POLIMORFISMOS DEL ADN MITOCONDRIAL EN LOS NATIVOS DE

LAS ‘’ISLAS DE LOS UROS’’ DEL LAGO TITICACA-PERÚ

I. INTRODUCCIÓN

Hoy en día todavía quedan poblaciones con sus orígenes ancestrales, como también se
da el mestizaje en diferentes países, (Sukernik et al. 1996). Los factores más importantes
que han hecho migraciones en diferentes culturas así como también la diversidad
lingüística para la variedad interpoblacional y para la homogeneidad genética, dentro
de cada uno de ella (Simone et al. 2000).

Históricamente, estudios lingüísticos, etnológicos y arqueológicos del siglo XVI, en

donde las diferentes culturas peruanas pertenecían a las comunidades nativas, siendo
estos grupos nativos de las islas flotantes (los urus de lengua aimara), estos grupos
vivían de la recolecta de la caza y la pesca. (Crequi- Montfort y Paul Rivet Torero, 1992).

En las épocas de etnia uru ocupo una basta de región extendiéndose desde el rio
Azángaro, lago Titicaca, rio desaguadero, lago Poopò, rio Lacajahuira, lago Coipasa,
encontrándose también en la costa de Arica e Iquique, en el desierto de Atacama y en
la jurisdicción de Arequipa, reportando que eran cerca de un cuarto de población del
antiplano (Polo, 1901; Wachtel, 1986).

La convivencia y las relaciones con otras familias lingüísticas como los puquinas, aimaras
y quechuas, sin embargo las relaciones de parentesco entre las relaciones nativas son
especulativas por falta de un sistema de escritura que haya registrado los
desplazamientos humanos antes de la época de prehispánica. Estos diversos factores
como: las fluctuaciones de los niveles del agua del lago, la convivencia y las ocupaciones
del inca y llegada de los españoles en 1532 an determinado la aculturización de la etnia
uru durante muchos ciclos. Para determinar las relaciones de parentesco o diferencia
entre las poblaciones humanas es ampliamente usado el estudio de marcadores del
ADN mitocondrial (ADNmt) y del cromosoma Y.

El ADNmt es de forma circular, con una longitud aproximadamente 16569 pares de base
(pb) formada por una cadena pesada (H) y rica en G y una cadena completa
complementaria llamada ligera (L) rica en C, y que en el humano no presenta intrones
(Kogelnik et al., 1996; Guisar, 2000).

El ADNmt se hereda por línea materna y su análisis permite seguir el curso del genoma
a través de los árboles genealógicos dentro de las poblaciones humanas. La no
recombinación del ADNmt, permite mutaciones que se acumulan más o menos
linealmente y cronológicamente. El ADNmt, es un buen indicador, de que hubo
migraciones o contactos entre migraciones pues la presencia de mutaciones idénticas
en el ADNmt de grupos humanos separados geográficamente, también registra
procesos estadísticos. El ADNmt tiene dos regiones mayores que son foco de estudios
genéticos; cerca del 94 % de la secuencia ADNmt son regiones codificantes, los cuales
incluyen genes para ARN ribosomal (rARN), ARN transferencia (tARN) y proteínas
involucradas en la fosforilacion oxidativa.

Las técnicas de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción y se emplea

para determinar los patrones genéticos del ADNmt, para obtener el patrón de bandas
se utiliza una serie de enzimas de restricción. La combinación de fragmentos detectados
por un conjunto de enzimas de restricción representa un haplotipo, cada agrupamiento
de haplotipos se define como un haplogrupo, tipo o linaje ADNmt.

Johnson et al. Teste Easton et al. (1996) fueron los primeros en descubrir los haplotipos
RFLP de ADNmt humano se agruparon de acuerdo a las regiones geográficas y que las
relaciones entre las poblaciones pueden ser establecidas examinando los patrones RFLP
del ADNmt.

