediante la
utilización de patrones o espectros conocidos de
otras muestras. El análisis espectral permite
detectar la absorción o emisión de radiación
electromagnética de ciertas energías, y relacionar
estas energías con los niveles de energía
implicados en una transición cuántica. (8) o como
la ley de Lambert Beer, donde esta nos expresa la
relación entre absorbancia de luz monocromática
y concentración de un cromóforo en solución.
Aunque también es muy importante analizar el
método Folin-Ciocalteau (FC), donde este método
se utiliza como medida del contenido en
compuestos fenólicos totales en productos
vegetales. Se basa en que los compuestos
fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-
Ciocalteu, a pH básico, dando lugar a una
coloración azul susceptible de ser determinada
espectrofotométricamente a 765 nm. (9)
Método y materiales.
Para este laboratorio, se realizaron cuatro
procedimientos:
Determinación de Humedad.
Se necesitaba lograr determinar el porcentaje de
humedad que tenía la planta de hierbabuena, para
esto se necesitaba pesar una cantidad aproximada
de 5g de hierbabuena, después de esto, se
colocaban estos 5g en un vidrio de reloj, para así,
ingresarlo en la estufa a una temperatura de 60ºC
durante un día, después de pasado el día, se dejaba
enfriar la muestra en un desecador, para así
registrar su peso, y poder obtener el porcentaje de
humedad según la siguiente ecuación.
(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙) 𝑥 100%
%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
Ecuación 1. Determinación de porcentaje de humedad.
Para este procedimiento era necesario tratar la
muestra con pinzas para crisol, y tomar los datos
lo más rápido posible, ya que, si lo
manipulábamos con las manos, le podíamos
transferir alguna cantidad de humedad a la
muestra, y hay que recordar que en el ambiente
encontramos humedad, por lo que era necesario
pesar inmediatamente sacado del desecador, para
que el ambiente no le agregara humedad a la
muestra.
Extracción de Polifenoles.
Para el segundo procedimiento, el objetivo era
extraer los polifenoles que encontrábamos en la
muestra problema (Hierbabuena), para esto era
necesario, picar finamente la muestra problema,
para así pesar 5g de ella, estos 5 g se tenían que
transferir a un tubo falcon de 50 mL, protegidos de
la luz debidamente con papel aluminio, y le
agregábamos 20 mL de etanol, esto anterior, se
tenía que hacer por duplicado, un tubo falcon, se
utilizó con agitación vortex, en donde se teian que
agitar 5 veces durante un minuto, con intervalos de
descanso de 10 segundos, y el otro tubo falcon se
ponía en un baño de ultrasonido. Después de esto,
se tenían que filtrar la muestra problema en
algodón en un matraz aforado de 25 mL, el cual
teníamos que llevar a volumen con etanol, este
procedimiento para los dos tubos falcon, el de
vortex, y el de ultrasonido.
Curva de calibración.
Para realizar esta curva, se necesitaba preparar en
tubos eppendorf 100 µL de cada uno de los
estándares preparados anteriormente (5, 10, 20,
40, 80, 160 µg/mL) en etanol a partir del estándar
de 1 mg/mL preparado fresco, para así realizar a
grafica de absorbancia vs concentración y lograr
determinar la ecuación de la recta (y=mx + b).
Cuantificación.
Para este proceso era necesario un instrumento que
logra leer micro placas, debido a que, sobre ellas,
era necesario adicionar 20 µL de la soluciones
preparadas en el procedimiento 2 (extracción de
polifenoles), así mismo, le teníamos que añadir
100 µL del reactivo (FC) diluido en agua, y
añadíamos Na2CO3 (7% p/v), antes de pasarlo por
el lector, se tenía que proteger las placas de la luz
durante 15 minutos, para finalmente obtener la B4 80 0,012
absorbancia a 750 nm con el lector de micro B5 160 0,486
placas, esto con el fin de determinar la cantidad de
B6 160 0,659
polifenoles presentes en la muestras, y lograr
compararla con la literatura. B7 160 0,687
Tabla 2. Concentración vs Absorbancia
Caracterización General.
Todos los materiales se caracterizaron como
recibidos, estos fueron entregados por el
laboratorio, excepto la hierbabuena, que fue
conseguida personalmente en súper mercados
locales, en caso del reactivo FC, del etanol, y del
Na2CO3 (7% p/v), estos tres reactivos
mencionados anteriormente fueron entregados de
manera líquida. Además de esto, se contó, con un
espectrofotómetro, balanza, Micro pipeta, Balones
aforados y celdas de cuarzo, cuales fueron
entregados y brindados por el laboratorio.

