DETERMINACIÓN DE LA ANTIGLOBULINA DIRECTA O COOMBS DIRECTO.

OBJETIVO
Llevar al estudiante de microbiología a determinar en un donante o receptor la sensibilización in vivo o in vitro de
los hematíes por anticuerpos o por fracciones del complemento, al ejecutar el procedimiento, analizar el
fundamento e interpretar los resultados de la prueba.

DEFINICIÓN:
Se cree que el principio de la prueba de Antiglobulina fue inicialmente descrito por Moreschi en 1908. En
medicina transfusional esta prueba solo fue introducida en el año 1945 cuando Coombs, Mourant y Race
demostraron que por medio de esta se podía detectar anticuerpos no aglutinantes anti Rh en el suero.

Posteriormente los mismos autores demostraron la utilidad de la prueba para determinar la sensibilización In Vivo
de los hematíes por anticuerpos, en niños con enfermedad hemolítica. En 1957 Dacie y colaboradores demostraron
que la prueba era igualmente buena para determinar la sensibilización de los hematíes por fracciones del
complemento.

El suero antiglobulina Humana se obtiene inyectando conejos con purificados de IgG humana y fracciones del
complemento (C3d); el conejo así sensibilizado con las globulinas humanas producirá anticuerpos contra la IgG
humana y contra el componente C3d del complemento.

El suero antiglobulina puede ser adquirido comercialmente con diferentes especificidades, el mas usado es el
poliespecifico, es decir, que contiene tanto actividad anti IgG como antiC3d; la actividad anti IgG del reactivo está
dirigida contra la porción Fc de la IgG humana, de igual forma se puede conseguir el reactivo con especificidad
anti-IgG o anti-C3d por separado.

Por su parte si hematíes humanos son sensibilizados IN VIVO o IN VITRO con IgG o C3d y posteriormente son
puestos a reaccionar con el suero antiglobulina, estos serán aglutinados evidenciando la reacción Ag-Ac.

METODOS
La determinación de la prueba de antiglobulina directa o coombs directo puede hacerse por los métodos en tubo.

FUNDAMENTO
El principio de la prueba de antiglobulina directa o coombs directo es determinar la sensibilización de los hematíes
in vivo o in Vitro por anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o fracciones del complemento, específicamente C3d; en
otras palabras, consiste en detectar la presencia de anticuerpos sobre la superficie eritrocitaria a través de la
globulina polivalente o antiglobulina de coombs. A nivel de Laboratorio, consiste en mezclar los glóbulos rojos del
paciente, donante o receptor con el suero de coombs o antiglobulina para observar la aparición o no de
aglutinación; si la superficie eritrocitaria posee los anticuerpos, la presencia de aglutinación indica positividad.

La sensibilización de los hematíes puede ocurrir In Vivo o In Vitro.

Cuando la sensibilización ocurre In Vivo, la reacción Ag-Ac ocurre dentro del organismo humano, tal es el caso de
la anemia hemolítica autoinmune (AHAI), la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), La anemia
hemolítica inducida por drogas y las reacciones transfusionales debidas a anticuerpos.

Por su parte, la sensibilización In Vitro ocurre en el Laboratorio, en donde los hematíes son manipulados para
facilitar su sensibilización con los anticuerpos y esta a su vez es determinada por el suero antiglobulina.

Como se mencionó anteriormente esta prueba es útil para confirmar el diagnóstico de la anemia hemolítica
autoinmune (AHAI), la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), La anemia hemolítica inducida por
medicamentos y en la investigación de reacciones transfusionales.
La prueba es sencilla de realizar y para tener resultados de calidad solo basta con lavar escrupulosamente los
hematíes para remover las inmunoglobulinas y el complemento no unidos a las células ya que puedan interferir en
las prueba.

MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA, ACD, CPD, CPDA-1
Glóbulos rojos lavados 3-4 veces y suspendidos en solución salina.
Sangre coagulada puede utilizase siempre y cuando del coagulo logren desprenderse suficientes hematíes, los
cuales serán lavados y suspendidos en SSF.

Las muestras deben ser procesadas inmediatamente.

Los tubos que contienen gel de silicona no deben usarse para esta prueba debido a que los resultados obtenidos son
Falsos Positivos, porque las partículas de gel al desprenderse pueden simular una reacción de aglutinación.