Wallace (1985) estudiando la variación del RFLP de ADNmt en poblaciones Nativas

Americanas, detectaron tipos de ADNmt también encontrados en Asiáticos. Schrr (1990)
sugirieron que todos lo haplotipos nativos americanos se agrupan en cuatro halogrupos.
Estos cuatro halogrupos, designados “A”, “B”, “C”, “D”, fueron definidos por Wallace y
Torrini (1992), por la ausencia de un sitio de restricción en la posición del nt 5176 para
AluI; además se estudiaron dos sitios de restricción adicionales en la posición del nt
10394para DdeI y en el nt 10397 para AluI. Los haplogrupos A, B, C y D se subdividen en
subtipos (A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2) por la presencia o ausencia de un sitio de
restricción en la posición del nt 16517 para HaeIII.

Los estudios sobre el polimorfismo del ADNmt en poblaciones ancestrales y

contemporáneas del nuevo mundo y del continente asiático son diversos. Todos
concuerdan con la presencia de cuatro halogrupos Amerindios (A, B, C y D) en América
y Asia, indicando que todos provienen de un grupo ancestral común, que migraron por
el estrecho de Bering américa durante el periodo de glaciación. También se ha
observado presencia de dos haplotipos fundadores adicionales X6 y X7 en America y
Asia.

La variabilidad genética de una población peruana andina quechua hablante que vivía
en a la cuidad de pasco (28 individuos) y Lima (24 individuos), fue analizada por RFLPs
que definen los haplogrupos Amerindios del ADNmt. El haplotipo B1 es el más frecuente
con 42 %, encontrándose también los haplotipos A1(1.9%) y A2(1.9%9; B2(8%);C1(9.6%)
Y C2 (7.7%); D1(1.9%) Y D2( 17.3%) (Rodriguez et al., 2001)
Con referencia a la etnia uru, se han realizado estudios lingüísticos, etnológicos y
arqueológicos, sin embargo trabajos utilizando técnicas moleculares no han sido
realizados. La comparación de la distribución de los haplotipos en las poblaciones
ancestrales y contemporáneas.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

1. ESTUDIO DE LA MUESTRA

Las islas de los uros se ubican en la gran bahía de Puno, que es habitada por nativos
aymara hablantes, que viven en 40 pequeñas islas flotantes.

La muestra estuvo representada por 28 escolares C.E.S Técnico Artesanal “Uros

Chulluni” y del C.E.P 70582 “Uros Torari Pata” de las “Islas los Uros” del lago Titicaca con
edades que comprenden entre 10-17 años, que donaron sangre periférica( 3 ml en un
tubo con EDTA 0.5M)

2. METODOLOGÍA DE TRABAJO EN LABORATORIO

2.1 Extracción de ADN:

Para la obtención de ADN se empleó la técnica de extracción simplificada(Fujita,1991):

Un volumen de sangre(2-3ml) fue lavado de 3 a 4 veces con 4 volúmenes de TE 20:5 (20
mM Tris-Hcl, 5 nM de EDTA) y centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos. Esta solución
hipotónica elimina células rojas enucleadas y la hemoglobina.

El pellet fue resuspendido en 0.7 volúmenes de TE 20:5 y se adicionó Sarcosyl con una
concentración final de 1% para lisar las células blancas y linfoblasticides.

El Lisado fue incubado con Proteasa K de concentración 100ug/ml a 37°C por 5-12h.

Luego se agregó acetato de amonio al Lisado a una concentración final de 2.5 M, se

precipitó el ADN con 3 volúmenes de etanol absoluto mantenido en el congelador. El
sobrenadante fue eliminado, se procedió a resuspender en un volumen de TE 20:5
adicionarlo la solución de NaCl 0.2 M, fue precipitado con etanol absoluto refrigerado,
lavado con etanol 70 % y secado. El ADN fue resuspendido en una solución TE 20:1
conservándose a 4 °C.

2.2 Amplificación del ADNmt por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Se realizó la amplificación de segmentos específicos de ADNmt(menores a 340pb). Los

primers usados son secuencias de 20-26 oligonucleotidos estándares.
 Los componentes básicos el ADN molde, los iniciadores, solución MgCl2 y la solución
buffer PCRII(PERKIN ELMER), los cuatros desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) y la
enzima Taq polimerasa, se mezclaron en un tubo Eppendorf de 0.2 ml.