Resultados. Grafica 1. Relación Concentración vs Absorbancia

Porcentaje de Humedad. 𝑌 = 0,0035𝑥 + 0,0397

Peso Inicial Ecuación 1. Ecuación de la recta dada por la
Peso Final (g) % Humedad concentración vs absorbancia.
(g)
Muestra 1 5,0683 0,9635 80,99 𝑌 – 0,0397
Muestra 2 5,0321 0,9822 80,5 =𝑋
0,0035
Tabla 1. Datos de humedad.
Ecuación 2. Absorbancia – Intercepto / Pendiente de
Curva de Calibración. curva = Concentración µg/mL.

Absorbancia de la muestra de hierbabuena.

Concentración Absorbancia
A1 0,042 Absorbancia
A2 5 0,028
A3 5 0,053 Vortex 0,124
A4 5 0,026 Ultrasonido 0,081
A5 10 0,001 Tabla 3. Absorbancia de las muestras de hierbabuena,
A6 10 0,009 introducidas en el lector de microplacas.

A7 10 0,027 Para los valores de la tabla 3. Fue necesario

A8 20 0,023 restarles el valor de la casilla en blanco, el cual
A9 20 0,041 tenía un valor de 0,042, esto debido a que a la
muestra se le agrego una cantidad de etanol, y ese
A10 20 0,041
valor nombrado anteriormente es el valor de la
A11 40 0,14 absorbancia para el etanol.
A12 40 0,159
B1 40 0,087
B2 80 0,033 Concentración de ácido gálico.
B3 80 0,109
 Concentración de ácido gálico
(µg/mL)
Vortex 24,08571429
Ultrasonido 11,8
Análisis.
 Humedad Hierbabuena
En la cotidianidad encontramos diferentes
puntos de vista, por la razón en que se
deben secar las plantas aromáticas, como
en nuestro caso la hierbabuena, si se hace
un buen proceso de secado, las hierbas se
conservaran de una mejor manera, así
mismo, para que estas plantas no pierdan
el buen aspecto que deben tener, pero
cabe recordar que la cantidad de agua que
le extraemos a estas plantas no debe
superara ciertos valores, ya que si se
superan estos valores, las plantas se van a
quebrar y hasta pulverizar. (10) En nuestro
caso, pusimos nuestra muestra de
hierbabuena en la estufa a 60ºC durante
un día, para que estas se secaran, y así
poder lograr determinar el porcentaje de
humedad con que encontramos estas
plantas antes de hacerle el proceso de
secado, al consultar en literatura
encontramos que el porcentaje de
humedad de la hierbabuena, en general es
de 82,37%, esto fue encontrado en
literatura, y al hacer el proceso en el
laboratorio, experimentalmente
encontramos que para nuestra muestra de
hierbabuena el porcentaje de humedad era
del 80,99% para la primera muestra y de
80,5% para la segunda muestra, y aunque
el valor no es igual al reportado en
literatura, si encontramos una gran
similitud en los porcentaje hallados
experimentalmente con el reportado en
literatura, y este diferencia pequeña en los
porcentajes, se puede dar debido a
diferentes factores, el primer factor a
analizar, es el estado en el que se compró
la hierbabuena, ya que lo que se espera
comprar, era una hoja con un olor bastante
fuerte a mentol, lo que nos indicaría lo
fresca que estaría la hoja de hierbabuena,
pero por sí solo, es imposible encontrarla
100% fresca, ya que esta ha tenido que
pasar un proceso antes de llegar al
supermercado, ahí es donde esta planta,
empieza a perder su porcentaje de
humedad, por otro lado, se puede deducir
que la mayoría de porcentaje en peso de la
planta es la humedad que contiene en ella,
por eso, cuando estas plantas aromáticas,
pierden su humedad, su proceso de
transpiración empieza a fallar, allí es
donde la planta empieza a cambiar su
color, empieza a marchitarse y empieza a
polvorearse, debido a la perdida de
procesos como es la fotosíntesis, por otro
lado, el proceso de secado nos ayuda a
eliminar muchas bacterias que crecen y se
reproducen en ambiente húmedos, lo que
nos ayuda a preservar en mejor
condiciones la planta, para finalizar, uno
de los métodos más viables para hacer
este proceso es el que se hace en
condiciones de vacío ya que minimiza las
pérdidas de compuestos fenólicos y
antioxidantes. (11)
 Curva de calibración
Para la curva de calibrado, fue necesario
graficas mediante Excel, Absorbancia vs
concentración, esto para poder hallar la
ecuación de la recta, y así poder con esta,
lograr la concentración en µg/mL del
ácido gálico, pero para esto, era necesario
que el coeficiente de correlación de
Pearson, fuera muy cercano a 1, o que no
fuera menor de 0,998, pero en este caso,
nuestro coeficiente de correlación fue
0,78733, esto nos indica que el grado de