MATERIALES Y REACTIVOS
Pipetas pasteur o de transferencia.
Lámpara.
Solución salina fisiológica 0.9%
Tubos de 10 o 12 x 75
Gradillas
Centrífuga serológica.
Suero de antiglobulina humana o coombs el cual puede ser de tres tipos:
 Suero antiglobulina humana IgG + C3d (Poliespecifico) mas comúnmente utilizado.
 Suero antiglobulina IgG : contiene anti IgG sin actividad anticomplemento.
 Anti C3d: contiene anticuerpos que reaccionan contra el complemento.
Células reactivas O positivas.
Células sensibilizadas con IgG (Células contról de coombs) Controlan la actividad del suero antiglobulina y la
calidad del lavado de las células.

PROCEDIMIENTO
 En caso de utilizar muestra coagulada, centrifugar la muestra x 10 min. a 3000 rpm, separar de la muestra
en estudio, el suero de los glóbulos rojos. El suero debe colocarse en otro tubo debidamente identificado.
 Colocar en un tubo aparte, identificado, una alícuota de los glóbulos rojos en estudio y lavarlos 3-4 veces
con solución salina fisiológica para eliminar proteínas anormales y anticuerpos indeseables y complemento.
 Después del último lavado eliminar el sobrenadante y preparar una suspensión celular al 5% con SSF.
 Marcar tres tubos así,

Paciente Control Positivo Control Negativo

Suero Antiglobulina 1 gota 1 gota 1 gota
Humana - Coombs
Células del paciente 1 gota
lavadas al 5%
Células Sensibilizadas 1 gota
Células Reactivas O+ 1 gota

 Mezclar cada tubo, centrifugar por 15 a 30 segundos

 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación con la ayuda
de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Si no observa aglutinación, incube el tubo 5-10 minutos a temperatura de laboratorio y centrifugue para
volver a leer. Este procedimiento es adecuado cuando se quiere evidenciar la sensibilización de los hematíes
por fracciones del complemento (C3d) puesto que la incubación incrementa la sensibilidad de la reacción.
 Sin embargo, es conveniente tener en cuenta que cuando se observan reacciones débiles de aglutinación
debidas a actividad anti IgG , la incubación y recentrifugación puede negativizar la reacción, arrojando un
falso resultado negativo.
 El contról positivo debe aglutinar 2+ , el no observar aglutinación en este paso invalida la prueba, ya que
sugiere un mal lavado de las células o la inactivación del reactivo.

INTERPRETACIÓN.

La aglutinación de los hematíes por el Suero Antiglobulina Humana Coombs indica que estos fueron
sensibilizados In Vivo con anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o con fracciones del complemento C3d.

El resultado será reportado como Coombs Directo o Prueba de la Antiglobulina Directa: Positiva, indicando el
grado de aglutinación ( D a 4+)

La no aglutinación indica que no hubo sensibilización In Vivo de los hematíes o que a pesar de haberla, la
sensibilidad de la prueba no es suficiente para detectarla ya que es conocido que se necesitan más de 120 moléculas
de IgG sensibilizando el GR para que este pueda ser aglutinado por el suero antiglobulina.

Si el coombs directo resulta positivo se debe realizar un Coombs Directo Fraccionado para determinar si la
sensibilización es por IgG o C3d utilizando sueros antiglobulina monoclonales específicos para cada uno.

COOMBS DIRECTO FRACCIONADO:

Marcar tres tubos así,

Anti IgG Anti C3d Control Negativo

Suero antiglobulina 1 gota
IgG
Suero anti C3d 1 gota
Células del paciente 1 gota 1 gota 1 gota
Solución salina 1 gota
Mezclar cada tubo, centrifugar por 15 a 30 segundos
Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación con la ayuda de una
lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
Si no observa aglutinación en el tubo marcado C3d , incube el tubo 5-10 minutos a temperatura de laboratorio y
centrifugue para volver a leer puesto que la incubación incrementa la sensibilidad de la reacción.

Interpretación:
Se debe leer como positivos los tubos que presenten aglutinación definiendo así la característica del anticuerpo que
esta sensibilizando los GR y se interpretaría de la siguiente manera:

IgG C3d Tipo de Acs Realizar

+ + IgG fija Eluado
complemento
+ - IgG No fija Eluado
complemento
- + IgM fija No Eluado
complemento

ELUADO: Desprender del estroma del GR los anticuerpos que lo están sensibilizando.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA POSITIVA
 Anemias hemolíticas autoinmunes.
 Enfermedad hemolítica del recién nacido.
 Anemia hemolítica por medicamentos.
 Reacciones transfusionales.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA NEGATIVA
 Anemias Hemolíticas por defectos intrínsecos del GR.

