CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA, ETANOL Y

PROTEÍNAS

I. INTRODUCCIÓN

En un proceso biotecnológico es deseable el aumento de la población de los microorganismos a

los cuales se les refiere normalmente con el nombre de biomasa, así como también es deseable la
obtención de un producto secundario o resultante.

Para que la biomasa muestre un crecimiento en su población, es necesario que los

microorganismos cuenten con condiciones ambientales óptimas para su desarrollo. Estos
microorganismos tienen un metabolismo cambiante y poco predecible, lo cual indica; que si hay
cambios, aunque sean de poca magnitud en las condiciones (temperatura, pH, velocidad de
agitación, etc.), y los elementos que componen el medio ambiente en el cual se encuentran, afectan
de manera directa el desarrollo de los microorganismos impidiéndoles crecer. (Flores-Morfin, J.,
1999)

La gran mayoría de métodos instrumentales requieren una calibración, proceso que relaciona la
señal analítica medida con la concentración del analito. Uno de los métodos más frecuentemente
utilizados es el uso de una curva de calibración.

Para realizar el método de la curva de calibración se procede a realizar una serie de soluciones de
concentración conocida de analito, los cuales se introducen en el instrumento y se registra la señal
instrumental. Normalmente esta señal se corrige por medio de la señal de una blanco analítico en
el que se establece el cero de absorbancia, este blanco contiene todos los componentes de la matriz
de análisis (ejemplo: solución de glucosa, etanol) a excepción de analito que se desea medir.
(Skoog, D. A., 2001)

II. MARCO TEÓRICO

La medida de la concentración mediante un método instrumental se basa en la existencia de una

relación proporcional entre dicha concentración y la señal analítica o respuesta que genera un
instrumento.

Generalmente esta relación es lineal, de modo que puede expresarse como: y =a+b·CA,
donde CA es la concentración del analito, y la señal medida, a la ordenada en el origen y b la
pendiente de la recta.

La ecuación de la recta se obtiene mediante calibración con disoluciones de concentración

perfectamente conocida (disoluciones patrón) a partir de la medida de la señal analítica
proporcionada por éstas. Los pares de valores concentración-señal se ajustan a una recta, a partir
de la cual pueden obtenerse la concentración del analito en muestras desconocidas.

La sensibilidad de calibración es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en una curva de

calibrado lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a depender de la concentración, ya
que para que se cumpla y =a+b·CA las concentraciones deben tener una incertidumbre
insignificante.
La curva de calibración debe de presentar aspectos importantes como: Exactitud, precisión,
repetitividad, reproducibilidad. En general, la etapa de calibración y la obtención de la
concentración de analito en una muestra constan de los siguientes pasos:

 Preparación de los patrones

 Obtención de la relación señal-concentración
 Uso de la recta de calibrado

III. OBJETIVOS

La práctica tuvo como objetivos principales determinar la curva de calibración de azúcares

reductores usando DNS, así como también plantear la metodología de uso de este método analítico
para conocer los distintos parámetros que son importantes en el rendimiento de un bioproceso.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

 Agua destilada  Refractómetro de Abbe

 Tubo con tapa rosca  Reactivo DNS
 Balanza analítica  Glucosa

V. PROCEDIMIENTO

 Determinación de azúcares reductores

A.1. Método de DNS:

1. Se agregó 1ml de 1 sobrenadante obtenido (que contenga 20-200mg de glucosa en 1000

mL), en tubos con tapa rosca y 1ml del reactivo de DNS por las paredes del tubo. Se tapó
con tapa rosca y agitarlos.
2. Se colocó la muestra en ebullición durante 5’
3. Posteriormente se añadió 10 ml de agua destilada, agitar y dejar en reposo por 20’.
4. Se leyó la absorbancia a 540nm contra un blanco que contiene agua destilada.
5. La concentración se obtendrá por interpolación de la absorbancia con la curva de
calibración del carbohidrato o de acuerdo de la ecuación de la recta.
6. Se expresó el resultado en g/L de Glucosa.