relación entre las dos variables (
concentración y absorbancia) no son muy
dependientes, o tiene una relación muy
pequeña entre estas dos variables, y esto
se pudo haber dado por una cantidad de
factores, uno de estos que pudo
influenciar en este resultado, es la calidad
de la hoja de hierbabuena, ya que si estaba
no estaba fresca, la cantidad de
polifenoles que encontramos en ella, es un
poco diferente a la cantidad de estos, que
encontramos en una hoja fresca, por otro
lado, también se puede deducir que el
 etanol al no está sumamente fresco, pudo
afectar en la solución de etanol con ácido
gálico, por otro lado la humedad del
ambiente también pudo haber sido un
factor importante, ya que al cambiarla
humedad esta puede modificar el pH de la
solución, o al momento de hacer la
solución, no se procuró rápidamente,
cubrir los tubos de la luz, ya que se tenía
que cubrir la solución lo mayor posible de
la luz, ya que hay que recordar, que
estamos trabajando bajo la ley de Lambert
–beer, el cual me relaciona la cantidad de
absorbancia de luz monocromática
(longitud de onda fijo) con la
concentración de la solución, entonces
fácilmente esta ley puede ser afectada por
la radiación de luz que recibió la solución
al momento de exponerla durante
segundos al ambiente, ya que el reactivo
de Folin-Ciocalteau es muy estable si está
protegido de agentes reductores y de la
luz, lo que nos lleva a una reacción de
óxido reducción, en la cual el grupo
fenólico es oxidado y el ion metálico
reducido, y con respecto al coeficiente de
extinción molar hallado a partir de la
curva de calibración, cuyo valor fue de
0,0397, sin embargo el dato teórico
encontrado fue de 21200 (𝑀−1 𝑐𝑚−1) en
una banda de absorción de 260 nm.
 Concentración de ácido gálico.
Conclusiones.
De la practica realizada en el laboratorio de
bioquímica, se pueden hallar varias
conclusiones, para comenzar, vamos
hablar del porcentaje de humedad de las
plantas, en donde se puede concluir, que el
método utilizado para hallar este
porcentaje fue muy bueno, ya que el
porcentaje hallado experimentalmente, es
muy similar al porcentaje hallado en
literatura, pero no solo el procedimiento
fue bueno, también se concluye que las
hojas de hierbabuena utilizadas en este
laboratorio, era sumamente frescas, esto se
puede comprobar por dos cosas, por su
concentrado aroma a mentol, lo que es un
indicativo positivo, y por otro lado,
mencionado anteriormente, que su
porcentaje de humedad es muy similar al
reportado en literatura, estas dos
conclusiones anteriores nos lleva a decir,
que la cantidad en concentración de
polifenoles en las hojas de hierbabuena es
buena. También se puede concluir, que el
método de Folin-Ciocalteau, es fácilmente
afectable por agentes reductores y de la luz,
lo que nos lleva a tener irregularidades en
la parte de la curva de calibración, y por
estas irregularidades, el coeficiente de
extinción molar, no es 100% fiable, ya que,
al realizar la curva, lo que nos importa es la
pendiente de la recta, pero al tener el
coeficiente de correlación lejano a uno,
significa que la relación entre los datos de
cada variable no es buena, lo que nos afecta
en sí, la ecuación de la recta,
modificándonos el coeficiente de
extinción.
Información de los autores.
*E-mail: sergiobusa@unisabana.edu.co
*E-mail: nicoleribe@unisabana.edu.co
Referencias.
(1) Espectrofotometría. (2017, 29 noviembre). Recuperado 3
febrero, 2018, de
https://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADa
(2) Polifenoles – Qué Son y Por Qué los Necesita. (2015, 14
diciembre). Recuperado 3 febrero, 2018, de
https://articulos.mercola.com/sitios/articulos/archivo/2015/12/14/
beneficios-de-los-polifenoles.aspx
(3) Erika Elizabeth Muñoz, E. E. M., Karla Rivas Diaz, K. R. D.,
& Sandra Mendoza Diaza, S. M. D. (2011, 1 febrero). Comparación
del contenido fenólico, capacidad antioxidante y actividad
antiinflamatoria de infusiones herbales comerciales. Recuperado 3
febrero, 2018, de
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S20
07-09342012000300006
(4) Perez Garcia Vicente, V. P. G., & Jose Luis Rico Moreno, J. L.
R. M. (2014, 20 junio). Ciencias de la Ingeniería y Tecnologí.
Recuperado de
https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/561064.pdf#page=124

