Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
TP Guiadeanalisis
TP Guiadeanalisis
DETERMINACIÓN DE HUMEDAD
Método directo (por destilación azeotrópica)
Método indirecto
DETERMINACIÓN DE CENIZAS
Cenizas totales
DETERMINACIÓN DE GLÚCIDOS
I) Métodos basados en el poder reductor
Método de Fehling-Causse-Bonnans modificado: Glucidos solubles (directamente
reductores y reductores previa hidrólisis ácida) y Glúcidos totales.
Método microcolorimétrico de Nelson-Somogyi
II) Métodos colorimétricos que involucran reacciones de condensación
Método de la Antrona/sulfúrico
DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO Y PROTEÍNAS
Métodos no extractivos
Determinación de Proteínas totales: Determinación del nitrógeno total por el Método de
Kjeldahl (Método de Referencia)
Determinación de Nitrógeno básico volátil- Índice de putrefacción
Determinación de Nitrógeno no proteico
Determinación de Nitrógeno álcali lábil: Método de Kofranyi
Métodos extractivos colorimétricos
a) Método de Biuret
b) Método de Bradford
c) Método de Lowry
Determinación de Nitrógeno amínico: Método de Sorensen
DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS
Métodos de extracción directa de los lípidos
Método de Soxhlet
Métodos de extracción de los lípidos previa liberación de la fase grasa
Método de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff
Método de Gerber- Materia grasa en leche fluida
Método de Rose Gottlieb- Método de referencia.
Materia grasa en dulce de leche. Método de Rose Gottlieb
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
DETERMINACIÓN DE HUMEDAD
Método directo (por destilación azeotrópica)
Aplicaciones: Alimentos no homogéneos, voluminosos (ej. Verduras secas)
Fundamento: La muestra de alimento se destila añadiendo tolueno o xileno. El azeótropo
formado, tolueno/agua (Peb. 84°C) o xileno/agua (Peb. 92°C), se separa debido a la
reducida densidad del tolueno o del xileno tras la condensación. El agua arrastrada se
mide al terminar la destilación con ayuda de un tubo graduado.
El solvente empleado debe ser inmiscible y menos denso que el agua, tener un punto de
ebullición superior pero próximo al del agua, y estar saturado de agua al momento de su
uso. Se recomienda el tolueno (PE 111C) frente al xileno (PE 137-140C) o el
tetracloroetileno (PE 121C) debido a que minimiza la descomposición térmica de los
componentes del alimento.
Determinación: El peso de la muestra depende de la cantidad de agua esperada, porque
el tubo de medida sólo tiene capacidad para 10 ml de agua. La muestra (unos 10-100 g) se
pesa con una precisión de 10 mg, se coloca en el balón y se agrega el tolueno saturado
de agua hasta cubrir la muestra. La capa acuosa del tolueno saturado estará bien
decantada y se cuidará de no trasvasarla al balón. Se adapta a éste la trampa graduada
de Dean-Stark, la que se carga con el solvente más 2 o 3 gotas de indicador (Sudán II o
Sudán III) y se conecta el refrigerante. El tubo del refrigerante y la trampa colectora deben
estar bien desengrasados, de lo contrario se observarán gotas de agua adheridas a las
paredes durante la destilación.
Se calienta a ebullición suave por espacio de 2 hs. Transcurrido dicho lapso, observar si no
destila más agua (la posición del meñisco no se modifica), dejar enfriar y efectuar la lectura
de la capa acuosa contenida en la trampa con una precisión de 0.1 ml.
Cálculos:
Contenido de agua % = VAgua x 100/gmuestra
Método indirecto
La determinación de la pérdida de humedad por medio de la elevación de la
temperatura, eventualmente con utilización complementaria de vacío, es el método más
antiguo para obtener el contenido en sustancia seca (componentes no volátiles del
alimento: fundamentalmente lípidos, carbohidratos, proteínas y minerales) o el
¨contenido de agua¨ de un alimento. Este método sólo es aplicable en el caso de
alimentos que no sufran ninguna transformación durante el secado térmico.
Preparación de la muestra: tratándose de muestras secas, triturarlas en mortero bien
seco o en molinillo a cuchillas lo más finamente posible. Si son muestras pastosas
(extracto de tomates, conserva de carnes, etc.), es conveniente tarar el cristalizador con
una pequeña cantidad de arena lavada y calcinada y con una varilla de vidrio pequeña
(que también ha de tararse conjuntamente con el cristalizador y la arena) y hacer una
pasta con la muestra. En esta forma, dada la división en que se encuentra el producto, el
desprendimiento de agua es más rápido y uniforme.