CAUSAS DE ERROR O DIFICULTADES EN LA DETERMINACIÓN DE LA PRUEBA DE

ANTIGLOBULINA DIRECTA O COOMBS DIRECTO
Falsos positivos:
 Hematíes contaminados por manejo y almacenamiento inadecuado.
 Tiempo de centrifugación excesiva.
 Sensibilización in Vitro producida por anticuerpos o por el complemento cuando se deja reposar la muestra
a 4oC durante algún tiempo.
 Suero de coombs que contenga Acs inespecíficos que reaccionan con células no sensibilizadas.
 Presencia de albúmina en el suero de coombs
 Reacción con sílice coloidal de los tubos de vidrio.
Falsos negativos:
 Lavado deficiente de los hematíes., trazas de Igs y complemento no fijados pueden inactivar el reactivo de
antiglobulina.
 Cuando el anticuerpo se eluye de las células durante la incubación o el lavado. Para evitarlo se debe
adicionar el suero antiglobulina una vez se terminen los lavados de los hematíes.
 Deterioro del suero antiglobulina por contaminación o almacenamiento inadecuado.
 Cuando el suero antiglobulina no se añade al sistema.
 Centrifugación inadecuada.
 GR viejos.
 Agitación vigorosa durante el proceso de lectura, desvanece las reacciones débiles.

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA O COOMBS INDIRECTO

La prueba de coombs es un método serológico que consiste en la demostración de la presencia de anticuerpos
antiglobulinas, las cuales pueden estar unidas a los GR sensibilizándolos (coombs directo) o libres en el suero o
plasma sanguíneo (coombs indirecto).

La prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto puede ser dividida en cuatro fases:

Fase de sensibilización: En esta los hematíes son incubados in vitro con el suero, la sensibilización depende de
variables como la temperatura, el medio de reacción, la proporción células/suero y el tiempo de incubación.

Fase de lavado: Tiene como propósito eliminar los anticuerpos y/o el complemento no unido a los hematíes. Las
variables que la afectan son: tiempo de lavado, volumen de la salina utilizada, residuo de salina entre lavado y
lavado, velocidad y tiempo de centrifugación.

Fase de antiglobulina y lectura: en la cual se trata de evidenciar si los hematíes fueron sensibilizados in vitro con
anticuerpos tipo IgG y/o complemento C3d. Las variables que pueden afectar esta fase son el volumen del suero
antiglobulina, la velocidad y tiempo de centrifugación y el modo de realizar la lectura de la prueba.

Fase de contról: Al igual que para la prueba de antiglobulina directa, cuando no se observa aglutinación de los
hematíes con el suero antiglobulina, debe controlarse la prueba con células sensibilizadas (Contról de coombs)
FUNDAMENTO:
La prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto detecta la especialidad de un anticuerpo incompleto que al
unirse a un antigeno celular correspondiente, In Vitro, no es capaz de aglutinarlo directamente sino, que se necesita
la antiglobulina humana para conseguir la aglutinación y así comprobar la existencia del anticuerpo. En otras
palabras, lo que se quiere detectar es la presencia de anticuerpos libres en el suero.

Por lo tanto, el principio de la prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto es determinar la sensibilización
In Vitro de los hematíes con moléculas de anticuerpos no aglutinantes IgG y/o fracciones del complemento( C3d).
En otras palabras es detectar en el suero de los donantes la presencia de anticuerpos irregulares de tipo IgG e IgM,
mediante el uso de glóbulos rojos que poseen antígenos conocidos. La característica fisicoquímica de los
anticuerpos en estudio hace necesario la utilización de temperaturas y medios de reacción diferentes para su optima
detección.

En la prueba los hematíes y el suero que contiene los anticuerpos y el complemento son incubados(tiempo y
temperatura adecuados) bajo la acción de un potenciador que generalmente es albúmina, soluciones de bajo poder
iónico o policationes.

Posteriormente los hematíes son lavados para eliminar las inmunoglobulinas y/o el complemento unido.

Paso seguido se hacen reaccionar los hematíes con el suero antiglobulina.

Si los hematíes son aglutinados por el suero antiglobulina humano, indica que han sido sensibilizados In Vitro por
anticuerpos tipo IgG y/o por complemento ( C3d).