(5) Luis Bujanda Fernandez, L. B. F. (2001, 26 febrero).

Resveratrol: en unos tintos, más que en otro. Recuperado 3 febrero,
2018, de
http://elmundovino.elmundo.es/elmundovino/noticia.html?vi_secc
ion=1&vs_fecha=200102&vs_noticia=983142299

(6) Polifenol. (2017, 26 noviembre). Recuperado 3 febrero, 2018,

de https://es.wikipedia.org/wiki/Polifenol

(7) Sara Arranza, S. A. (2016, 20 agosto).

http://www.pncta.com.mx/pages/pncta_investigaciones_02c.asp.
Recuperado 3 febrero, 2018, de
http://www.pncta.com.mx/pages/pncta_investigaciones_02c.asp

(8) Ecured. (2012). Espectroscopia. 03-02-2018, de Ecured Sitio

web: https://www.ecured.cu/Espectroscopia

(9) García Martínez, Eva. Fernández Segovia, Isabel. uentes López,

Ana. (2015). Determinación de polifenoles totales por el método de
Folin- Ciocalteu. 03.02.2018, de Universidad pontificia de
Valencia. Sitio web:
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/52056/Garcia%20Ma
rt%C3%ADnez%20et%20al.pdf?sequence=1

(10) herbotecnia. (2015). SECADO DE HIERBAS

AROMATICAS Y MEDICINALES - MÉTODOS. 04-02-2018, de
google Sitio web: http://www.herbotecnia.com.ar/poscosecha-
secadoMetodos.htm

(11) Karen Sarmiento Delgado- Laura Valentina Cely Merchan.

(2017). “Determinación de polifenoles en hierbabuena por el
método de Folin-Ciocalteou”. Unisabana, 1, 6. 04-02-2018, De
Universidad de la sabana Base de datos.