A.2. Solución de DNS (25 ml)

1. Disolver 0,4 g de NaOH en 12.5 ml y agregar 7.5 g de tartrato sódico potásico, calentar
hasta disolverlo.
2. Lentamente adicionar 0,25 g de ácido 3,5-dinitrosalicilico agitando bajo calentamiento.
3. Aforar a 25 ml con agua destilada. Almacenar a temperatura ambiente en botellas oscuras.
4. Realizar la determinación de azucares reductores mediante a 1ml con agua destilada.
5. Elaborar una gráfica relacionando las absorbancias con las concentraciones y determinar
el rango lineal.

 Determinación de proteínas
 *El siguiente procedimiento fue planteado en práctica mas no se pudo realizar por deficiencia de
reactivos, Los resultados en la parte del final del informe, fueron extraídos de prácticas realizadas
anteriormente.

B.1. Método Bradford

1. Agregar 0.1ml de muestra conteniendo 10 a 100 ug de proteína, en tubos 13x100.

2. Al tubo anterior agregar 2 ml del reactivo de coloración de proteína. Mezclar por
inversión o por agitación suave.
3. Leer la absorbancia a 595nm después de 5 min contra un blanco reactivo.
4. Elaborar una gráfica relacionando las absorbancias con las concentraciones y determinar
el rango lineal.

VI. RESULTADOS
 Curva de calibración de azucares

Tabla 1. Resultados final de absorbancia en la Prueba DNS

Tubo Solución estándar de Agua Concentración Absorbancia
N° Glucosa (0.1 g. en 50 Destilada (g/L) (540 nm)
ml.) en ml. (ml.)
1 0 1 Blanco 0.008
2 0.1 0.9 0.2 0.086
3 0.2 0.8 0.4 0.171
4 0.3 0.7 0.6 0.288
5 0.4 0.6 0.8 0.385
6 0.5 0.5 1.0 0.493
7 0.6 0.4 1.2 0.595
8 0.7 0.3 1.4 0.723
9 0.8 0.2 1.6 0.815
10 0.9 0.1 1.8 0.919
11 1 0 2 1.043

Figura 1. Muestras para la determinación de azucares en DNS

 y = 0.5236x - 0.0212
Curva de Calibración de la Glucosa R² = 0.9983
1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
-0.2

 Curva de calibración de proteínas

TUBO Stock / uL H20 Concentración Abs. 595nm

N° destilada uL
1 0 300 0 0.002
2 10 290 10 0.008
3 20 280 20 0.015
4 30 270 30 0.025
5 40 260 40 0.028
6 50 250 50 0.045
7 60 240 60 0.049

Tabla 2. Resultados final de absorbancia en prueba Bradford

Curva de calibración para Proteínas y = 0.0008x + 0.0001

R² = 0.9763
0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0
0 10 20 30 40 50 60 70
VII. DISCUSIÓN

VIII. CONCLUSIONES

 Se desarrolló con eficacia un procedimiento para determinar la concentración de

(azúcares reductores) por el método del ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS); la
determinación de estos azúcares se realizó para obtener una curva de calibración,
con este reactivo (DNS) que tiene capacidad de oxidar a los azúcares reductores
dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de
540nm en el espectrofotómetro.
 Las gráficas muestran resultados satisfactorios ya que el valor de R, obtenidos
tanto en la prueba de azúcares como de Proteínas fueron de 0.9983 y 0.9763
respectivamente.
 Existe una relación entre intensidad de color y la concentración de la sustancia,
con base en la Ley de Lambert-Beer podemos afirmar que la absorbancia de una
solución es directamente proporcional a su concentración a mayor número de
moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor distancia
recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende
de ε, una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que
es específica de cada cromóforo.

IX. BIBLIOGRAFÍA
1. Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman (2001) Principios de Análisis Instrumental. 5
ta Edición, Editorial McGraw‐Hill.
2. Gamero-Inda, E.; Flores-Morfin, J.; “Fuzzy control of a biotechnology process” Fuzzy
Information Processing Society, 1999. NAFIPS.