En la prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto puede estar involucrado uno de los tres eventos
siguientes:

1. Que los hematíes utilizados sean de composición antigénica conocida, mientras que el suero corresponda a
un individuo en quien la presencia de anticuerpos contra los antígenos eritrocitarios es desconocida. Las
células de composición antigénica conocida se obtienen comercialmente como “células pantalla” (células
I y II) y panel de células para la identificación de anticuerpos inesperados. Ej: Rastreo de anticuerpos
irregulares.
2. Los hematíes utilizados son de composición antigénica desconocida, es decir, pertenece a un individuo al
cual queremos determinar la presencia de un antígeno específico, por su parte el suero es comercial y de él
se sabe la especificidad del anticuerpo que contiene.
3. Los hematíes son de composición antigénica desconocida y en el suero no sabemos si existen anticuerpos
inesperados o irregulares contra los antigenos eritrocitarios. Ej. Cuando se realizan las pruebas cruzadas, en
la cual se hace reaccionar hematíes del donante con suero o plasma del receptor (prueba cruzada mayor) .

MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA , ACD, CPD, CPDA-1
Glóbulos rojos lavados 3-4 veces y suspendidos en solución salina.
Sangre coagulada puede utilizase siempre y cuando del coagulo logren desprenderse suficientes hematíes, los
cuales serán lavados y suspendidos en SSF.

Las muestras deben ser procesadas inmediatamente.

MATERIALES Y REACTIVOS
Pipetas pasteur o de transferencia.
Lámpara.
Solución salina fisiológica 0.9%
Tubos de 10 o 12 x 75
Gradillas
Centrífuga serológica.
Suero de antiglobulina humana o coombs el cual puede ser de tres tipos:
 Suero antiglobulina humana IgG + C3d (Poliespecifico) mas comúnmente utilizado.
 Suero antiglobulina IgG : contiene anti IgG sin actividad anticomplemento.
 Anti C3d: contiene anticuerpos que reaccionan contra el complemento.
Células reactivas O positivas.
Potenciador de baja concentración iónica, lo-ion ó albumina.
Células sensibilizadas con IgG (Células contról de coombs) Controlan la actividad del suero antiglobulina y la
calidad del lavado de las células.

PROCEDIMIENTO COOMBS INDIRECTO CUALITATIVO:

 Centrifugar la muestra x 10 min. a 3000 rpm, separar de la muestra en estudio, el suero o plasma de los
glóbulos rojos y colocarse en otro tubo debidamente identificado.
 Marcar tres tubos así,

Paciente Control Positivo Control Negativo

Suero del paciente 2 gota
Anti D dil1/10 en SS 2 gota
Solución salina 2 gota
Células Reactivas O+ 1 gota 1 gota 1 gota

 Mezclar cada tubo, y centrifugue por 5 segundos.

 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación con la ayuda
de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Adicione a cada tubo una gota del potencializador.
 Mezclar cada tubo, incubar a 37 oC, dependiendo del potencializador, así será el tiempo de incubación: Lo-
ion:15 minutos, albúmina 30 minutos.
 Centrifugar por 5 segundos.
 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación con la ayuda
de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Si no observa aglutinación o sea dan negativos, realice 3-4 lavados con solución salina 0.85% ; decantando
en el último lavado toda la solución salina.
 Adicione a cada tubo una gota de suero antiglobulina de coombs.
 Mezclar cada tubo, y centrifugue por 5 segundos.
 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación con la ayuda
de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Si el resultado de los tubos después de la fase de coombs es negativo, debe proseguir a la realización del
contról de coombs, adicionando a cada tubo una gota de células sensibilizadas. Centrifugar 5 segundos y
leer por aglutinación.
 Todos los tubos deben aglutinar 2+ , el no observar aglutinación en este paso invalida la prueba, ya que
sugiere un mal lavado de las células o la inactivación del reactivo.

INTERPRETACIÓN.

La ausencia de aglutinación de los hematíes por el suero del donante o paciente al adicionar el Suero Antiglobulina
Humana Coombs indica que estos no fueron sensibilizados In Vitro con anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o con
fracciones del complemento C3d y se informa como Prueba de Coombs Indirecta Cualitativa Negativa

La aglutinación de los hematíes por el suero del donante o paciente al adicionar el Suero Antiglobulina Humana
Coombs indica que estos fueron sensibilizados In Vitro con anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o con fracciones
del complemento C3d y se informa como Prueba de Coombs Indirecta Cualitativa Positiva
Si la prueba de antiglobulina indirecta o coombs indirecto cualitativo da positivo se debe realizar el coombs
indirecto cuantitativo.

PROCEDIMIENTO COOMBS INDIRECTO CUANTITATIVO

La cuantificación del coombs indirecto es importante para saber los títulos en que están los anticuerpos presentes y
el Score que es la interpretación de las cruces de las diluciones positivas en la prueba cuantitativa: para la parte
medica una titulo de 64 tal vez no es tan peligroso pero si lo puede ser un un Score de 32.

