UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR
PROFESORES: Macarena Kayser
Francisco A. Duarte Olave

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5:
Organización Subcelular

Sección: Bio 131-18

Integrantes: Carolina Cruz
Amandy Espinoza
Ignacio Faúndez
Randy Oñate
 Introducción
Los seres vivos nos encontramos formados por pequeñas estructuras básicas. Estas son las
células, las unidades morfológicas y funcionales más básicas y fundamentales de la materia viva.
Existen dos tipos, unas más simples y primitivas llamadas células procariontes que forman dos
dominios en la naturaleza, denominados Eubacterias y Archaea y nos muestran lo más esencial de
la vida. Y otras células llamadas Eucariontes que son mucho más complejas y con una estructura
mucho más organizada y que pueden vivir una independiente de otras células o se pueden encontrar
en agrupaciones, formando organismos multicelulares. Estas tienen propiedades fundamentales,
que en conjunto y organizadas, cumpliendo con funciones especializadas como metabolismo, flujo
de información genética, homeostasis, etc. para el correcto trabajo de los complejos sistemas que
nos forman. Permitiendo así, el sustento de las necesidades más básicas y vitales en cada
organismo.
Los principales métodos utilizados para el estudio de las células se encuentran basados en la
microscopia, la cual es una herramienta esencial para examinar tales estructuras, que con el pasar de
los años y los avances de la ciencia se ha ido complementando con nuevas tecnologías para estudios
más acabados. Habitualmente pueden conseguirse diferentes tipos celulares a partir de la
disgregación de los tejidos en los que se encontraban, purificarse y obtener como resultado
diferentes tipos celulares individuales que pueden ser cultivadas y desarrollarse fuera de estos. Más
aún, podemos fraccionar éstas células y aislar cada uno de sus orgánulos hasta tener muestras puras
de ellos; como también de los constituyentes macromoleculares que se encuentren. Esto último
puede ser realizado mediante un proceso llamado centrifugación el cual permite obtener estructuras
subcelulares sin perder las funciones que los caracterizan; comienza con la disgregación de una
muestra que tiene diferentes maneras de realizarse: shock osmóticos, vibraciones ultrasónicas o
moliendo las células en homogenizadores mecánicos. Provocando el rompimiento de las
membranas y consiguiendo un homogenizado o lisado que luego es sometido a repetidas
centrifugaciones con velocidades gradualmente mayores que fraccionarán los extractos celulares en
sus componentes. Con este tratamiento se irá separando cada tipo de organelo según el tamaño y
densidad que tenga; donde mientras menor sea el tamaño del componente subcelular mayor será la
fuerza centrífuga requerida para conseguir la sedimentación. Posteriormente los pellets obtenidos
pueden complementarse a marcadores moleculares que reaccionan frente a enzimas o moléculas
propias de cada compartimiento subcelular.
Para ahondar mucho más en las propiedades y características de las células presentamos el
actual informe; donde nos dedicaremos al análisis de las células eucariontes, a partir de muestras
realizadas en el laboratorio donde se aplicó la técnica, ya mencionada, enfocada en la identificación
de estructuras internas de la célula, conociendo de forma mucho más cercana orgánulos como
también constituyentes macromoleculares, y tales resultados han sido comparados y
1
complementados con otras fuentes científicas.
Obejtivos: Entender y aplicar el método de fraccionamiento celular como también identificar
organelos celulares con tinción y sin tinción. Entender las reacciones de los marcadores celulares y
por ultimo aprender a utilizar el objetivo de inmersión.

1
Alberts, Bray, Hopkins, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Introducción a la Biologia Celular 2004, Editorial
Panamericana, 2ª edición, Estados Unidos. Pp. 147-174
 Materiales y métodos

Primero se recibió un homogenizado filtrado de hígado de Rattus Norvegicus realizado por

las docentes previamente. Luego se procedió a la homogenización mecánica ( usando un
aparato llamado ultra turax). Luego de realizado el homogenizado se prosiguió a filtrar la
muestra 2 veces y mezclarla con Buffer IBC para la protección de organelos.
Todo esto, manteniendo los materiales a 4 °C. Ya obtenido el filtrado se repartió 10 ml del
filtrado a cada grupo en un tubo falcon para una centrifugación de 10 minutos.
.

Luego de realizada la primera centrifugació se obtuvo el pellet 1 (P1) correspondiente a

nucleos sedimentados, el P1 de dejo en 1 ml de buffer IBC en hielo para el análisis.

El sobrenadante del P1 se transfirió a otro tubo falcon y se centrifugo por 25 minutos

obteniendo un sedimento mezclado con 1 ml de buffer IBC, obteniendo de esta manera el
pellet 2 (P2), correspondiente a la fracción mitocondrial. El sobrenadante del P2 se
transfirió a un tercer tubo falcon obteniendo asi la fracción microsomal (S2).

En la actividad numero 1 se observaron mediante microscopios las muestras de P1 y P2.