La amplificación de las muestras se llevó cabo en un termociclador Thermolyne

Amplitron II, con los siguientes parámetros: Desnaturalización inicial por 5 min a 94 °C
por 30 s, hibridación a 62°, 58° y 50°(de acuerdo a los iniciadores) por 30s y extensión a
72°C por 2 min. Finalmente se realizó una extensión a 72 °C por 5 min, conservandose a
4 °C.

Los fragmentos amplificados fueron verificados, a traves de electroforesis en geles de

agarosa al 2% por este procedimiento se determinó además la variación de la delección
9-pb en la región COII/tARNLYS, que caracteriza al haplogrupo B.
2.3 Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP):

Se utilizaron un conjunto de endonucleasas para determinar la presencia(+) o ausencia

(-) de sitios de restricción en los puntos específicos del ADNmt. La reacción se realizó en
un tubo de Eppendorf de 0.2 ml, siguiendo las recomendaciones del fabricante
Corporación Promega

2.4.1. Preparación de los geles

Geles de agarosa al 2%. Para observar: deleción 9-pb (COII/tARN_LYS) y los RFLPs
obtenidos las enzimas AluI (5167 y 13262) y HincII (13259).

Geles de policrilamida al 4%. Obtenida de una solución de poliacrilamida al 21%, con

persulfato de amonio (0.07%) y un catalizador TEMED (0.05%). Para los RFLPs
obtenidos por las enzimas DdeI (10394), AluI (10397) y HaeIII (663 y 16517)

2.4.2. Preparación de la muestra

Según el tipo de gel, se pipeteó en el respectivo pocito, entre 8-12 µl de la muestra,

previamente se mezcló en papel parafim con 2 µl de azul de bromofenol-xylene
cyanol, el cual contiene glicerol. Para determinar los tamaños de los patrones RFLPs
del ADNmt se utilizaron 1 a 2µl de un marcador estándar de peso molecular 25 pb y
100pb.

2.4.3. Condiciones de Electroforesis

Para el campo se utilizó una fuente BIO-RAD, con 100V y 80 mA en la cámara
horizontal (donde se corrió con agarosa) y 250V con 150mA en la cámara vertical
(donde se corrió con poliacrilamida).

2.5 Visualización de la muestra ADNmt

Al finalizar la electroforesis se realizó la tinción de los geles con bromuro de etidio

(10µg/µl) por 15 minutos, exponiéndose a luz UV y registrándose digitalmente (Bio
Doc System, UVP) para el análisis respectivo.

3. ANÁLISIS DE LOS RFLPS DEL ADNMT

Los fragmentos de ADNmt amplificados y los patrones RFLPs resultantes fueron

comparados con la secuencia estándar de ADNmt de Cambridge, versión 2001.

En el sitio 663 se observa una sustitución del nt A por el nt G, de otro modo no

cortaría. El sitio 626 es constante
 La pérdida de CCCCCTCTA en la posición 8272-8280 determina la deleción 9-pb

Si el nt A de la posición 13259 cambia a G es digerido por AluI (AG CT), de lo contrario

es por HincII (GT(T/C) (A/G)AC)
En el sitio 5176 hay sustitución de un nucleótido que reconoce la enzima, mientras que
el sitio 5045 es constante.
 Cuando el nt A de la posición 10394 es sustituido por G, la enzima DdeI corta.

Cuando el nt C (10397) y el nt G (10398) cambian por T y A respectivamente, es

cortada por AluI.

Cuando el nt T (16519) es ustituido por C es cortado por HaeIII. En el sitio 16456 no se

observa polimorfismo porque es constante.

La distribución de las frecuencias de los haplogrupos amerindios en el ADNmt se indican

directamente en porcentajes. Se determinó el índice de heterozigosidad o diversidad
genética de los pobladores de las islas Los Uros mediante:
𝑛(1−𝛴𝑃𝑖 2 )
h== 𝑛−1
III. RESULTADOS
Las 28 muestras de ADNmt de los nativos de las islas los Uros del Lago Titicaca- Perú
fueron analizados en siete sitios RFLPs y un sitio variable con deleccion de 9-pb en la
región COII/tRNA lys, los que definen a los halogrupos Amerindios en el ADNmt.
Caracterizándose la población Los Urs dentro de tres halogrupos Amerindios: A, B y D.