Resultado Score
4+ 12
3+ 10
2+ 8
1+ 5
W 2

 Realizar diluciones seriadas del suero del paciente (Ac IgG Libres); con solución salina 0.85% de acuerdo
al grado de aglutinación.
 Marcar 11 tubos; desde 1/1 hasta 1/1024.
 Al tubo 1/1 y ½ adicionar 100 lambdas de suero del paciente.
 A partir del tubo ½ hasta el ultimo tubo adicionar 100 lambdas de solución salina 0.85%.
 Mezclar el tubo ½ , sacar 100 lamdas y adicionarla al tubo ¼; luego mezclar el tubo ¼ y sacar 100 lambdas
de la dilución y adicionarla al tubo 1/8 y así sucesivamente .
 Agregar a todos los tubos 100 lambdas de células reactivas O positivas, desde el tubo 1/1 hasta 1/512.
 Centrifugar cada tubo 5 segundos y leer por aglutinación. En caso de dar positivos anotar el grado de
aglutinación de cada dilución positiva. Esto constituye la fase salina de la prueba y detecta la presencia de
anticuerpos tipo IgM Acs fríos.
 Si todos los tubos son negativos adicionar 1 gota del potencializador (albúmina, Lo-ion, Liss etc) incubar a
37oC el tiempo estipulado dependiendo del potencializador.
 Mezclar, centrifugar 5 segundos cada tubo y leer. En caso de dar positivos anotar el grado de aglutinación
de cada dilución positiva. Esta constituye la fase proteica y detecta anticuerpos tipo IgG
 Si todos los tubos son negativos realizar 3-4 lavados a cada tubo con solución salina, después del último
lavado decantar toda la solución salina.
 Adicionar a cada tubo 1 gota de suero antiglobulina de coombs.
 Mezclar, centrifugar 5 segundos cada tubo y leer. En caso de dar positivos anotar el grado de aglutinación
de cada dilución positiva. Esto constituye la fase de coombs de la prueba y detecta la presencia de
anticuerpos especiales.
 Realizar el contról de coombs a los tubos negativos adicionando 1 gota de células sensy
 Centrifugar y leer. Deben aglutinar.
INTERPRETACIÓN.

Informar positivos hasta la máxima dilución donde exista aglutinación. Ejemplo si el Coombs indirecto positivo 32
Dils se debe informar el Score teniendo en cuenta los valores a que corresponde cada grado de aglutinación así:
Prueba de Coombs Indirecta Cuantitativa Positiva 32 Dils, Score: 55. Score con valores superiores a 32 se
consideran de mal pronóstico.

APLICACIONES:
 Detección e identificación de anticuerpos anti-eritrocitarios en los sueros.
 Determinación de antígenos eritrocitarios ya que muchos antígenos precisan antisueros específicos seguidos
de la prueba de antiglobulinas.
 Determinación de incompatibilidad.
  Estudios especiales para definir anticuerpos contra leucocitos y plaquetas.
 En anemias hemolíticas de origen inmediato, con el fin de conocer la especificidad de los Ac unidos al GR.
 Pruebas cruzadas en transfusiones.
 Anticuerpos incompletos anti- Brucella, se usa suspensión de Brucella como antigeno.

Falsos positivos:
 Contaminación bacteriana de muestras de sangre, reactivos y material de vidrio.
 Hematíes sensibilizados In Vivo. Se debe realizar elusión de los anticuerpos fijados a las células
 Contaminación de la solución salina fisiológica con sílice coloidal.
 Por aglutinación antes de añadir el suero de coombs debido a: Presencia de células poliaglutinables,
Incubación prolongada con células tratadas enzimáticamente. Presencia de anticuerpos inesperados en el
suero de coombs.
 Exceso de centrifugación
 Coagulo de fibrina en la suspensión celular.

Falsos negativos:
 Contaminación con proteínas sericas.
 Destrucción de anticuerpos por lavado excesivo.
 No adicionar el suero antiglobulina.
 Centrifugación inadecuada o mal empleo de los reactivos.
 Lavados deficientes, no se eliminan las proteínas y neutralizan el suero de coombs.

COOMBS INDIRECTO: RASTREO DE ANTICUERPOS IREREGULARES

En el suero de los donantes y receptores se debe estudiar la presencia de anticuerpos irregulares de tipo IgG e IgM
mediante el uso de Glóbulos Rojos que poseen antígenos conocidos y que son distribuidos comercialmente como
panel de células I y II ( células pantalla), cada una de ellas con una gran variedad de antigenos. Estas células son
preparadas a partir de sangre donada por personas de grupo sanguíneo O. Una vez determinada la presencia de los
antígenos D,E,C,k.Ketc, las células son preservadas con agentes que retardan la hemólisis y mantienen el poder
antigenico durante el tiempo de almacenamiento.