Esto se realizo colocando una gota de cada muestra usando una micropipeta para después
colocarle encima un cubreobjeto. Cada pellet se observo sin tinción y con tinción de azul de
tripan con un amento objetivo de 40x.

En la actividad b) de la actividad 1, se trato de la identificación de la enzima Succinato

desidrogenasa en distintas muestras.

Este experimento se realizo colocando distintas especies en 4 tubos de ensayos para

después colocarlos 15 minutos en baño maria a 37 °C y su posterior evaluación.

Por ultimo la actividad numero 2 se trato en la observación de una muestra permanente de

higo de Rattus Norvegicus usando el obetivo de inmersión, observándolo en diferentes
aumentos.

En la actividad 1-b) se compararon diferentes muestras para reconocer la presencia de

mitocondrias a través de la enzima Succinato

Succinato ———SDH—→ Fumarato + 2H+ + 2e-

Las muestras utilizadas son mostradas en la tabla N°1

 Tabla N° 1

N° Tubo Succinato Azul de Agua fracción fracción fracción

0,1M metileno destilada nuclear mitocondrial microsomal
1 Blanco 1ml 2gotas 1ml
2 fracción 1ml 2gotas 1ml 1ml
nuclear
3 fracción 1ml 2gotas 1ml 1ml
mitocondrial
4 fracción 1ml 2gotas 1ml 1ml
microsomal

Actividad Nº 2: Observación de un corte de hígado de Rattus norvegicus (Berkenhout)

utilizando el objetivo de inmersión.

En esta actividad observamos una muestra de un corte de hígado de Rattus norvegicus, la

cual partimos observando con el objetivo de 4X para enfocar la parte a observar de la
muestra, luego antes de poner el objetivo de inmersión, pusimos cuidadosamente una gota
de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos de la muestra observada y tras esto procedimos
a poner el objetivo de 100X de manera en que quedara inmerso en el aceite para obtener un
aumento de 1000X (ya que el aumento del ocular es de 10X) y regulando el enfoque con el
micrométrico, poder observar claramente la muestra.
 Resultados

Actividad 1: Obervacion de pellets obtenidos con y sin tinción

-Muestra: Núcleos Centrifugados

-Tinción: Sin tinción.
-Aumento Ocular: 10X.
-Aumento Objetivo: 40X.
-Aumento Total: 400X.

Resultados: Se observan nucleos en suspensión, también se observ una burbuja de grandes

proporciones.

-Muestra: Núcleos Centrifugados

-Tinción: Con tinción azul de tripan
-Aumento Ocular: 10X.
-Aumento Objetivo: 40X.
-Aumento Total: 400X.

Resultados: Se logran diferenciar óptimamente los núcleos, pero la solución acuosa se ve

transparente.
Se Pueden divisar movimientos de las estructuras y se puede diferenciar una notable distinción en
su coloración. Mediante el ADN, que es la macromolécula que se tiñe con el azul de Tripán,
podemos diferenciar los núcleos. Pudimos identificar también restos de tejidos que se
diferencian de los núcleos.

-Muestra: Mitocondria Centrifugados

-Tinción: Sin tincion
-Aumento Ocular: 10X.
-Aumento Objetivo: 40X.
-Aumento Total: 400X.

Resultados: Se aprecia la muestra enriquecida en mitocondrias.

 -Muestra: Mitocondria Centrifugados
-Tinción: Con tinción azul de tripan
-Aumento Ocular: 10X.
-Aumento Objetivo: 40X.
-Aumento Total: 400X.

Resultados: Aun no se puede lograr ver la mitocondrias con claridad ya que este coloide no
puede colorarlo y solo se aprecia los núcleos por una mala separación del pellet con el
sobrenadante, como se puede apreciar en la figura

Actividad 1-b): Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores

moleculares
Después de sacar los tubos de ensayo del baño María no se logro tener ninguna diferencia
aparente ya que las muestras quedaron tal cual lo aviamos dejado. Este resultado puede ser
debido a que la concentración fue muy pequeña y/o una mala manipulación de separación
de las subunidades, por no incolorarce la muestra de mitocondrias.

Imagen de los tubos usados en

la actividad.

La rotulación corresponde al
numero de tubo
correspondiente a la tabla
adjuntada en materiales y
métodos.

Actividad Nº 2: Observación de un corte de hígado de Rattus norvegicus (Berkenhout)

utilizando el objetivo de inmersión.

Al comparar la imagen obtenida con el objetivo de 40X con la obtenida con el objetivo de 100X,
este ultimo nos permitió visualizar células que con un aumento menor no era posible visualizar,
pudimos observar claramente marcados de color rosa las células del hígado, con sus respectivos
núcleos marcados de un color morado.
 Discusión
Actividad 1-a)
Los resultados obtenidos en la primera 1ª actividad fueron los esperados ya que fue posible
realizar de manera correcta la centrifugación de la homogenización del hígado de Rattus
Norvegicus obteniéndose pellet de núcleos, mitocondrial y microsomal además de sus
respectivos sobrenadante.