Figura 1: Corrido electroforético en gel de poliacrilamida al 4% de fragmentos de ADN

mt de nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca- Perú, obtenidos por PCR-RFLP,
tratados con la enzima de restricción Hae III (posición 663). En las líneas 6,7 y 8 se
observa fragmentos de 66, 38 pb que indican presencia de un sitio de restricción en la
posición del nt 663 para Hae III, determinando al halogrupo A.
El fragmento de 104 pb indica la ausencia de un sitio de restricción en la posición del
nt 663 (líneas 1-5). En la línea 9 se observa la muestra amplificada PCR de 121 pb. No
se observa el fragmento de 17 pb
 Figura 2: Corrido electroforético en gel d agarosa al 2% de fragmentos de ADN mt de
nativos de las “Islas de los Uros” del Lago Titicaca-Peru, obtenidos por PCR. Se observa
Deleccion (D) 9-pb en la posición 8272-8280 del ADNmt (líneas 1,4,7,12), que
caracterizan al halogrupo B, el fragmento posee 112 pb. Los fragmentos de peso
molecular de 121 pb de las líneas 2,3,5 y 6 no presentan deleccion (ND).

Figura 3: Corrido electroforético en gel de agarosa al 2% de fragmentos de ADN mt de

nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca- Peru, obtenidos por PCR-RFLP, tratados
con la enzima de restricción HincII (posición 13259). En las líneas 3 y 11 se observan las
muestras amplificadas PCR de 181 pb. La enzima de restricción HincII al cortar en el
sitio de restricción posición del nt 13259 y obtener fragmentos de 155 y 26 pb (líneas
1, 2,4 y 10), determina la no pertenencia al halogrupo C. No se observa el fragmento
de 26pb.
Figura 4: Corrido electroforético en gel de agarosa al 2% de fragmentos de ADNmt de
nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca Perú, obtenidos por PCR-RFLP, tratados
con la enzima de restricción Alu I (posición 13262). Se observa la muestra amplificada
PCR de 181 pb en la línea 12. En las demás líneas de los fragmentos poseen igual peso
molecular que su PCR, indicando la ausencia del sitio de restricción en la posición del
nt 13262, el cual determina la no pertenencia al halogrupo C.

Figura 5: Corrido electroforético en gel de agarosa al 2% de fragmentos de ADN mt de

nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca Perú, obtenidos por PCR-RFLP, tratados
con la enzima de restricción AluI (posición 5176). La muestra amplificada PCR de 183
pb se observa en la línea 19.
La presencia de fragmentos 165 pb en las líneas 1y 3 indican la ausencia del sitio de
restricción en la posición del nt 5176, el cual caracteriza al halogrupo D. Las líneas 2,4y
18 indican la presencia del sitio de restricción en la posición del nt 5176, obteniéndose
fragmentos de 131 pb. No se observa los fragmentos de 34 y 18 pb.
Figura 6: Corrido electroforético en gel de poliacrilamida al 4% de fragmentos de ADN
mt de nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca Perú, obtenidos por PCR-RFLP,
tratados con la enzima de restricción Hae III (posición 16517). La muestra amplificada
PCR de 261 pb se observa en la línea 7.
Fragmentos de restricción de 171,61 y 29 pb observados en las líneas 2,4,9,11,14 y 17
indican la presencia del sitio de restricción en la posición del nt 16517 que caracteriza a
los subtipos B1, C1 y D1.Los fragmentos de 171y 90 pb ( líneas 1,5,6,12 y 13) indican
ausencia del sitio de restricción en la posición del nt 16517, el cual caracteriza a los
subtipos A2,B2,C2 y D2. Linea 8 Ladder de 25 pb.