El objetivo de realizar la detección de anticuerpos inesperados o irregulares en los donantes es prevenir la

transferencia pasiva de anticuerpos al receptor, disminuyendo el riesgo de reacciones post-transfusionales.

Por otro lado, cuando se realiza el rastreo o investigación de anticuerpos inesperados a los donantes y se obtienen
resultados negativos, se acortan en tiempo las pruebas cruzadas, dado que se obvia la realización de la prueba
cruzada menor.

Para la determinación de anticuerpos irregulares se realiza el método de coombs indirecto como se describió
anteriormente utilizando los medios de reacción: Salino. Albumina o proteico y Antiglobulina o Suero de Coombs.

Cuando se detecta un anticuerpo irregular se debe identificar o determinar la especificidad del anticuerpo
utilizando un panel de células o de glóbulo rojos –Panoscreen cuya composición antigénica es conocida, se
consiguen comercialmente y constan de 8 a 16 viales separados en los que vienen células de un donante en
particular cuya composición antigénica es conocida, su presencia es similar a las células pantalla I y II; para su
detección se utilizan cuatro medios de reacción: Salino. Albumina, Enzimas y Antiglobulina o Suero de Coombs.

El panel es preparado de tal forma que existe en él suficientes células positivas y negativas para cada antígeno en
medicina transfusional.

En general los antígenos que se consideran son:

 Del sistema Rh los antígenos. D,C,E,e,c,v,f,cw
 Del sistema Kell los antígenos K,k,Kpa,Kpb,Jsa,Jsb.
 Del sistema Duffy los antígenos Fya y Fyb
  Del sistema Kidd los antígenos Jka y Jkb
 Del sistema Lewis los antígenos Lea y Leb
 Del sistema P los antígenos PI
 Del sistema MN los antígenos M,N,S,s
 Del sistema Lutheran los antígenos Lua y Lub
 Del sistema Xg los antígenos Xga

La importancia de identificar el anticuerpo hallado en el suero de un individuo radica en que si se trata de un

receptor de sangre, conocer la identidad del anticuerpo que posee permite seleccionar sangre negativa para el
antígeno brindándole mayor seguridad a la transfusión.

El rastreo de anticuerpos nos guía sobre la presencia en el suero de aloanticuerpos o de autoanticuerpos o una
combinación de ambos. Además nos permite evidenciar:
 La fase en que ocurre la reacción de aglutinación y /o hemólisis.
 Si la reacción de aglutinación varia de una fase a otra.
 Si el autocontrol es positivo o negativo.

Las características de los paneles de células son:

 Suspendidas en soluciones preservativas y nutrientes.
 Fecha de vencimiento 35 días.
 Conservación 1-10oC
 Contról de apariencia antes de su uso.
 Loa Ag P1, Lea , fy a se deterioran durante el almacenamiento.

La investigación de anticuerpos irregulares se debe realizar en:

 Donantes de sangre.
 Candidatos a recibir transfusiones.
 Mujeres embarazadas.
 Reacciones hemolíticas transfusionales.
 Anemia hemolítica autoinmune.
 Aclarar discrepancias sericas en ABO.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA CRUZADA

OBJETIVO
Llevar al estudiante de microbiología a determinar la compatibilidad serológica entre la sangre del paciente o
receptor y del donante , al ejecutar el procedimiento , analizar el fundamento e interpretar los resultados de la
pruebas cruzadas mayor y menor.

DEFINICIÓN:
Una vez se han seleccionando unidades de sangre de donantes de los tipos ABO y Rh adecuados para el receptor,
se hacen pruebas para determinar la compatibilidad serológica entre la sangre del paciente y la del donante; a estas
pruebas se les denomina Pruebas Cruzadas; y fueron introducidas por Hektoen en 1907 para detectar
incompatibilidades ABO.