En la actividad 1b los resultados obtenidos fueron los esperados ya que fue posible ver el
pellet de núcleos con tinción de azul de tripan de manera correcta en un objetivo de 40x. En
cambio con el pellet de mitocondrias con tinción de azul de tripan, estos no pudiendo ser
observados de manera clara ya que este coloide no pudo colorarlo y solo fue posible
observar algunos restos de núcleos debido a una mala separación del pellet con el
sobrenadante.

Según las actividades realizadas se logro comprender las etapas de la fragmentación

subcelular en la cual debe se a grandes rasgos debe romperse las membranas celulares para
lograr la separación de los organelos de la célula, para su luego la separación mediante la
técnica del centrifugado donde se aumenta la fuerza de gravedad y se acelere la
sedimentación según la densidades de los diferentes compuestos, como por ejemplo los
núcleos son los primeros organelos en sedimentar ya que poseen el mayor peso, y los
ribosomas son las ultimas en sedimentar debido a su peso bajo molecular, que en esta
actividad no se extrajo de manera pura ya que mantuvo en la sobrenadante microsomal ya
que se obtuvo en una tercera centrifugado mitocondrias como pellet final.
Las actividades realizadas y sus resultados esperados, no fueron conseguidas por nosotros
ya que después de la fragmentación y la centrifugación fueron separados de mala manera
por el estudiante a cargo, no siguiendo los pasos a seguir adecuadamente2

Actividad 1-b)
En la primera centrifugación que se llevo a cabo se obtuvo un sedimento que corresponde a
trozos de membrana y a los núcleos de las células del hígado de rata, esto se debe a que el
núcleo es el organelo mas pesado de la célula.
Luego el sobrenadante que se volvió a centrifugar a una velocidad más alta se extrajo otro
pellet que corresponde a la fracción mitocondrial. Esto es producto del menor peso de las
mitocondrias con respecto al núcleo.
Estas muestras de pellet fueron aisladas y se agrego Buffer IBC para mantener aislados los
organelos.
Las muestras se mantienen durante todo el proceso en un medio frio (4°C) con el fin de
minimizar la activación del daño generado por las fosfolipasas y proteasas.

2
Universidad Andrés Bello, Guía N°5: Organización Subcelular, Curso Bio 131-18, Biología Celular 2011
En este procedimiento se observaron cuatro tubos, los cuales contenían distintas soluciones
con el fin de evaluar el fraccionamiento. La solución de Succinato Deshidrogenasa se usa
para identificar mitocondrias ya que el Succinato, proteína que interviene en el ciclo de
Krebs, característico de las mitocondrias, al estar en reacción con la Succinato
deshidrogenasa, esta ultima cataliza la deshidrogenación del Succinato y lo convierte en
Fumarato, un alqueno. En una muestra rica en mitocondrias y tinción de azul de metileno,
lo cual en un principio es de color azul, al entrar en contacto con el succinato a una
temperatura de 37°C, que es la temperatura corporal de un ratón y la temperatura en la cual
las mitocondrias actúan con mayor eficiencia, al haber pasado 45 minutos se observa que la
muestra se torna transparente producto de la reacción del Succinato de las mitocondrias y la
Succinato deshidrogenasa que se agregó a la muestra.
En los tubos que preparamos para observación se observó cambios positivos solo en el tubo
3, lo cual era de esperar debido a que era una preparación rica en mitocondrias. El uso de
vaselina liquida en los tubos se debe a que el azul de metileno reducido puede fácilmente
ser oxidado por oxigeno del aire, y recobrar su coloración azul intensa, es por esto que se
cubre el medio de reacción con la vaselina para que la reacción se lleve a cabo en ausencia
de oxigeno.

Actividad 2
El mayor aumento obtenido se explica porque A diferencia del aire, el aceite de inmersión3
tiene un índice de refracción similar al del vidrio del cubre objetos y Al colocar aceite de
inmersión entre el lente frontal del objetivo (diseñado para usarse con aceite de inmersión)
y el cubre objetos, el rango angular de los rayos difractados capturados por los lentes se
incrementan y, en efecto, incrementa el aumento y resolución del objetivo permitiéndonos
visualizar muestras mas pequeñas.

Las células del hígado que observamos se llaman hepatocitos4, participan de la biosíntesis
proteica, y del almacenamiento de carbohidratos (glucógeno) y proteínas, también de la
síntesis del colesterol, fosfolípidos y sales biliares. Cumplen también una función
de desintoxicación, modificación y excreción de sustancias exógenas, y el inicio de la
secreción de bilis.

3
http://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm
4
http://medicinafarmacologia.blogspot.com/2009/12/hepatocitos.html
 Bibliografía

1-Alberts, Bray, Hopkins, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Introducción a la

Biologia Celular 2004, Editorial Panamericana, 2ª edición, Estados Unidos. Pp. 147-174

2-Universidad Andrés Bello, Guía N°5: Organización Subcelular, Curso Bio 131-18,
Biología Celular 2011

3-http://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm

4-http://medicinafarmacologia.blogspot.com/2009/12/hepatocitos.html