Determinación:
a) Secado directo: La desecación variará dependiendo del tipo de material, aunque en
cualquier caso debe continuarse hasta pesada constante. Por lo general, dependiendo del
m2 – m 1
siendo m1 peso del cristalizador vacío (en caso necesario con arena seca y
varilla de vidrio), en g
m2 peso del cristalizador (en caso necesario con arena seca y varilla de
vidrio) más la muestra antes del secado, en g
m3 peso del cristalizador (en caso necesario con arena seca y varilla de
vidrio) más la muestra después del secado, en g
(m2 – m1) = peso de la muestra
DETERMINACIÓN DE CENIZAS
Cenizas totales
Aplicación: Alimentos en general.
El concepto de residuo de incineración o de cenizas se refiere al residuo que queda tras la
combustión (incineración) completa de los componentes orgánicos de un alimento en unas
condiciones determinadas. Una vez que se eliminan otras posibles impurezas y partículas
de carbono procedentes de una combustión incompleta, este residuo se corresponde con
el contenido en minerales del alimento.
Fundamento: Se calcina/incinera la muestra (en caso necesario tras su desecación) a
550°C en la mufla y se calcula el residuo de incineración por diferencia de peso.
Determinación: Calcinar la cápsula de porcelana a 500-550°C (rojo sombra) en mufla,
enfriarla en desecador y pesarla al tomar temperatura ambiente. La pesada de la muestra
se realiza de acuerdo con la cantidad de ceniza esperada, de manera tal de obtener una
masa perfectamente pesable. Pesar la muestra a la décima de mg dentro de la cápsula
previamente calcinada y tarada.
- Muestras sólidas: Calentar sobre triángulo de pipas o tela metálica sobre mechero,
hasta residuo carbonoso. Luego calcinar en mufla a 500-550°C hasta cenizas blancas o de
color gris claro y peso constante. Enfriar en desecador y pesar al alcanzar la temperatura
ambiente.
- Muestras líquidas: Evaporar hasta sequedad a BM y continuar como lo especifica la
técnica para muestras sólidas.
Si las cenizas quedan con trazas de carbón, humedecerlas con un poco de agua (en
cápsula fría), romper las partículas de carbón con una varilla de punta achatada y evaporar
cuidadosamente a sequedad sobre triángulo o tela metálica antes de volver a calcinar.
Repetir este tratamiento tantas veces como sea necesario.
En el caso de muestras ricas en proteínas, que suelen ser más difíciles de incinerar,
normalmente es imprescindible humidificar las cenizas.
Las muestras ricas en grasa y muy combustibles se calientan hasta que se incendian
los vapores que desprenden y se dejan quemar apartados de la llama. Una vez disuelta la
muestra que se estaba quemando, la cápsula se introduce en la mufla.
Cálculos:
Cenizas % = (m2 – m1) x 100/gmuestra
DETERMINACIÓN DE GLÚCIDOS
I) Métodos basados en el poder reductor
Método de Fehling-Causse-Bonnans modificado (AOAC 1965, p. 495)
Reactivos:
- Solución F.C.B. (las drogas se disuelven en agua por separado y se mezclan en
el orden indicado, completando a 1 litro con agua destilada en matraz aforado).
Tartrato de sodio y potasio 130 gr
Hidróxido de sodio 110 gr
Sulfato de cobre cristalizado 24 gr
Ferrocianuro de potasio 16,8 gr
- Solución acuosa de azul de metileno al 1%
- Solución de glucosa o azúcar invertido 0,5%
1) Valoración del reactivo: En un erlenmeyer de 250 ml de capacidad se colocan
exactamente 10 ml de reactivo FCB, 30 ml de agua destilada y 2 o 3 trozos de porcelana
porosa y se calienta a ebullición. Una vez alcanzada ésta, se comienza a agregar desde la
bureta especial la solución patrón de azúcar a una velocidad de goteo controlada (medirla)
evitando interrumpir la ebullición. Cuando la coloración azul del reactivo disminuye de
intensidad o alcanza un tono celeste verdoso, se agregan 3 gotas de la solución acuosa de
azul de metileno y se continúa con el agregado de solución patrón, gota a gota, hasta
decoloración. La primera gota que torna a amarillo oro parte de la solución indica el punto
final. Se debe realizar esta valoración por duplicado.