Las pruebas cruzadas son el estadio final en el que los en el que los hematíes del donante y el suero del paciente se
prueban directamente en la prueba en tubo en unas condiciones que permitan que los antigenos y los anticuerpos
tengan todas las oportunidades razonables de interacción y de producir un resultado demostrable; Los resultados
positivos, es decir, la aglutinación o hemólisis de los hematíes probados, indican incompatibilidad, mientras que los
resultados negativos indican compatibilidad.
Por lo tanto, las pruebas cruzadas tienen como propósito garantizar la compatibilidad serológica entre la muestra
de sangre del receptor y la o las unidades de sangre o componentes que se le pretendan transfundir. Al ser el
objetivo de estas pruebas prevenir la transfusión de sangre incompatible ,las pruebas cruzadas deben garantizar:
 La compatibilidad ABO y Rh entre el receptor y la unidad que se pretende transfundir.
  Que en el suero del receptor no existan anticuerpos contra los antigenos eritrocitarios del donante.
 Que en el plasma de la unidad de sangre no existan anticuerpos contra antígenos eritrocitarios del receptor.

Las pruebas cruzadas son un estadio final esencial antes de la transfusión por:
 La posibilidad de detectar un error en la determinación de grupos sanguíneos del donante y receptor.
 La posibilidad de que no se hallan detectado anticuerpos inesperados o irregulares en las pruebas
preliminares.

Las pruebas cruzadas han sido divididas en dos categorías:

 La prueba cruzada mayor: Es la mas importante y tiene como propósito determinar que en el suero del
receptor no existan anticuerpos de importancia clínica contra los antígenos eritrocitarios del donante.
 La prueba cruzada menor: Es la que pretende determinar que en el suero o plasma del donante (Unidad a
transfundir) no existan anticuerpos contra los hematíes del receptor. Esta puede dejarse de realizar siempre
y cuando el banco de sangre realice detección o rastreo de anticuerpos irregulares a todos sus donantes.
METODOS
La ejecución de las pruebas cruzadas requiere de la realización de unos procedimientos previos, entre los cuales se
cuentan:
 La clasificación ABO y RH del receptor y donante.
 Rastreo de anticuerpos inesperados a los donantes.

La determinación de la prueba cruzadas puede hacerse por los métodos en tubo y consta de tres fases:
 Fase salina: Pone en evidencia los anticuerpos contra los antígenos del sistema ABO.
 Fase proteica: Pone en evidencia anticuerpos tipo IgG.
 Fase de coombs: Pone en evidencia los anticuerpos incompletos e irregulares como el Kidd, Duffy, Kell etc.
FUNDAMENTO
Los anticuerpos irregulares presentes en el suero del receptor o donante se detectan, por combinación de técnicas,
poniéndolas a reaccionar in vitro frente a determinantes antigénicos presentes en los glóbulos rojos del dador o del
receptor, utilizando varias fases o medios con diferentes temperaturas de incubación.
MUESTRA:
La muestra del paciente o receptor debe ser:
 Muestra anticoagulada con Edta o células la cual servirá para rechequear los grupos sanguíneos ABO y Rh
y para el autocontrol.
 Muestra de suero (preferiblemente) o plasma que será utilizada para la prueba cruzada mayor y el rastreo de
anticuerpos inesperados.
De la unidad de sangre se toma la muestra cortando un segmento del tubo piloto de que está provista la bolsa
plástica de recolección de sangre.
MATERIALES Y REACTIVOS
Pipetas pasteur o de transferencia.
Lámpara.
Solución salina fisiológica 0.9%
Tubos de 10 o 12 x 75
Gradillas
Centrífuga serológica.
Baño María o bloque seco a 37 oC
Potenciadores: albúmina o medios de bajo poder iónico.
Suero de antiglobulina humana o coombs
Células reactivas O positivas.
Células sensibilizadas con IgG (Células contról de coombs) Controlan la actividad del suero antiglobulina y la
calidad del lavado de las células.
Células pantalla I y II
PROCEDIMIENTO
  Centrifugar las muestra del donante y receptor x 10 min. a 3000 rpm, separar de la muestra en estudio, el
suero o plasma de los glóbulos rojos. El suero o plasma del donante y receptor deben colocarse en otro
tubo debidamente identificado.
 Colocar en un tubo aparte, identificado, una alícuota de los glóbulos rojos en estudio tanto del donante
como del receptor y lavarlos 3-4 veces con solución salina fisiológica para eliminar proteínas anormales y
anticuerpos indeseables y complemento.
 Después del último lavado eliminar el sobrenadante y preparar una suspensión celular al 5% con SSF.
 Marcar cinco tubos así,

Prueba CI C II Prueba Ac
mayor menor
Suero paciente o 2 gotas 2 gotas 2gotas 2 gotas
receptor
Suero del 2 gotas
donante
Células lavadas 1 gota
bolsa o donante
Celulas R1 1 gota
Celulas R2 1 gota
Celulas lavadas 1 gota 1 gota
paciente o
receptor