Figura 7: Corrido electroforético en gel de poliacrilamida al 4% de fragmentos de ADN

mt de nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca Perú, obtenidos por PCR-RFLP,
tratados con la enzima de restricción Dde I (posición 10394). La muestra amplificada
PCR de 335 pb se observa en la línea 5.
En las líneas 7 y 9 se observan fragmentos de 175 y 122 pb que indican la presencia del
sitio de restricción en la posición del nt 10394, esto confirma la presencia del halogrupo
D.
La ausencia de sitio de restricción en la posición de nt 10394 (lineas1,4,8,10,18),
confirma la presencia de los halogrupos A o B, los fragmentos de 213 y 122 pb, indican
corte en otro sitio de restricción no polimórfico (posición 10536 del ADN mt). Linea 6
ladder de 100 pb.

Figura 8: Corrido electroforético en gel de poliacrilamida al 4% de fragmentos de

ADNmt de nativos de las “Islas los Uros” del Lago Titicaca Perú, obtenidos por PCR-
RFLP, tratados con la enzima de restricción Alu I (posición 10397). La muestra
amplificada PCR de 335 pb se observa en la línea 1.
En las líneas 5,6 y7 se observan fragmentos de 171 y 164 pb que indican la presencia del
sitio de restricción en la posición del nt 10397, esto confirma la presencia del halogrupo
D.La ausencia de sitio de restricción en la posición de nt 10397 (líneas 3,4,8 y 9),
confirma la presencia de los halogrupos A o B. Linea 2 ladder de 25 pb.
IV. DISCUSION
En los pobladores de la isla de los Uros se observa predominancia del haplogrupo B con
un 75%. Además 400 urus fueron registrados en un censo demográfico en el desierto de
Atacama .

Los resultados del estudio de ADNmt en pobladores de la isla Los Uros concuerda con la
predominancia de haplotipo B1 en las poblaciones andinas como: Taquiles 100%,
Amantani 88.6%, Anapia 87.5% y grupos Aymara 74.2%

La presencia del haplotipo A2 con un 17% en Los Urus, indicaría un origen distinto de
pobladores ancestrales de ésta isla, con respecto a los pobladores de las islas de Taquile,
Amantani, Anapia, Grupos Aymara.

La baja frecuencia del haplogrupo D en las poblaciones Los Uros del lago Titicaca (7,1%),
confirma que el haplogrupo D es predominante en poblaciones que habitan las regiones
australes de Sudamérica.
La ausencia del haplogrupo C en las poblaciones de las Islas Los Urus, confirma que el
haplogrupo C es menor en poblaciones andinas de Sudmérica que en las poblaciones
nor orientales de Sudamérica.

La distribución de las frecuencias:

 Los ancestros de los Amerindios (haplogrupos A, B, C y D) llegaron hasta

subamérica (haplogrupo B).
 Luego poblaciones Na-Dene (haplogrupo A) disminuye su frecuencia de norte a
sur.
 Los Eskaleut (ausencia haplogrupo B) quedaron en el extremo norte del
continente.

El índice de diversidad genética (h):

 En los Uros con valor de 0.415, es mayor en poblaciones de Anapia ( 0.239) y

Amantani (0.208)
 En la isla de Taquile se observa una homogeneidad en tipoy frecuencia de
haplogrupos, debido a que h es nulo.
 Los haplogrupos Amerindios que caracterizan a grupos Aymara hablantes son:
B, D y C, igual a los encontrados por Sandoval y Fuijta en la isla Anapia. Los
resultados concuerdas con la idea de que a través del tiempo se han actualizado
como Aymara y genéticamente mezclándose con grupos del Altiplano.
 Existen otras poblaciones parentales de los uros, como los Uru Chipaya de la
región boliviana, que se debe estudiar para establecer la presencia del acervo
genético de la etnia uru en los habitantes Uros de las islas flotantes de la bahía
de Puno.
V. CONCLUSION

Los estudios de RFLPs del ADMmt , nos ha permitid caracterizar a los isleños Uros del
lago Titicaca- Perú dentro de tres haplogrupos Amerindios: A , B y D.

El haplogrupo B, subtipo B1, se encuentra con una alta frecuencia de 75%. El

haplogrupo A, subtipos A2, con 17.9% y el haplogrupo D,subtipo D1 con 7.1%.

No se encontró el haplogrupo C.

La diversidad genética en los nativos de las islas Los Uros del lago Titicaca-Perú es de
0.415, mayor con relación a otras poblaciones del altiplano.