Deben gastarse alrededor de 5-6 ml de la solución patrón para decolorar 10 ml de reactivo
de FCB. Si el volumen gastado cae fuera de estos valores hay que modificar la velocidad
de adición hasta lograr el valor indicado. La velocidad de goteo encontrada como óptima
será la empleada al valorar las soluciones problema.
Nota: No hace falta agitar el erlenmeyer con las manos, la misma ebullición sirve de
agitación.
Métodos no extractivos
Determinación de Proteínas totales: Determinación del nitrógeno total por
el Método de Kjeldahl (Método de Referencia)
Aplicaciones: Alimentos en general
Como consecuencia de su estructura a base de aminoácidos individuales, el contenido en
nitrógeno de las proteínas varía sólo entre unos límites muy estrechos (15 a 18%; en
promedio 16%). Para la determinación analítica del contenido en proteína total, se
determina por lo general el contenido de nitrógeno (N) tras eliminar la materia orgánica con
ácido sulfúrico (método de Kjeldahl), calculándose finalmente el contenido de proteína con
ayuda de un factor (en general f = 6,25). Se asume que el SO 3 que se forma durante el
tratamiento a altas temperaturas se adiciona como ácido de Lewis al grupo NH del enlace
peptídico (base de Lewis) de la proteína, formándose el correspondiente ácido
amidosulfónico, el que posteriormente se transforma en sulfato amónico por degradación.
El sulfato amónico se determina a continuación, tras liberación del NH 3 y destilación, por
medio de una valoración ácido-base.
Como en el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan sólo proteínas o
aminoácidos libres, sino también ácidos nucleicos y sales de amonio y también nitrógeno
ligado de compuestos orgánicos o vitaminas, el nitrógeno ligado orgánico se expresa como
¨nitrógeno total calculado como proteína¨ o como ¨proteína total¨ (N x f).
No obstante, como por lo general los alimentos sólo contienen cantidades traza de
compuestos aromáticos nitrogenados y de vitaminas, el error así cometido se considera
despreciable.
Fundamento: La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con ácido
sulfúrico concentrado en presencia de una mezcla catalizadora (las sales/óxidos metálicos
sirven para el transporte de oxígeno con formación intermedia de oxígeno naciente; el
sulfato potásico sirve para elevar el punto de ebullición, alcanzándose temperaturas de
300-400°C durante la digestión). Del sulfato amónico formado se libera el amoníaco por
tratamiento alcalino y éste se transporta con ayuda de una destilación en corriente de
vapor a un recipiente con ácido bórico y se realiza una titulación con una solución valorada
de ácido sulfúrico. El contenido en proteína de la muestra se calcula teniendo en cuenta el
contenido medio en nitrógeno de la proteína en cuestión.
Reactivos:
H2SO4 conc. p.a. (98%)
Catalizador: K2SO4 o Na2SO4 anhidro + CuSO4. 5 H2O p.a. (relación 10:1)
NaOH 40%
Solución H3BO3 4%
Solución H2SO4 0,2 N
Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol
Determinación:
a) Digestión: Colocar la cantidad adecuada de muestra (de acuerdo al contenido
estimado de nitrógeno) entre 0,1 y 4 g con una precisión de 1 mg, en un balón
Kjeldahl de 500 ml. Agregar 1 cucharadita de catalizador, perlas de vidrio y 15-20 ml de
H2SO4 conc. Todo el material debe estar sumergido en el ácido para que no haya
pérdidas de nitrógeno. Conectar el balón a la trampa de agua y calentar la mezcla
suavemente hasta que cese el desprendimiento de espuma; luego calentar
En los cálculos para convertir nitrógeno a proteínas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7
para cereales y soja y 6,38 para leche y derivados.
Aminooxidasas
NH3 + R-CH2-COOH
(Algunos son volátiles y
arrastrables por agua)
Hay acción sobre el óxido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada.
El láctico en el músculo es reductor y actúa sobre el O=N(CH3)3 (precursor).
CH3 CH3
I Enzimas I
H-C-OH + 2 O=N(CH3)3 2 N(CH3)3 + COOH + CO2 + H2O
I microbianas básico volátil
COOH volátil
d) Método de Bradford
Rango: 0.01-0.5 mg/ml
Reactivos:
Solución colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o
Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de ácido fosfórico 85% y
50 ml de etanol 95%. Una vez que el colorante se disolvió completamente, llevar a
1 litro con agua destilada fría.