Rastreo de anticuerpos del receptor

 Mezclar cada tubo, centrifugar por 15 segundos

 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación o hemólisis
con la ayuda de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Si no observa aglutinación en los tubos, continúe con la fase proteica.
 A cada tubo adicione una gota del potenciador.
 Incube por 15 o 30 minutos dependiendo del potencializador utilizado.
 Centrifugar por 15 segundos
 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación o hemólisis
con la ayuda de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Si no observa aglutinación en los tubos, lavarlos de 3 –4 veces con solución salina, decantar bien todo el
sobrenadante en el último lavado y continúe con la fase de coombs.
 Agregar una gota de suero antihumano de coombs.
 Centrifugar por 15 segundos
 Resuspenda suavemente el botón de células y observe la presencia o ausencia de aglutinación o hemólisis
con la ayuda de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado.
 Comprobar los resultados añadiendo a cada tubo una gota de células sensibilizadas. Deben dar como
mínimo 2+ de aglutinación.

INTERPRETACIÓN.
La aglutinación o hemólisis indica incompatibilidad debida a anticuerpos irregulares.
No aglutinación o no hemólisis Indica compatibilidad.

BIBLIOGRAFIA
MINISTERIO DE SALUD. Manual de Normas Técnicas y Procedimientos de Bancos de Sangre. 1ª Edición.
Editorial Carrera Séptima Ltda. Santa Fe de Bogotá, 1994.
DUEÑAS RIVERA, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Editorial Universidad del Valle. Santiago de Cali,1998.
CORTES, Armando, Administración, Técnicas y Procedimientos en los Servicios de Transfusión. Editorial
Universidad del Valle. Santiago de Cali, 1998.

TALLER
 Realice un esquema de cada una de las técnicas descritas anteriormente.
 Explique porqué el suero de coombs detecta GR sensibilizados tanto in vivo como in vitro.
 Que diferencia encuentra entre el fundamento del Coombs Directo e Indirecto.
 En que situaciones está indicado realizar la prueba de Coombs Directo e Indirecto.
 Cual es la finalidad de realizar el contról de coombs al final de la prueba.
 Porqué considera que en estas técnicas el lavado de las células es crítico.
 Con que finalidad se realiza la determinación de coombs directo fraccionado.
 A un paciente con anemia hemolítica autoinmune, se le realiza la prueba de coombs directa, resultando
positiva 4+, al realizar el coombs directo fraccionado dio aglutinación en los tubos marcados IgG y C3d,
interprete la prueba y sugiera que otra determinación se le debe realizar al paciente.
 Que casos clínicos están asociados a resultados positivos y negativos de coombs directo.
 En la prueba de Coombs Indirecto, explique que se pretende con la fase de sensibilización y explique si
habrá alguna relación entre la fase de la técnica en que se detecta el anticuerpo y el tipo de anticuerpo.
 Teniendo en cuenta el objetivo de la prueba de coombs indirecto, que eventos pueden estar involucrados
con esta prueba y de un ejemplo relacionado con el evento número 2.
 Con que finalidad se debe realizar la cuantificación del coombs indirecto y como se interpreta el escore.
 A un paciente con anemia hemolítica autoinmune se le cuantifica el anticuerpo presente encontrándose los
siguientes resultados: Dil 1/1: 4+, ½: 4+, ¼: 3+, 1/8:2+, 1/16:1+, 1/32: w. Informe el resultado del coombs
indirecto.
 En que casos está indicada la determinación del coombs indirecto.
 Con que finalidad se realiza la técnica de rastreo de anticuerpos y si esta da positiva que pruebas sugiere
deben realizársele al paciente o donante.
 Que características deben tener las células pantalla I y II y las del panel de células.
 En que casos está justificado investigar la presencia de anticuerpos irregulares o rastreo de anticuerpos.
 Con que finalidad se realizan las pruebas cruzadas.
 Una prueba cruzada negativa que le garantiza al receptor o paciente.
 Que determina la prueba cruzada mayor y menor.
 Que tipo de anticuerpos se evidencian en cada fase de la técnica de pruebas cruzadas.
 Al realizar las pruebas cruzadas se obtuvo los siguientes resultados. Interprete las dos situaciones expuestas
a continuación y diga si hay o no compatibilidad.
1. PCM: 4+, CI. 0+, CII: 0+, PCm: 0+, Ac: 0+
2. PCM: 0+, CI:4+, CII:4+, PCm: 0+, Ac. 4+.
PCM: prueba cruzada mayor.
PCm: prueba cruzada menor.