NaOH 1M
Procedimiento: Prender el espectrofotómetro 15 min antes de usarlo. Poner 20l de
muestra en un tubo de hemólisis. Agregar 50l de NaOH 1N (alternativamente, el NaOH
puede agregarse al reactivo de color en la relación 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de
color e incubar 5 min. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno.
c) Método de Lowry
Se basa en la reacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con las proteínas. Si bien el
mecanismo de reacción no está bien dilucidado, se sabe que la tirosina, y en menor
extensión la cisteína, la cistina, la histidina y las uniones peptídicas, reaccionan reduciendo
al molibdato a azul de molibdeno. La reacción también puede producirse en presencia de
tungstato, para generar azul de molibdeno y tungsteno. El complejo da un color azul
característico que se mide a 745-750 nm. Los iones Cu2+ en medio alcalino facilitan la
reacción de reducción del reactivo de Folin formando un complejo con la unión peptídica a
través del nitrógeno involucrado en el enlace y reduciéndose a Cu1+. El Cu1+ y los residuos
involucrados reducen entonces al reactivo de Folin generando el color característico.
Interferencias
- Fenoles excepto nitrofenoles y otras sustancias reductoras (mercaptoetanol, ditiotreitol,
etc) por reducción del reactivo de Folin.
- Glicina: por disminuir la intensidad del color desarrollado.
- Sustancias o buffers que acidifiquen el medio.
- Agentes quelantes del cobre.
Rango: 0.05-0.4 mg/ml
Reactivos:
Na2CO3 2% en NaOH 0.1N: Solución A
CuSO4.5H2O 1.0%
Tartrato de Na y K 2%
Solución de Folin: Reactivo de Folin Ciocalteau diluido con agua destilada 1:1
Determinación: Se mezclan en el momento de la determinación volúmenes iguales de la
solución de CuSO4 y de la del tartrato. A esta mezcla la llamaremos solución B. Añadir 1ml
de la solución B a 50 ml de la solución A, para obtener la solución A+B.
Se prepara la dilución de la muestra que corresponda (200 l) a la que se le adiciona 1ml
de solución A+B. Agitar bien y dejar reposar 10 min.
Pasado este tiempo agregar 100 l del reactivo de Folin diluido. Agitar bien y dejar reposar
30 min. Leer absorbancia a 750nm
DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS
correspondiente. Tomar el butirómetro con un paño seco sujetando el tapón y agitar por
inversión suave pero efectiva. Verificar que esté bien tapado y colocarlo en un baño de
agua a 65-70 °C durante 5 a 10 minutos con el tapón hacia abajo. Retirar del baño, secarlo
y centrifugarlo en la centrífuga especial con los tapones hacia afuera. Llevar nuevamente a
baño de agua durante aproximadamente 5 minutos hasta que alcance la temperatura del
agua (65-70 °C) y leer de inmediato el volumen de fase grasa separada en la parte
superior graduada del butirómetro. El volumen leído corresponde directamente al
porcentaje de grasa en la leche.
Materia grasa en crema o manteca
Se utiliza un butirómetro similar al utilizado para leche, pero abierto en sus dos extremos y
con una copita de vidrio en el tapón que obtura la base, en la que se pesa la muestra. La
graduación del vástago es de 0 a 70.
Se pesan en la copita 4 a 5 g de muestra (algo menos en el caso de la manteca), se la
coloca en el butirómetro, se ajusta bien el tapón y por la otra boca se agregan 10 ml de
agua destilada, 10 ml de H2SO4 Gerber ( = 1,82) y 1 ml de alcohol amílico, se tapa, se
toma con un repasador y sujetando el tapón se agita hasta disolución total. Se coloca
luego durante 5 min en baño María a 60-70 °C con el bulbo hacia abajo. Conviene atar los
tapones, pues sino se corre el riesgo de que salten y se pierda la determinación. Una vez
cumplido el tiempo de calentamiento, se centrifuga 5 min en la centrífuga Gerber con el
ápice hacia adentro. Volver al baño María 5 min y leer inmediatamente el volumen que
ocupa la fase grasa.
Cálculo:
Lx5
materia grasa = --------- - 0,5 = g%
p
L: lectura en el butirómetro
5: porque el butirómetro está graduado para 5 gr de muestra.
p: gramos de muestra pesados.
0,5: factor de corrección.
Cálculo: