MONOGRAFIA SOBRE

PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA CON DOS ORGANISMOS MODELOS

EN ACETOGENINAS DE ANNONACEAE CON ACTIVIDAD BIOPESTICIDA

LINA MARCELA FLOREZ ACEVEDO

VIVIANA MESA SALAZAR

DIRECTORA:
GLORIA EDITH GUERRERO A.

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERIRA

FACULTAD DE TECNOLOGIAS
ESCUELA DE QUIMICA

PEREIRA
2007
 MONOGRAFIA SOBRE
PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA CON DOS ORGANISMOS MODELOS
EN ACETOGENINAS DE ANNONACEAE CON ACTIVIDAD BIOPESTICIDA

LINA MARCELA FLOREZ ACEVEDO

VIVIANA MESA SALAZAR

Documento presentado como requisito parcial para obtener el titulo de

TECNOLOGO QUIMICO

DIRECTORA:
GLORIA EDITH GUERRERO A.

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERIRA

FACULTAD DE TECNOLOGIAS
ESCUELA DE QUIMICA

PEREIRA
2007
 NOTA DE ACEPTACION

----------------------------------

----------------------------------

----------------------------

GLORIA EDITH GUERRERO ALVAREZ

Doctor en Ciencias Química.

-----------------------------

LUZ ANGELA VELOZA.

Directora Programa de Tecnología Química.

i
 DEDICATORIA

Este trabajo esta dedicado a nuestras familias los cuales nos impulsaron en el
transcurso de nuestros estudios y que nos apoyaron para lograr que culmináramos
esta meta. Gracias.

ii
 AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos a Gloria Edith Guerrero por su valiosa colaboración durante todo

este proceso.

A LOS JURADOS Jaime Nio osorio

A Bárbara Moreno, a Francisco Javier Jiménez y demás entrevistados por su

paciencia y su dedicación para con nosotras y este trabajo.

iii
 GLOSARIO

ACETOGENINAS: Compuestos activos que afectan la producción de Trifosfato de

adenosina (ATP) en la mitocondria. El ATP es la fuente principal de energía de la
célula. Las acetogeninas modulan selectivamente la producción de ATP en células
específicas. La modulación de la producción de ATP afecta la viabilidad de células
específicas y el crecimiento de vasos sanguíneos que los nutren.

ACTIVIDAD BIOLÓGICA: Expresión que describe los efectos beneficiosos o

nocivos de una droga en la materia viva. Cuando la droga es una mezcla química
compleja, esta actividad es ejercida por el ingrediente activo o el farmacóforo de la
sustancia pero se puede modificar por los otros componentes. La clase principal
de actividad biológica es toxicidad de una sustancia.

ANNONACEAE: Familia de plantas dicotiledóneas, arbóreas o arbustivas, a

menudo trepadoras, propias de las zonas tropicales e intertropicales, con las hojas
alternas, simples y enteras, flores casi axilares, solitarias o en manojo y fruto
simple o compuesto, seco o carnoso, con pepitas duras y frágiles.

ANTIHELMÍNTICO: Drogas que expulsan a los helmintos y gusanos parásitos del

cuerpo, matándolos o expulsándolos vivos. Los remedios tradicionales de este tipo
se llaman vermífugos.

ANTIMICROBIANO: Que impide el desarrollo de los microbios.

APOPTOSIS: Muerte celular programada, un proceso que juega un importante

papel desde el desarrollo temprano hasta el envejecimiento. Tiene especial
importancia en el cáncer y es objeto de un estudio intenso dado que es una

iv
solución tentadora, que por otro lado, puede interferir en los tratamientos
terapéuticos.

ARTEMIA SALINA O BRINE SHRIMPS: Pertenece a un grupo de crustáceo que

ha habitado la tierra por 300 millones de años, y esta ha sido un importante
eslabón en la cadena alimenticia desde entonces.

La Artemia salina tal cual como lo indica su nombre, no es un habitante directo del
mar sino de salinas, que no son sino lagunas y estuarios cercados, cercanos a las
costas marítimas. En ocasiones se pueden hallar en masas de agua saladas
atrapadas dentro de los continentes como en caso del famoso lago Salt Lake.

ÁCIDO HÚMICO: Moléculas complejas orgánicas formadas por la descomposición

de materia orgánica. Contribuye significativamente en la estabilidad y fertilidad del
suelo resultando un crecimiento excepcional de la planta y en la absorción de
nutrientes.

ACUICULTURA: Es el cultivo de animales y plantas en el agua, se incluyen

peces, reptiles, anfibios, crustáceos, moluscos, plantas y algas destinados para
alimento, alguna otra utilidad por parte del hombre (recreación, estudio, obtención
de productos) o para su conservación y protección.

BIOPESTICIDA: Pesticida hecho a base de recursos biológicos, es decir, de

toxinas que se producen naturalmente.

BACTERIAS: Microorganismo unicelular, sin núcleo definido por una membrana.

Interviene en procesos como la fermentación, y puede ser la causa de
enfermedades tales como el tifus, el cólera, afecciones venéreas, etc.

BIOTOPO: Región de caracteres climáticos y geográficos definidos que es

ocupada por una biocenosis o comunidad de especies animales y vegetales.

v
BIOTERIO: Conjunto de instalaciones, muebles e inmuebles destinados al
alojamiento y manutención de animales de laboratorio durante una o varias de las
fases de su ciclo vital; esto es, nacimiento, desarrollo, reproducción y muerte.

BRÁCTEA: Organo foliáceo en la proximidad de las flores y diferente a las hojas

normales y las piezas del perianto.A pesar de ser verdes, su función principal no
es la fotosíntesis, sino proteger las flores o inflorescencias.

CEPA: en microbiología, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el

mismo patrimonio genético.

CISTOS DE ARTEMIA: Huevos deshidratados de Artemia salina con una rápida

eclosión en agua salada.

CULÍCIDOS: (latín Culicidae) son mosquitos, insectos pertenecientes al orden de

los dípteros; sus géneros incluyen Anopheles, Culex, Psorfora, Oclerotatus, Aedes,
Stegomyia, Sabetes, Culiseta y Haemagoggus. Existen 35 géneros en total con más de
2700 especies reconocidas. Son insectos voladores, que poseen un cuerpo
delgado y patas alargadas; el tamaño de los adultos varía de especie a especie,
pero rara vez superan los 15 mm. Las larvas se desarrollan en el agua.

CULTIVAR: Combinación de las palabras "cultivada" y "variedad", y en la literatura

más antigua puede verse como "variedades", uso que hoy en día está
desaconsejado y no debe confundirse con la definición actual de variedad.
"Cultivar" es el término que se reserva para aquellas poblaciones de plantas
cultivadas que son genéticamente homogéneas y comparten características de
relevancia agrícola que permiten distinguir claramente a la población de las demás
poblaciones de la especie y traspasan estas características de generación en
generación, de forma sexual o asexual.

vi
CRUSTÁCEO: Clase de artrópodos de respiración branquial, cubiertos
generalmente de un caparazón duro o flexible y con dos pares de antenas:
los cangrejos y las langostas son crustáceos.

DOSIS LETAL DL 50: La dosis letal 50 es la dosis única que, obtenida por
estadística, de una sustancia de la que puede esperarse que produzca la muerte
del 50% de los animales a los que se haya administrado. El valor de la DL50 se
expresa en peso de la sustancia por unidad de peso del animal (miligramos por
kilo, mg/kg).

DOSIS EFECTIVA DE 50: En farmacología, se entiende por dosis efectiva de un

medicamento a la dosis mínima capaz de producir el efecto deseado de la droga.
La dosis que produce el efecto deseado en el 50% de la población se conoce
como dosis efectiva 50%, o por sus siglas en inglés DE-50.

DENGUE: Enfermedad producida por un virus transmitido por mosquitos de

América central y zonas calurosas de Asia y Australia, también llamada la fiebre
de los siete días.

EPÍMERO: En química, un epímero es un estereoisómero de otro compuesto que

tenga una diversa configuración a solamente uno de varios centros quirales del
carbón. Los estereoisómeros incluyen los enantiómeros y los diastereómeros,
ambos que contengan un centro quiral del carbón (excepto los isómeros
geométricos, que es una clase de diastereómeros).

ENANTIÓMERO: Imagen especular no superponible de sí mismo. Tienen las

mismas propiedades físicas y químicas, excepto por la interacción con el plano de
la luz polarizada o con otras moléculas quirales. Son moléculas quirales. La mezcla
de enantiómeros en una solución se denomina mezcla racemica.

ECOTOXICOLOGÍA: Estudia el destino y los efectos de los contaminantes en los

ecosistemas, intentando explicar las causas y prever los riesgos probables. La
vii
ecotoxicología prospectiva evalúa la toxicidad de las sustancias antes de su
producción y uso. La ecotoxicología retrospectiva se ocupa de confirmar si la
sustancia produce daños en el ecosistema.

ENCEFALITIS: Inflamación del encéfalo.

ENCÉFALO: Conjunto de órganos que forman parte del sistema nervioso de los
vertebrados y están contenidos en la cavidad del cráneo.

ERITEMA: Inflamación superficial de la piel, caracterizada por manchas rojas.

EVALUACIÓN CITOLÓGICA: Análisis de las células bajo un microscopio para

evaluar su apariencia, su origen, así como la manera como se forman y
funcionan.

FARMACOLOGÍA: Ciencia que trata de los medicamentos, sus propiedades y su

composición.

FISIOLÓGICO: Que posee una función normal dentro del organismo.

FILARIAS: Grupo heterogéneo, no taxonómico, de nemàtodos filiformes,

ovovivíparos, parásitos del hombre o de los animales. Desde el punto de vista
patogénico, las filarias propias del hombre las podemos clasificar en dos grupos,
filarias patógenas, y filarias apatógenas o poco patógenas. En las primeras, los
adultos se localizan en la piel (Dracunculus medinensis, Loa loa y Onchocerca
volvulus) o en los vasos linfáticos (Brugia malayi, Brugia timori y Wuchereria
bancrofti), mientras que en las segundas, lo hacen en la piel (Mansonella
streptocerca) o en las serosas (Mansonella ozzardi y Mansonella perstans).

FILARIASIS: Grupo de enfermedades parasitarias infecciosas diferentes que

tienen como denominador común el ser producidas por nemátodos (gusanos en
forma de hilo) de la misma familia, y transmitidas de persona a persona por la
picadura de insectos.
viii
GLABRA – GLABRO: Desprovista de pelo o vello.Que no tiene pelos o es
totalmente lampiño.Sin pelos.

GEN: Fragmento de Ácido Desoxirribonucleico (ADN) dispuesto en un orden fijo

en los cromosomas, que determina la aparición de los caracteres hereditarios en
los seres vivos.

GENOMA: Conjunto de los cromosomas de una célula: el genoma humano está

formado por 23 pares de cromosomas.

HONGO: Ser vivo talofito sin clorofila, de reproducción preferentemente asexual,

por esporas, que suele ser parásito o vive sobre materias orgánicas en
descomposición: el champiñón es un hongo.

HIPOTENSOR: Sustancia que reduce (baja) la tensión arterial.

INHIBICIÓN: Efecto que produce sobre el funcionamiento de un órgano, tejido o

principio activo cualquier agente físico, químico, nervioso, etc., y que se manifiesta
en una detención total o parcial de dicha función.

INGREDIENTE ACTIVO: Es la parte biológicamente activa del producto

fitosanitario presente en una formulación.

LARVA: Animal en estado de desarrollo, cuando ha abandonado las cubiertas del

huevo y es capaz de nutrirse por sí mismo, pero aún no ha adquirido la forma y la
organización propia de los adultos de su especie.

MATERIAL GENÉTICO: todo material de origen vegetal, animal, microbiano o de

otro tipo que contenga unidades funcionales de la herencia.

ix
MICROORGANISMO: organismos microscópicos pertenecientes por regla general
a virus, bacterias, algas, hongos o protozoos.

MITOCONDRIA: DEL GRIEGO: mitocondrias, thread + chondros, gránulo es el

sitio donde se lleva a cabo la respiración celular, el metabolismo aerobio, en la
mayoría de los organismos eucariontes (con núcleo verdadero).

MALARIA: Enfermedad causada por un protozoo, que se transmite al hombre por

la picadura del mosquito anofeles y produce fiebres muy intensas.

MOSQUITOS: Nombre común de diversas especies de insectos dípteros

pequeños y delgados, con dos alas transparentes y patas largas, cuya hembra
chupa la sangre de las personas y de los animales de piel fina y produce una
picadura molesta: las larvas de los mosquitos son acuáticas.

NAUPLIOS: Como se conoce a la Artemia recién eclosionada.

NEUROTÓXICA: Se dice de las sustancias que inhiben o alteran gravemente las

funciones del sistema nervioso.

ORGANISMO: entidad biológica capaz de reproducirse o de transferir material

genético, incluyéndose dentro de este concepto a las entidades microbiológicas,
sean o no celulares. Casi todo organismo está formado por células, que pueden
agruparse en órganos, y éstos a su vez en sistemas, cada uno de los cuales
realizan funciones específicas.

ORGANISMO MODELO: En biología es una especie muy estudiada para entender

fenómenos biológicos particulares, que puede dar una idea de cómo funcionan
esos procesos en otros organismos. En particular, los organismos modelos son
ampliamente usados para analizar las causas de enfermedades humanas.

x
OVÍPARO: Un animal ovíparo (del latín ovum, "huevo", y parire, "parir") es un
animal cuya modalidad de reproducción incluye el depósito de huevos en el medio
externo, donde completar su desarrollo antes de la eclosión. Son ovíparos la
mayoría de los insectos, los peces, los anfibios y los reptiles, así como la totalidad de
las aves. Entre los mamíferos sólo son ovíparos los monotremas (el ornitorrinco y los
equidnas).

OVOVIVIPARIDAD: Un animal es ovovivíparo (del latín ovum, "huevo, vivus,

"vivo", y parire, "parir") cuando los huevos permanecen dentro del cuerpo de la
hembra hasta su eclosión. Ésta puede producirse inmediatamente antes de lo que
vendrá a ser un parto, o inmediatamente después de la puesta.

PATOLÓGICO: Que constituye una enfermedad o es síntoma de ella:

inflamación patológica; miedo patológico.

PECIOLO: (del latín "petiolus", forma diminutiva de "pes" "pedis", pie, tronco de
una planta) es el rabillo que une la lámina de una hoja a su base foliar o al tallo.
Falta en las hojas sésiles. El peciolo puede ser una característica determinante
para la identificación de la planta.

PLAGUICIDA: Sustancias u organismos capaces de exterminar toda vida animal o

vegetal que pueda afectar a la salud, la alimentación o a la economía del hombre.
Entre los plaguicidas se encuentran los insecticidas, acaricidas, herbicidas y
fungicidas.
Se trata de sustancias mayormente destinadas a la protección vegetal o productos
fitosanitarios –principalmente de origen químico para combatir y controlar plagas
y/o transmisores de enfermedades bacterianas o virales de los cultivos y
productos que controlan a algunas especies vegetales que compiten con los
cultivos (malezas).

xi
Estos productos químicos también pueden ser utilizados para el control de
vectores de enfermedades humanas y animales en áreas abiertas o dentro del
domicilio. A estas sustancias también se las llama ocasionalmente biocidas.

PROTOZOARIOS: Organismos unicelulares microscópicos flagelados.

PARTENOGÉNESIS: (del griego παρθένος parthenos = virgen + γένεσις génesis =
generación) es una forma de reproducción basada en el desarrollo de células
sexuales femeninas no fecundadas, que se da con cierta frecuencia en
platelmintos, rotíferos, tardígrados, crustáceos, insectos, peces, anfibios y reptiles, entre
los animales, y también en las plantas.

PATÓGENO: Se dice de las sustancias que inhiben o alteran gravemente las

funciones del sistema nervioso.

PUPA: Fase de desarrollo de un insecto posterior al estado de larva y anterior al

de adulto.

SUSTANCIAS COADYUVANTES: Normalmente pertenecen al grupo de

diluyentes, humectantes, absorbentes o aditivos. Los adsorbentes para retener
algo que pueda perjudicar al principio activo, los absorbentes son sustancias que
favorecen la absorción de una tercera, los coadyuvantes solo cuando sea
necesaria su presencia.

WUCHERERIA BANCROFTI: Es la más extendida de las filarias, apareciendo por

toda la costa atlántica de América Central y del Sur, oeste, centro y este de África,
centro-sur, sureste y este de Asia e islas del Pacífico.

xii
 CONTENIDO

Pág.

1.0 JUSTIFICACION 1
2.0 OBJETIVOS 5
2.1 OBJETIVO GENERAL 5
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 5
3.0 GENERALIDADES DE LAS ANNONACEAE 6
3.1 CLASIFICACION BOTANICA DE LAS ANNONACEAE 6
3.2. ALGUNAS ANNONAS 9
3.2.1. Annona cherimola chirim. 9
3.2.2. Annona muricata L. 9
3.2.3. Annona diversifolia Safford. 10
3.2.4. Annnona purpurea L. 11
3.2.5. Annona reticulata L. 12
3.3 ANNONACEAE EN COLOMBIA 14
3.4 Compuestos Activos De Las Annonaceae 15
3.4.1 Clasificación De Las Acetogeninas De Annonaceae 15
3.4.2 Separación e Identificación de las Acetogeninas 17
3.4.3 Mecanismo De Acción De Las Acetogeninas De Annonaceae 18
4.0 ACTIVIDAD BIOLOGICA 19
4.1 Actividad Biológica Biopesticida 21
4.1.1. Clasificación De Los Biopesticidas 23
4.1.1.1. Bioinsecticidas. 23
4.1.1.2.Biofungicidas. 24
4.1.1.3.Bioherbicidas. 25
4.1.1.4.Biobactericidas. 25
4.1.1.5.Bionematicidas. 25
4.1.2. Biopesticidas a Partir de Extractos Vegetales. 26
4.1.2.1. Insecticidas Derivados de Plantas y
Productos Naturales. 26
4.2. PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA Y ORGANISMOS
MODELOS. 28
4.2.1. LOS MOSQUITOS (DIPTERA: CILICIDAE) 31
4.2.1.1. Géneros de la Familia Culicidae 33
4.2.2 LA ARTEMIA SALINA O BRINE SHRIMPS Y SU CLASIFICACION 36
4.2.2.1. Distribución De La Artemia salina 37
4.2.2.2. Ciclo De Vida De La Artemia salina 38
4.2.2.3. La Importancia De La Artemia salina
En Las Investigaciones 41
4.3. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LAS ACETOGENINAS

xiii
DE ANNONACEAE 42
5.0. PROTOCOLOS 49
5.1. PROTOCOLOS CON ARTEMIA SALINA 49
5.1.1. Procedimiento Del Laboratorio UNAL-Departamento 49
de Química, Grupo de Productos Naturales.
5.1.2. Procedimiento De La Universidad Del Quindío 53
5.1.3. Procedimiento De La Universidad Nacional De Colombia 54
5.2. PROTOCOLOS CON MOSQUITOS. 56
5.2.1. Procedimiento #1 Para La Evaluación De Toxicidad Con
Mosquito Culex. quinquefasciatus . 56
5.2.2. Procedimiento #2 Para La Evaluación De Toxicidad Con
Larvas Del IV Estadio De Anopheles. 58
5.2.3. Procedimiento #3 Para La Evaluación De Toxicidad Con
Mosquito Culex. quinquefasciatus. 59
5.3. PROTOCOLOS RECOMENDADOS PARA EVALUAR POSIBLE
ACTIVIDAD BIOLÓGICA BIOPESTICIDA. 62
5.3.1. Diagrama De Flujo #1: Bioensayo Preliminar Con Artemia salina 62
5.3.2. Diagrama De Flujo #2: Bioensayo Específico Con El
Mosquito Culex quinquefasciatus 66
6.0. DISCUSION GENERAL 69
7.0. CONCLUSIONES 72
BIBLIOGRAFIA 74
ANEXOS 86

xiv
 LISTA DE FIGURAS

Pág.
FIGURA 1. ACETOGENINAS UTILIZADAS COMO BIOPESTICIDAS 1
FIGURA 2. Frutos de Annona chirimoya 9
FIGURA 3. Fruto de Annona muricata 10
FIGURA 4. Frutos de Annona diversifolia 10
FIGURA 5. Frutos de Annona purpurea 12
FIGURA 6. Fruto de Annona reticulata 13
FIGURA 7. CICLO DE VIDA DE UN MOSQUITO 32
FIGURA 8. MOSQUITO DEL GENERO CULEX 33
FIGURA 9. MOSQUITO DEL GENERO AEDES 34
FIGURA 10. MOSQUITO DEL GENERO ANOPHELES 35
FIGURA 11. ARTEMIA SALINA 36
FIGURA 12. CICLO DE VIDA DE LA ARTEMIA SALINA 38
FIGURA 13. TANQUE PARA HUEVOS DE ARTEMIA 50
FIGURA 14. MADURACION DE BRINE SHRIMPS 50
FIGURA 15. VIALES AGRUPADOS DE A TRES 51
FIGURA 16. EVALUANDO MOVILIDAD DE LARVAS 52
FIGURA 17. MOSQUITERO 59
FIGURA 18. ALGODÓN CON AZUCAR 59

xv
 LISTA DE TABLAS
Pág.

TABLA 1. ESTUDIOS REALIZADOS CON PRUEBAS DE ACTIVIDAD

BIOLOGICA. 3
TABLA 2. LISTA DE ALGUNOS GÉNEROS DE LA FAMILIA
ANNONACEAE CON SUS RESPECTIVAS ESPECIES 7
TABLA 3. CLASIFICACION DE ACETOGENINAS DE ANNONACEAE 16
TABLA 4. EJEMPLOS DE ACTIVIDADES BIOLOGICAS 19
TABLA 5. ORGANISMOS MODELOS EMPLEADOS EN
LA BUSQUEDA DE BIOENSAYOS 30
TABLA 6. CETOGENINAS DE ANNONACEAE CON
ACTIVIDA BIOLOGICA BIOPESTICIDA 42
TABLA 7.ACETOGENINAS CON MAYOR
ACTIVIDAD BIOPESTICIDA 45
TABLA 8. ESTUDIOS REALIZADOS CON ACETOGENINAS
DE ANNONACEAE EN ARTEMIA SALINA Y MOSQUITOS
(DIPTERA:CULICIDAE) 46
TABLA 9. DIFERENCIA ENTRE MOSQUITOS SANOS
Y AFECTADOS POR ANONACINA 48
TABLA 10. CARACTERISTICAS DE LOS MOSQUITOS 88
TABLA 11. DOSIS EFECTIVA MEDIA Y DOSIS LETAL MEDIA 92

xvi
 LISTA DE ANEXOS

Pág.

ANEXO 1. MATERIAL Y REACTIVOS A UTILIZAR. 87

ANEXO 2. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS MOSQUITOS 88
ANEXO 3. PROGRAMA PROBIT. 91
ANEXO 4. DETERMINACION DE LA DOSIS LETAL
DE UNA SUSTANCIA. 92
ANEXO 5. PRODUCCION DE GUANABANA EN COLOMBIA
EN EL AÑO 2003. 93
ANEXO 6. PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA ELABORACION
DE UN BIOPESTICIDA NATURAL. 94
ANEXO 7. CONDICIONES AMBIENTALES. 95
ANEXO 8. LISTA AMPLIADA DE GÉNEROS DE LA FAMILIA
ANNONACEAE CON SUS RESPECTIVAS ESPECIES 98

xvii
 1. JUSTIFICACION

Las acetogeninas, son compuestos bioactivos presentes tanto en las raíces como
en las semillas de algunos frutas, son componentes naturales los cuales presentan
una extensa gama de actividades biológicas: antitumoral, citotóxica,
antimicrobiana, plaguicida, antiprotozoaria y antihelmintica, (1, 2).

Las Acetogeninas son compuestos de estructura química características como se

aprecia en la figura 1.

FIGURA 1. ACETOGENINAS UTILIZADAS COMO BIOPESTICIDAS

1-Escuamocina, Acetogenina Bis-THF

2-Anonacina, Acetogenina mono THF α-ά dihidroxilada

1
Se encuentran presentes en semillas de plantas de la familia Annonaceae como la
Annona cherimolia, Annona glabra, Annona muricata, Annona esquamosa y otras.
Algunos estudios han sugerido que ciertas acetogeninas de la guanábana y de
otras anonáceas tienen un excelente potencial como biopesticidas, (1, 2).

Los biopesticidas son productos que contienen un microorganismo como

ingrediente activo, o bien son moléculas que se extraen de un ser vivo mediante
procesos que no alteran su composición química. El biopesticida es un pesticida
hecho a base de recursos biológicos, es decir, de toxinas que se producen
naturalmente, no alteran el equilibrio ecológico del suelo, cuando son
microorganismos muy específicos, dado que cuando muere el huésped, en este
caso el parásito, muere también el microorganismo, (2, 3).

En los últimos años se ha tratado de desarrollar biopesticida que no tengan

efectos sobre la salud humana y animal, que no tengan influencia negativa sobre
el medio ambiente y que sean suficientemente efectivo para los usos propuestos,
(2, 3).

Tanto las investigaciones biológicas básicas como las investigaciones aplicadas,

han determinado muchos e importantes adelantos de la ciencia médica. Resulta
indispensable seguir realizando investigaciones de ambas clases con el fin de
descubrir las causas, mecanismos, prevención y tratamiento de enfermedades que
aún no son bien conocidas por el hombre, así como para probar la eficacia e
inocuidad de muchos de los principios activos utilizados en medicina humana y
veterinaria, y en general para avanzar en el conocimiento biológico, (3).

En medicina humana y veterinaria se utilizan animales en investigaciones

fisiológicas, patológicas, farmacológicas, toxicológicas, terapéuticas y de
conducta, en cirugía experimental, en ensayos de medicamentos y preparados
biológicos, y también con fines docentes en todas estas disciplinas, incluyendo la
formación quirúrgica, (3).

2
Además, de los experimentos, los animales son indispensables para probar la
potencia e inocuidad de muchas de las sustancias biológicas utilizadas en
medicina humana y veterinaria. Las pruebas de actividad biológica son, además,
esenciales para las numerosas sustancias sintéticas que jamás existieron en la
naturaleza: productos farmacéuticos, aditivos alimentarios y productos químicos
agrícolas, y es evidente que dichas pruebas sólo pueden realizarse con animales,
aunque los sujetos de las pruebas definitivas tengan que ser seres humanos en
contacto directo o indirecto con las mencionadas sustancias, (3).
Algunos ejemplos de los organismos modelos utilizados para las pruebas de
Actividad Biológica son: levadura (Saccharomyces cerevisiae), gusano
(Caenorhabditis elegans), mosca (Drosophila melanogaster) y ratón (Mus
musculus), los cuales comparten con los seres humanos un gran número de
genes, proteínas e incluso vías genéticas; de igual forma como ejemplos de
estudios realizados con pruebas de actividad biológica se presentan algunos
estudios de Acetogeninas de Annonaceae con organismos modelos como se
muestra en la siguiente tabla:

TABLA 1. ESTUDIOS REALIZADOS CON PRUEBAS DE ACTIVIDAD

BIOLOGICA

EXTRACTO ORGANISMO OBJETIVO REFERENCIA

EMPLEADO BIBLIOGRAFICA
Demostrar
Extracto crudo Larvas Del Cogollero la eficiencia de
metabólico de Del Maíz Spodoptera acetogeninas
acetogeninas, frugiperda (Lep: Annonaceae como
obtenido de Noctuidae) alternativa ecológica
(4)
semillas de Annona en el manejo
muricata- clon Elita integrado de plagas,
debido a la
abundancia de
semillas de
A. muricata.

3
 Acetogeninas de Leptinotarsa Evaluar dos
Annonaceae, 1- decemlineata Acetogeninas de
Escuamocina, 2- (escarabajo de la papa Annonaceae y sus
(5)
Anonacina rosada), Spodoptera Efectos Insecticidas
littoralis (Lepidoptera: y Mutagénico sobre
Noctuidae) Polifago y diferentes especies
Myzus persicae con distintos hábitos
(Homoptera:Aphididae) alimentarios

El estudio de las Pruebas de Actividad Biológica es complejo por su gran aporte

en diferentes sectores como son: la agricultura, la medicina, la veterinaria, etc. Por
tal razón la presente monografía pretende documentar pruebas de actividad
biológica con dos organismos modelos: Artemia salina y Mosquitos (Diptera:
Culicidae), proponer un método para la evaluación de la actividad biológica de las
Acetogeninas de especies de la familia Annonaceae como biopesticidas, que
contribuyan en el desarrollo de trabajos posteriores dentro de una nueva línea de
investigación del grupo de Oleoquímica de la Escuela de Tecnología Química.

4
 2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Documentar la información existente sobre pruebas de actividad biológica con dos

organismos modelos Artemia salina y Mosquitos (Diptera: Culicidae), seleccionar
un método para la evaluación de la actividad biológica de las Acetogeninas de
Annonaceae como biopesticida, y contribuir al aprovechamiento integral de
subproductos de las Annonaceae.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Recopilar información de diferentes fuentes sobre pruebas de actividad

biológica con dos organismos modelos (Artemia salina y Mosquitos (Diptera:
Culicidae)).

• Seleccionar el método mas viable para realizar pruebas de actividad

biológica con Acetogeninas de Annonaceae con actividad biopesticida.

5
 3. GENERALIDADES DE LAS ANNONACEAE

3.1. CLASIFICACION BOTANICA DE LAS ANNONACEAE

La familia Annonaceae cuenta con 130 géneros y se estima que hay 2.300
especies en el mundo; algunas de estos géneros con sus especies se pueden
observar en la tabla 2. Entre ellas hay numerosos frutales, especialmente en los
géneros Annona y Rollinia; la mayoría de las especies del genero Annona y todas
las del genero Rollinia son originarias del Nuevo Mundo, (6).

El género Annona se caracteriza por tener sus hojas alternas, simples, enteras,
finas o coríaceas, decíduas o persistentes y sin estípulas. Las flores son
bisexuales, con frecuencia en tonos de color café y amarillo, solitarias o en
racimos, compuesta de 3 sépalos y 6 pétalos, generalmente el cáliz es tubular.
Los estambres son numerosos, aglomerados, con filamentos carnosos portando
anteras largas y espirales. La fruta es grande, carnosa, estando formada por la
fusión de los pistilos y los receptáculos, (6, 7).

Los indígenas cultivaron cuidadosamente muchas de ellas, en Mesoamérica, los

valles interandinos, Amazonia y otros lugares. Hay tres especies, Annona
cherimola, A. muricata y A. squamosa, marginales en varias regiones de América
tropical; otras tres, A. diversifolia, A. reticulata y A. scleroderma en cambio, han
sido marginadas, a pesar de su valor intrínseco y potencial como fruta fresca,
(6,7).

6
TABLA 2. Lista De Algunos Géneros De La Familia Annonaceae

Con sus Respectivas Especies, (6, 7, 8).

GENERO ESPECIE
• crassipetala Hemsl.
• dolichocarpa Sprague & Sandwith
Anaxagorea • panamensis Standl.
• phaeocarpa Mart.

• amazonica R. E. Fr.
• cherimola Mill.
• glabra L.
• montana Macfad.
• muricata L.
• pittieri Donn. Sm.
Annona • pruinosa G. E. Schatz
• purpurea Mo‡. & Sessé ex Dunal
• reticulata L.
• squamosa L.
• volubilis Lundell

Cananga • odorata (Lam.) Hook. f. & Thomson

• costaricense (Donn. Sm.) Saff.

• lanugipetalum Woodson & Schery
Cymbopetalum • torulosum G. E. Schatz

• bibracteata (Rob.) Saff.

• heteropetala R. E. Fr.
Desmopsis • maxonii Saff.
• microcarpa R. E. Fr.
• oerstedii Saff.
• schippii Standl.
•
Duguetia • panamensis Standl.

7
 • aeruginosa Standl.
• amplifolia Triana & Planch.
• chiriquiensis R. E. Fr.
• costaricensis R. E. Fr.
• diospyroides Baill.
• dolichopoda Donn. Sm.
Guatteria • elegantissima R. E. Fr.
• lucens Standl.
• oliviformis Donn. Sm.
• recurvisepala R. E. Fr.
• tonduzii Diels
• verrucosa R. E. Fr.

Malmea • costaricensis R. E. Fr.

• hypoglauca (Standl.) R. E. Fr.

Oxandra • longipetala R. E. Fr.

• venezuelana R. E. Fr.

Rollinia • membranacea Triana & Planch.

• mucosa Baill.
• pittieri Saff.

Sapranthus • palanga R. E. Fr.

Stenanona • costaricensis R. E. Fr.

• hammelii G. E. Schatz
• panamensis R. E. Fr.
Unonopsis • pittieri Saff.
• storkii Standl. & L. O. Williams
• theobromifolia N. Zamora &
Poveda

• aromatica (Lam.) Mart.

• bocatorena Schery
Xylopia • frutescens Aubl.
• macrantha Triana & Planch.
• sericophylla Standl. & L. O.
Williams

Para tener una información completa de los géneros y especies de la familia

Annonaceae se puede observar el Anexo 8.

8
3.2. ALGUNAS ANNONAS

3.2.1 Annona cherimola chirim, (chirimoya, chirimoyo, anona).

La chirimoya (ver figura 2), se considera originaria de los valles fríos, pero libres
de heladas de los Andes, entre 700 a 2400 m, (6).

FIGURA 2. Frutos de Annona cherimola

Se conocen excelentes cultivares, todos de propagación vegetativa, que se

plantan a escala comercial en España, Chile, Australia, Israel, Estados Unidos
(California, Florida) y la isla de Madeira. Los frutos se venden en los
supermercados de muchos países y son muy apreciados. En las regiones donde
la chirimoya es todavía un cultivo marginal, hay que aplicar métodos de:
polinización artificial, injerto en patrones de la misma especie o de A. squamosa o
A. glabra, de cultivares superiores, (6, 8).

3.2.2. Annona muricata L. (guanaba, guanábana).

Es nativa posiblemente de las Antillas y de la parte septentrional de América del

Sur, y crece entre 0-1000 m de altura. Su producción comercial se ha desarrollado
en Brasil, Venezuela, Costa Rica y otros países, para el consumo local y la
exportación. Hay mucha variación en el tamaño del fruto y en el contenido de
azúcares (ver figura 3), (7, 9).

9
 FIGURA 3. Fruto de Annona muricata

3.2.3. Annona diversifolia Safford (ilama, ilamatzapotl, izlama, papausa,

Anón).

Este frutal como se aprecia en la figura 4, es muy estimado en su área de origen

Guatemala, no se ha desarrollado como merece por tratarse de una especie
plantada principalmente por los indígenas, (6, 7).

FIGURA 4. Frutos de Annona diversifolia

Aunque es muy apreciada y bien pagada en los mercados de Guatemala, su

cultivo no atrae a otros productores agrícolas. Otros factores que ayudan a
marginar su producción son la baja productividad de los árboles; la dificultad de
germinación de las semillas (aunque ya se conocen métodos para promover la
germinación artificial), y la poca duración de la fruta en los mercados, 2 a 3 días a
temperatura ambiente. Si se dejan madurar en el árbol, los frutos presentan
rajaduras pero si se recogen en ese estado y se almacenan a temperatura normal,

10
las rajaduras cicatrizan. En Guatemala se acostumbra recogerlos de esta manera
madurándolos en cajones u otros lugares cerrados, (6).

Este árbol se distingue de las otras especies de Annonaceae porque tiene dos
clases de hojas, las corrientes obovadas, glabras, con pecíolo, y otras en forma de
brácteas, redondas, caedizas, sin pecíolo, que crecen en la base de las ramillas.
En el lado inferior de las hojas, ramillas y frutos, la superficie tiene un aspecto
pulverulento, blancuzco, que es más notable en las variedades de pulpa blanca.
Las flores tienen tres pétalos externos, de 2 a 5 cm de largo, y tres internos
diminutos; el color de las flores es una característica varietal y va de rosado a rojo
púrpura. El fruto, de unos 12 cm de largo, tiene pulpa blanca, rosada o rojiza, con
aroma típico y sabor dulce y exquisito, según la mayoría de las opiniones superior
al de la chirimoya. Los frutos son muy resistentes, o tal vez completamente
inmunes a los ataques del insecto barrenador de las semillas, (6, 7, 9).

Se cultiva sólo en huertos de pocos árboles, y se nota una amplia variabilidad.

Esta se expresa especialmente en características de los frutos: color, textura, que
puede ser desde ligeramente pastosa a jugosa, suave o con concentraciones de
granos más duros, sabor dulce y con aroma típico, (6, 7).

3.2.4. Annona purpurea L. (sincuya, soncoya, chincuya).

Originaria de México y Centro América, es escasamente cultivada. Es un árbol

bajo, de follaje espaciado; las hojas son grandes y delgadas, elípticas a obovadas,
miden de 15 a 30 cm de largo por 10 a 15 cm de ancho. Las láminas son muy
onduladas pues los nervios están marcadamente hundidos en la cara superior (ver
figura 5), (6).

11
 FIGURA 5. Ejemplos de Frutos de Annona purpurea

Por lo común en los tallos jóvenes, los pecíolos y nervios de la hoja, muestran
pubescencia rojiza. Las flores son grandes, con los pétalos externos de 4 a 5 cm
de largo, flexibles y amarillentos con manchas violetas en el lado interno; los
pétalos internos son más cortos, de 3 a 4 cm de largo. El receptáculo cónico mide
alrededor de 2 cm de largo por 1.5 cm de ancho y en su parte inferior está cubierto
de estambres y al ápice por un anillo de carpelos. El fruto es ovoide a esférico,
mide de 10 a 14 cm de ancho y está cubierto de un tomento amarillo o rojizo. Los
carpelos tienen prominencias piramidales muy desarrolladas, hasta de 2 cm de
largo, con los ápices curvos hacia la base de la fruta. La pulpa es dura, amarilla a
anaranjada, aromática. Las semillas elípticas, de color café claro, miden de 2.5 a 3
cm de largo, (6, 7).

3.2.5. Annona reticulata L. (anona, anona colorada, anona rosada, corazón).

Aunque se dice que esta especie es nativa de las Antillas, la presencia en

Guatemala y Belice de una variedad silvestre, A. reticulata var. primigenia, y de
una variabilidad muy amplia de cultivares lo cual indica que esta zona puede
considerarse como la region de origen de la especie, (ver figura 6), (6).

12
 FIGURA 6. Fruto de Annona reticulata

Se ha introducido en otras regiones de los trópicos americanos y del sureste de

Asia, sin que haya llegado a alcanzar una importancia comparable a la A.
cherimola y la de A. squamosa. Lo que más atrae de esta especie son los frutos
de sabor muy agradable, generalmente dulce y cremoso, el volumen ocupado por
la cáscara y la semilla, relativamente pequeño, y el que la planta no es demasiado
exigente en cuanto a suelos, el fruto es acorazonado o esférico, de 8-15 cm de
diámetro; la pulpa variable según el cultivar, desde jugosa y muy aromática, hasta
dura y de sabor repulsivo. Es un árbol bajo, de copa abierta e irregular, con hojas
delgadas y glabras, en algunas variedades largas y estrechas, de 10 a 20 y 2 a 7
cm, rectas y agudas en el ápice; en otras arrugadas y hasta de 10 cm de ancho.
Las flores por lo común en grupos de 3 ó 4, con los tres pétalos externos largos y
los tres internos muy pequeños, alta variabilidad en la presencia de grupos de
células duras, como granos de arena. El color externo e interno varía según el
cultivar. A. reticulata crece en América Central en las áreas de estaciones
alternas, entre 0-1500 m, y se ha extendido a América del Sur. Pero es en la
primera donde se encuentran las variedades que antes se habían clasificado como
especies: primigenia, ya mencionada y lutescens, la anona amarilla, que crece de
México a Costa Rica, (6, 7, 8).

13
3.3. LAS ANNONACEAE EN COLOMBIA

Las principales Annonas que se encuentran cultivadas en Colombia para su

producción son en su orden: Annona muricata, Annona cherimola y Annona
blanca. Otras especies de menor importancia se encuentran en forma silvestre
estas son: Rollinia mucosa Bail, Annona colorada y Annona atemoya (hibrido no
comercial), (9).

Existe un especie dentro de la familia de las Annonaceae como es la Annona

muricata; que ha comenzado a perfilarse en los últimos años como uno de los
frutales promisorios que se postulan como una alternativa de desarrollo sostenible
en algunas regiones del país como Tolima, Huila, Valle del Cauca, Costa Atlántica,
Eje Cafetero, ya que estas zonas presentan un clima adecuado para su cultivo, (9,
10).

En Colombia según una encuesta realizada en el año 1999, indicó que en el país
se encontraban 4626.4 hectáreas sembradas pertenecientes a la familia de las
Annonaceae, pero aclarando que de estas mas o menos 1700 pertenecen a los
cultivos establecidos de Annona muricata, principalmente en los departamentos de
Tolima, Huila, Antioquia, Valle de Cauca y el Eje Cafetero. Una característica
común de esta especie de Annonaceae, es su potencial económico, ya que por su
alto valor nutritivo y las diversas formas de transformación que pueden tener sus
frutos, logran enormes posibilidades de crear su propio espacio en el mercado
local e internacional. Aun así su cultivo comercial es escaso, por lo cual
actualmente se viene realizando avances tecnológicos para reactivar el cultivo en
todo el país de las diferentes Annonaceae y así disminuir las altas tasas de
importación de Venezuela y Ecuador, (9).

14
3.4. COMPUESTOS ACTIVOS DE LAS ANNONACEAE

Los compuestos de interés por su comprobada actividad biológica presentes en

las Annonaceae se conocen como acetogeninas, estas son un grupo de
sustancias conformadas por una cadena larga de C-32 o C-34 de ácidos grasos
que pueden estar combinados con una unidad 2-propanol en el C-2 para formar
una γ-lactona; las cuales presentan diferentes bioactividades como antitumoral
inmunosupresiva, pesticida, antiprotozoal y antimicrobiana. De las Annonaceae, se
han reportado numerosas acetogeninas aisladas e identificadas tales como la
Uvaracina, la primera que fue aislada de la planta de Uvaria accuminata en 1982,
(10, 11).
Se ha reportado que las acetogeninas de Annonaceae pueden inhibir
selectivamente el crecimiento de las células cancerígenas y también inhibir el
crecimiento de células resistentes. Las acetogeninas son potentes inhibidores de
la NADH ubiquinona oxidoreductasa, que es una esencial enzima en el Complejo I
de la cadena respiratoria mitocondrial, (10, 11, 12).

3.4.1 CLASIFICACION DE LAS ACETOGENINAS DE ANNONACEAE

Las acetogeninas de Annonaceae se clasifican según la cantidad de anillos que

tengan en su estructura (Ver tabla 3), como son:
Mono-Tetrahidrofurano (THF), adyacentes bis-THF, no adyacentes bis-THF y sin
anillo mono –THF estas estructuras también poseen hidroxilos laterales los cuales
pueden estar a uno u otro lado de la estructura, seguida por una subclasificación
de las γ-lactonas o sustituidas por cetolactonas, (12, 13).
Muchas acetogeninas de Annonaceae han sido encontradas y clasificadas por
síntesis total o por el método de Ester Mosher, (13, 14).

15
TABLA 3. CLASIFICACION DE ACETOGENINAS DE ANNONACEAE, (14), (15).

CON ANILLOS:

A ce tog en ina s a dyacen tes b is-T H F

A c e to g e n in a m o n o - T H F

O O O

OH R OH R

Acetogeninas no adyacentes bis-THF

OH OH

O
O

SIN ANILLOS:

A c e to g e n in a s s in a n illo s - T H F

(R)

SUBCLASIFICACION DE ACETOGENINAS CON ANILLOS LACTONA

TERMINALES
R2
R1 Anillo hidroxilados y reducidos
O Cetolactonas cis o trans OH

O
R 1= H 1O H R
O O
R 2=H 1O H
O O

16
3.4.2 SEPARACION E IDENTIFICACION DE LAS ACETOGENINAS.

Las acetogeninas de Annonaceae son fácilmente solubles en la gran mayoría de

los solventes orgánicos. La extracción por etanol del material seco de la planta
seguida por la partición de solventes para concentrar los componentes, (16).
Se han reportado algunas técnicas nuevas para el aislamiento de acetogeninas a
partir de la planta; siendo los mas utilizados, la extracción por filtración en frió y la
extracción en éter, hexano y etanol, (16).

Se han reportado varias metodologías para la extracción de acetogeninas, las

cuales se pueden obtener de las hojas, semillas y raíces, (7,10, 17, 18, 19, 20).
Así mismo para la extracción de Acetogeninas de las semillas y hojas de Annona
muricata se han dado a conocer varios procedimientos, (10, 21, 22).
Para la extracción de acetogeninas de otras especies de la familia de Annonaceae
como: Annona crassiflora, Annona squamosa, Annona montana, Annona
sennegalencis, Rollina mucosa, Annona bullata rich, Annona cherimola, Annona
glauca, Annona reticulata y Annona atemoya, se pueden encontrar varias
metodologías, (23, 24, 25, 26, 27, 28, 29), entre otras.

Para la identificación de las diferentes acetogeninas es necesario conocer las

configuraciones, la posición de los anillos, la posición de los diferentes grupos y el
peso molecular de cada estructura para lo cual se han utilizado técnicas como
resonancia magnética nuclear (RMN), infrarrojo (IR) y espectrometría de masas
(EM), (22), (23), (24).

Otra de las formas de identificación que viene siendo utilizada es el método del
Ester Mosher, el cual permite la determinación estereoquímica absoluta por medio
de epimeros y enantiomeros de las acetogeninas, (23), (24), (25).

17
3.4.3 MECANISMO DE ACCION DE LAS ACETOGENINAS DE ANNONACEAE

Una serie de experimentos han mostrado que las acetogeninas de Annonaceae

son inhibidoras de la enzima NADH en el complejo I de la cadena respiratoria
mitocondrial. Se encontró que inicialmente la toxicidad presentada por la
exposición de insectos a las acetogeninas de Annonaceae, incluye una
disminución lenta en la movilidad y crecimiento antes de la muerte. Tales síntomas
son normalmente atribuidos a los bajos niveles de ATP causados por los
inhibidores respiratorios, sin embargo se requiere de estudios futuros para conocer
el tipo de organismo susceptible a estos componentes, incluyendo mamíferos,
(16).

18
 4. ACTIVIDAD BIOLOGICA

La actividad biológica es la capacidad que tiene el material de interactuar

químicamente con los tejidos del organismo, es una expresión que describe los
efectos beneficiosos o nocivos de un extracto en organismos vivos. Cuando la
droga es una mezcla química compleja esta actividad es ejercida por el
ingrediente activo de la sustancia pero se puede modificar por los otros
componentes. La clase principal de actividad biológica es la toxicidad de una
sustancia. La actividad biológica se toma generalmente para describir los efectos
beneficiosos en algún tipo de organismo, (30).
Así mismo, se han estudiado una gran cantidad de compuestos activos
provenientes de extractos de origen vegetal, los cuales cuentan con algunas
actividades importantes como son: antiparasitaria, antifúngica, antibacterial,
antitumoral, antioxidante, antimicótico, citotóxica, biopesticida, entre otras, (5, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41).

De igual forma como ejemplos de algunos estudios realizados de diferentes

extractos con actividad biológica se pueden citar en la siguiente tabla:

TABLA 4. EJEMPLOS DE ACTIVIDADES BIOLOGICAS

ACTIVIDAD EXTRACTO OBJETIVO REFERENCIA

BIOLOGICA BIBLIOGRAFICA

Decocción de Demostrar que la Mentha

Antiparasitaria Mentha piperita Linn posee un efecto (31)
piperita Lin.n antiparasitario presente en
las hojas de esta planta.

19
 Alcaloide Realizar la extracción,
Aislado de elucidación estructural y
Antifúngica berberis actividad antifúngica de (32)
serrato- Lauberina.
dentata.

Determinar el efecto
Antibacterial Infusión del té antibacterial de la infusión
verde. del té verde en la formación (33)
de placa bacteriana por
Streptococcus mutans.

Extractos de Evaluar la actividad

Plantas de la antitumoral de 27 extractos
Antitumoral Flora obtenidos de plantas de la (34)
Cubana. flora cubana en el tumor
señal murino Leucemia
linfocítica trasplantado en
ratones.

Especies Determinar la composición

Aromáticas y química y actividad
Medicinales antioxidante de extractos de
Antioxidante con Alto seis especies vegetales (35, 36, 37)
Contenido de (tomillo, oréganos común,
Timol y cimarrón, de castilla, rastrero
Carvacrol. y mejorana) y cuatro aceites
esenciales.

20
 Extractos Estudiar cinco especies de
Acuosos holoturidas que muestran
Antimicótico Obtenidos a actividad hemolítica:
Partir de Ludwigothuria mexicana, (38, 39)
Invertebrados L.grisea,Fossothuria cubana,
Marinos. Istchopus badionotus y
Trachytionidium occidentale.

Extractos de Realizar un ensayo

Citotóxica Solanum biodirigido de citotoxicidad (40, 41)
melongena L. frente a tres líneas celulares
(Solanaceae). tumorales humanas.

Extractos de Demostrar
Acetogeninas la eficiencia de acetogeninas (4)
Biopesticida de Annonaceae para el manejo
Annonaceae integrado de plagas en
cultivos.

4.1. ACTIVIDAD BIOLOGICA BIOPESTICIDA

Los biopesticidas o Agentes de Control Biológico (ACB) son productos que

contienen un ingrediente activo o bien se extraen de un ser vivo mediante
procedimientos que no alteran su composición química. Pueden estar constituidos
por toda o una parte de la sustancia extraída, concentrada o no, adicionada o no a
sustancias coadyuvantes, (16, 42)
Una gran variedad de biopesticidas naturales se han desarrollado y aprobado para
el control de plagas de insectos, pestes y enfermedades bacterianas, estos

21
nuevos derivados botánicos resultan mas amigables con el medio ambiente, y
además se pueden convertir en una herramienta útil para los cultivos de alimentos
donde no se pueda fumigar, (17, 43, 44).

Así mismo los biopesticidas son un grupo de pesticidas que pueden reducir el
riesgo del uso de pesticidas. Los biopesticidas en general:

• Tienen un espectro de acción muy limitado y un modo de acción específico;

• Actúan lentamente;
• Tienen tiempos críticos de aplicación;
• Suprime, no elimina la población de la plaga;
• Tienen una persistencia limitada en el campo y tienen una vida de almacén
limitada.
• Son más seguros a los humanos y al medio ambiente que los pesticidas
convencionales.
• No presenta problemas residuales, (45).

De igual forma los productos a base de microorganismos presentan como

principales ventajas y desventajas.

Ventajas:
1. La especificidad en su actuación
2. Respeto al medio ambiente
3. Los patógenos tienden a desarrollar menor resistencia a productos
microbianos que a productos químicos, (45).

Desventajas:
1. Una efectividad de control en general menor que los productos químicos
2. Generalmente su acción no es inmediata
3. Dificultades de producción a nivel comercial

22
 4. Necesidad de resolver problemas técnicos como la sensibilidad a
factores ambientales (temperatura, radiación UV, humedad) que
presentan la mayoría de estos productos, (45).

4.1.1. Clasificación de los Biopesticidas

4.1.1.1. Bioinsecticidas

Históricamente los bioinsecticidas han sido los más estudiados de los

biopesticidas. Estos pueden estar formulados a base de bacterias, virus, u hongos:

a. Bacterias: la mayoría de productos están basados en diferentes cepas de la

bacteria gram-positiva Bacillus thuringiensis Berliner, la cual produce toxinas
específicas (δ-endotoxinas) tóxicas para diferentes órdenes de insectos. Otro tipo
de productos se basan en la extracción de la δ-endotoxina que es incorporada a
un plásmido que se inserta a un aislado de Pseudomonas fluorescens. A las
células bacterianas recombinantes se les permite crecer en un medio de cultivo
adecuado para que expresen la δ-endotoxina y posteriormente se les aplica un
tratamiento de alta temperatura. Las células bacterianas muertas sirven de
microcápsulas que protegen a la toxina de Bacillus thuringiensis, (45).

A nivel comercial, las bacterias se multiplican generalmente en un tanque de

fermentación líquida. Los ACB (Agentes de Control Biológico) pueden ser
formulados en estado de dormancia o pueden ser metabólicamente activos. Las
formulaciones que contienen células activas son menos tolerantes a fluctuaciones
ambientales, menos compatibles con productos químicos, de vida más corta, y
requieren un empaquetamiento que permita el intercambio de gases y de
humedad. Sus ventajas son que al estar activas, empiezan actuar en el momento
de su aplicación, (45, 46).

23
b. Virus: otra estrategia consiste en utilizar diferentes virus que poseen una
elevada especificidad en sus huéspedes. Estos productos no han tenido el éxito
que cabría esperar, debido a su bajo nivel de virulencia, poca estabilidad a la luz
UV, dificultades en la reproducción y una pobre persistencia en el entorno, (46).

c. Hongos: de entre ellos destacan Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y

Paecilomyces fumosoreus para el control de la mosca blanca, Verticillium lecanii
para áfidos, y Metarrhizium anisopilae y M. flavoviride Gams y Rozsypal para
cucarachas. Estos productos se aplican directamente sobre el insecto en forma de
polvo, emulsión o polvo mojable. En condiciones de campo, pueden aplicarse
mezclados con aceites a volúmenes ultrabajos a fin de incrementar su eficacia y
proteger el ACB de la radiación solar, (45, 46).

4.1.1.2. Biofungicidas

Muchos han sido los organismos que de manera experimental han sido aislados y
se ha probado su actividad fungicida, aunque no todos han desarrollado un
producto comercial. En general son productos formulados a base de bacterias u
hongos, (47).

a. Bacterias: es posible encontrar en el mercado distintos productos de origen

bacteriano para el control de hongos de raíz y cuello a base de diferentes aislados
de los géneros Bacillus, Pseudomonas y Streptomyces, (47).

b. Hongos: existe un considerable trabajo realizado con Trichoderma y

Gliocladium debido a su fácil aislamiento, cultivo y fermentación a gran escala.
Otros hongos como Ampelomyces quisqualis Cesati ex Schlecht., Fusarium
oxysporium Schlecht., Phytium oligandrum Drechler, Coniothyrium minitans
Campell y Phlebiopsis gigantea también han desarrollado distintos productos
comerciales, (46, 47).

24
4.1.1.3. Bioherbicidas

Los bioherbicidas son productos basados en microorganismos capaces de matar

selectivamente las malas hierbas sin dañar los cultivos. Estos ACB pueden ser de
origen bacteriano o bien fúngico, (46).

a. Bacterias: Requieren una elevada humedad y presencia de heridas o entradas

naturales en la planta, (45, 46).

b. Hongos: la temperatura y la humedad son las principales limitaciones para su

eficacia, (45).

4.1.1.4. Biobactericidas

Hasta el momento solamente existen productos basados en bacterias como ACB

para el control de enfermedades bacterianas, (45, 47).

4.1.1.5. Bionematicidas

Pocos son los productos bionematicidas que se comercializan. La mayoría de

organismos estudiados son de tipo fúngico aunque también existen algunas
bacterias, (47):

a. Bacterias: ensayos realizados desde hace décadas con Pasteuria penetrans,

Sayre y Starr demuestran su capacidad en controlar nematodos, pero la
complejidad del cultivo, y la dificultad de producir esporas en cantidades elevadas
13
(10 esporas/L), y la especificidad huésped-bacteria, son las principales
limitaciones para su uso a nivel comercial, (46, 47).

b. Hongos: Ciertas especies de hongos como Nematophtora gynophila Kerry y

Crump, Arthrobotrys oligospora Fresenius, Paecylomyces lilacinus, y Verticillum

25
chlamydosporium Goddard son parásitos de nemátodos. Pero su producción a
nivel comercial no existe debido a su lento crecimiento en condiciones in vitro, el
poco tiempo de supervivencia del cultivo, sus requerimientos nutricionales y
algunas inconsistencias entre los distintos ensayos de campo, (46, 47).

4.1.2. BIOPESTICIDAS A PARTIR DE EXTRACTOS VEGETALES.

La obtención de insecticidas a partir de fuentes naturales especialmente de

plantas, donde se aprovecha los mecanismos de defensa química, que las propias
plantas han desarrollado a través de la evolución; presenta la ventaja de no
introducir en el medio natural productos ajenos al mismo, y además este medio
natural es capaz de degradarlos. Entre los insecticidas biológicos más utilizados,
están los preparados a base de pelitre (extracto de Chrysanthemum
cinerariaefolium), la rotenona (extracto de raíces de Derris ellíptica), los
preparados a base de plantas como adelfa, ajo, ortiga, el Equisetum arvense o
Cola de Caballo, y otros preparados a base de Azadirachta indica (árbol del
Neem), (48, 49).

4.1.2.1. Insecticidas Derivados de Plantas y Productos Naturales.

• Nicotina: Es un extracto del tabaco que para los animales de sangre

caliente es muy tóxico. Comercialmente la nicotina sólo se vende a
horticultores profesionales. Como insecticida natural se elabora con un
concentrado líquido de sulfato de nicotina que se diluye en agua
aplicándolo en asperción sobre las plantas a tratar. También existe en polvo
pero este puede irritar la piel. La nicotina se utiliza principalmente contra
insectos perforadores-chupadores como los pulgones, moscas blancas,
tisanópteros y saltadores de las hojas, (48, 49).

26
• Rotenona: Se utiliza en forma de asperción y de polvo. En los animales
de sangre caliente produce baja toxicidad y no deja ningún residuo dañino
en los cultivos de la huerta; este es tóxico para los peces, insectos
beneficiosos, huevos, larvas y en menor grado para los adultos de las
mariquitas y altamente tóxico para las moscas neurópteras verdes adultas,
algunas abejas parásitas y para los ácaros depredadores y para las abejas
melíferas, (49).

• Riania: Se usa como insecticida y proviene de la madera, la variedad

Ryania speciosa que contiene un principio activo denominado rianodina que
se usa principalmente contra la mariposa nocturna de la manzana. Presenta
una baja toxicidad en los animales de sangre caliente y es venenosa en la
mayoría de insectos beneficiosos y ácaros depredadores por contacto como
por ingestión, (48, 49).

• Quassia: La quassia proviene de las plantas de la familia de las

Simarubaceas (todas las especies de Balanites, Picrasma y Quassia) y se
utiliza como pesticida natural. La cuasia se presenta por lo general en forma
de astillas de madera que se hierven en agua y luego se utiliza en forma de
asperción contra pulgones, orugas de mosca sierra y ácaros (48, 49).

• Cebadilla: Se extrae de la planta Schoenocaulon officinale. Es un

insecticida venenoso si se ingiere y altamente tóxico para las abejas
melíferas y mamíferos. Este potente insecticida natural se deteriora de
forma rápida con la presencia de la luz y no se debe aplicar antes del
anochecer lo que además minimiza sus efectos sobre las abejas. La
cebadilla es muy utilizada en los EE.UU. como insecticida general contra un
gran número de plagas, (49).

• Piretro: Es elaborado principalmente con la flor del Crysanthemum

cinerariafolium, una planta que contiene numerosos componentes
insecticidas que se denominan Piretros. Al igual que la cebadilla, el piretro

27
 se descompone de forma rápida con la presencia de la luz dejando pocos
efectos residuales. Es tóxico para las plagas de moscas, pulgones,
tisanópteros, moscas blancas y otras plagas de insectos al igual que para
las mariquitas, avispas parásitas y peces, (48, 49).

• Almidón de la patata: Es un insecticida de contacto que se elabora a partir

de los hidratos de carbono de la patata. Es efectivo contra pulgones,
chinches de las plantas y ácaros, (48).

4.2. PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA Y ORGANISMOS MODELOS.

Estas pruebas determinan si los compuestos en investigación sirven como

antibióticos y actúan contra bacterias, virus y hongos. Igualmente se estudia si
tienen algún efecto sobre el sistema nervioso central, además de ser antitumoral,
anticancerosa, hipotensora e hipoglicemiante. Hay otras pruebas que determinan
cómo la planta influye en la reproducción humana, si produce malformaciones
congénitas o si es neurotóxica, (50).

Estas actividades se pueden estudiar in vitro, o sea en el laboratorio, o in vivo con

seres vivos, éstas últimas se requieren permisos especiales. Cada organismo
modelo tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas para los investigadores,
que deben elegir cuidadosamente cuál es el mejor modelo para un experimento
particular. No obstante, cada vez más los científicos pueden escoger entre
diferentes especies, incluyendo algunos nuevos organismos modelos, tales como
los peces, para aprovechar las cualidades especiales de cada una, (51).
A pesar de todas las diferencias obvias entre, por ejemplo, una mosca y un ser
humano, y a pesar de las amplias variaciones en el número de genes y de
cromosomas que contienen, cada organismo tiene aproximadamente el mismo
número de proteínas fundamentales, (50, 51)
La experimentación animal ha sido base fundamental de los grandes avances de
los conocimientos biológicos y del bienestar del hombre y de los animales, (4).

28
Tanto las investigaciones biológicas básicas como las investigaciones aplicadas,
han determinado muchos adelantos importantes de la ciencia médica. Por eso
resulta indispensable seguir realizando investigaciones de ambas clases con el fin
de descubrir las causas, mecanismos, prevención y tratamiento de enfermedades
que aún no son bien conocidas por el hombre, así como para probar la eficacia e
inocuidad de muchos de los principios activos utilizados en medicina humana y
veterinaria, y en general para avanzar en el conocimiento biológico, (4).
Un requisito importante estipulado en los códigos de ética internacionales y en
muchas legislaciones nacionales para experimentación en seres humanos, es que
no se deben emplear nuevas sustancias ni dispositivos en seres humanos, a
menos que las pruebas previamente efectuadas en animales, permitan hacer una
suposición razonable de su inocuidad, (4, 52)
Los organismos modelos comúnmente empleados en medicina humana y
veterinaria se utilizan animales tales como: levadura (Saccharomyces cerevisiae),
gusano (Caenorhabditis elegans), mosca (Drosophila melanogaster) y ratón (Mus
musculus), en investigaciones fisiológicas, patológicas, farmacológicas,
toxicológicas, terapéuticas y de conducta, en cirugía experimental, en ensayos de
medicamentos y preparados biológicos, y también con fines docentes en todas
estas disciplinas, incluyendo la formación quirúrgica, (52, 53)
Además de los experimentos, los animales son indispensables para probar la
potencia e inocuidad de muchas de las sustancias biológicas utilizadas en
medicina humana y veterinaria, (53).
Las pruebas de actividad biológica son, además, esenciales para las numerosas
sustancias sintéticas que jamás existieron en la naturaleza: productos
farmacéuticos, aditivos alimentarios y productos químicos agrícolas, y es evidente
que dichas pruebas sólo pueden realizarse con animales, aunque los sujetos de
las pruebas definitivas sean seres humanos en contacto directo o indirecto con las
mencionadas sustancias, (53, 54).

Particularmente los dos organismos modelos mas empleados (Ver tabla 2) para
evaluar posible actividad biológica biopesticida son: la Artemia salina y los

29
Mosquitos (Diptera: Culicidae). A pesar de sus obvias diferencias de tamaño y
forma de vida, estos organismos modelos producen proteínas que realizan las
mismas funciones básicas que en los seres humanos: le indican al organismo
cuándo y cómo crecer, reproducirse, combatir el estrés y eventualmente morir,
(51, 54).
En la siguiente tabla se presenta una breve descripción de los dos organismos
modelos seleccionados.

TABLA 5. ORGANISMOS MODELOS EMPLEADOS EN LA BUSQUEDA DE

BIOENSAYOS, (51, 55, 56).

CARACTERISTICAS

Mosquitos (Diptera: Artemia salina (Brine

Culicidae) Shrimps)

Organismo multicelular con un Mide entre 0,8 y 1,5 cm de

TAMAÑO comportamiento complejo, de 4 longitud y su morfología
mm de largo. cambia en función de la
cantidad de sal del agua.

2 a 3 meses. Una generación Se reproduce por medio de

nueva cada 10 días huevos (que pueden
LONGEVIDAD desecarse). Nacen 24 horas
después del desove y llegan a
ser adulta para reproducirse a
las 3 semanas
aproximadamente.

30
 165 millones de pares de bases Presenta 42 cromosomas, de
de ADN. 13.600 genes, de los 1 a 3 centromeros, diploides.
cuales cerca del 50% Posee un contenido elevado
GENOMA equivalentes humanos en proteínas y sirven como
alimento para invertebrados,
crustáceos y peces marinos,
de acuerdo a su fase de
evolución (larva o adulto).

4.2.1. LOS MOSQUITOS (DIPTERA: CULICIDAE) COMO ORGANISMO

MODELO.

Los mosquitos son insectos del orden Dípteros y de la familia Culicidae, que se
caracterizan por su pequeño tamaño, con abdomen delgado, alas estrechas,
antenas largas y extremadamente plumosas en los machos; presentan un aparato
bucal adaptado para picar, con una trompa o pico largo y no articulado, constituido
por el labio inferior, por lo que son chupadores labiales. El pico les sirve a los
machos para chupar el jugo o néctar de los vegetales y a las hembras, que son
hematófagas, para chupar la sangre de los vertebrados, (55, 56).

El ciclo de vida de un mosquito se desarrolla en cuatro etapas que son :

Huevo – esta encerrado en una cubierta de tres capas con un pasaje con aspecto
de embudo que facilita la entrada de espermatozoides. Los huevos son
depositados en el agua (ver figura 7), (55, 56, 57).

Larva – alargada, sin patas con pelos enrollados y ramificaciones transversales o

simples, distribuidos en todo su cuerpo pasa a través de cuatro etapas hasta

31
alcanzar la longitud de un adulto. Nadan desordenadamente alcanzando la
superficie para respirar (ver figura 7), (56, 57).

Pupa – megalocéfala, curva, que semeja un signo de puntuación coma. La pupa

se sumerge rápidamente con una sucesión de saltos como respuesta a estímulos
(ver figura 7), (57).

Adulto – al madurar la pupa la membrana es rota por la vesícula aérea y la

actividad del insecto adulto al escapar (ver figura 7), (56).

FIGURA 7. CICLO DE VIDA DE UN MOSQUITO, (55, 56)

Los mosquitos de la familia Culicidae constituyen el grupo de insectos más

importantes a nivel mundial desde el punto de vista médico y veterinario.
El hábito hematófago de las hembras los convierte frecuentemente en plagas
sanitarias muy molestas, además de que al través de su picadura pueden
transmitir varios agentes patógenos causantes de enfermedades entre los
vertebrados. Diversas encefalitis, la fiebre amarilla, el dengue, la malaria y ciertas
filariasis, son ejemplos de enfermedades en las que los mosquitos funcionan como

32
vectores. Estas enfermedades han cobrado a lo largo de la historia millones de
vidas y muchas de ellas continúan siendo hoy día problemas de salud prioritarios
especialmente en los trópicos y subtrópicos. Además, diversos factores como el
cambio climático global, la colonización humana de nuevos ambientes, el mercado
internacional, el transporte moderno, entre otros, favorecen la posibilidad de que
se establezcan poblaciones de vectores exóticos y que circulen patógenos en
áreas que previamente estaban libres de ellos, (55, 56, 57).

4.2.1.1. GENEROS DE LA FAMILIA CULICIDAE

Mosquito Culex quinquefasciatus: Muchas especies del género Culex (Ver

figura 8) con sus subgéneros, están distribuidos por todo el mundo, principalmente
en regiones cálidas. Estos mosquitos, pequeños o de mediano tamaño, viven
principalmente en masas permanentes de agua y su distribución es urbana y rural,
(55, 56).

FIGURA 8. MOSQUITO DEL GENERO CULEX

Esta especie se ha relacionado con la transmisión de filarias como Wuchereria

bancrofti y Dirofilaria immitis, del virus del Nilo occidental y de los virus causantes
de la encefalitis de San Luis y la encefalitis equina venezolana, entre otros. En
áreas donde no existe riesgo de transmisión de agentes patógenos por parte de
esta especie, constituye un problema de salud pública debido a la alergia
ocasionada por su picadura y a las molestias causadas por las altas densidades
de población, (58).

33
Los estadios inmaduros se desarrollan preferiblemente en depósitos de agua y los
criaderos son variados, constituidos por aguas con un alto grado de
contaminación, abundante contenido de materia orgánica, con detritos en proceso
de fermentación y en ambientes sombreados cercanos al ambiente domiciliario,
(58, 59).
Debido a su antropofilia acentuada, la resistencia a los insecticidas, su capacidad
vectorial y a las altas densidades que puede llegar a alcanzar, Culex
quinquefasciatus es un factor de riesgo para las poblaciones urbanas. Por tanto, el
conocimiento de los aspectos biológicos, fisiológicos y bioquímicos de la especie
se constituyen en el primer paso que conlleva a la implementación de medidas
que conduzcan al control de las poblaciones de mosquitos en las áreas urbanas,
(58, 59, 60).

Mosquito Aedes aegypti: El género Aedes (ver figura 9) comprende muchas

especies de mosquitos de distribución cosmopólita. Viven en agujeros en los
árboles, o en estanques transitorios de agua dulces o corrientes. Muchas
especies de Norte América producen picaduras molestas. Ciertas especies
pueden actuar como transmisores de fiebre amarilla, dengue, wucheriasis y
encefalitis viral, (55, 56).

FIGURA 9. MOSQUITO DEL GENERO AEDES

Se caracteriza por sus hábitos intradomiciliarios, asociado directamente al hombre.

Sobre este mosquito han sido numerosos los estudios que se han realizado desde
que J. Finlay en el siglo XIX, lo describiera como el agente trasmisor de la fiebre
amarilla. Hoy se sabe que está asociado con la transmisión de dengue, en sus

34
formas clásica y hemorrágica. Desde 1947, cuando se lanza el Programa
Continental de Erradicación del mismo, hasta 1980, este vector se había eliminado
de la mayoría de los países de la región, (61).

Actualmente, el transporte pasivo de la especie, que el hombre efectúa por vía

aérea, marítima y terrestre de huevos, larvas y adultos de este culícido, lo ha
difundido, con consecuentes epidemias de dengue en la mayoría de los países
reinfectados, (61, 62).

Anopheles: Las abundantes espécies de Anopheles (Ver figura 10) varían mucho
en cuanto a el hábitat, encontrandose en campo abierto, áreas boscosas,
comunidades urbanas o rurales y a diversas altitudes. Las diversas especies
tienen muchas variaciones en cuanto a preferencias de hábitat, por lugares
sombrios o soleados, aguas dulces o muy saladas, estancadas o de corrientes
moderadas, también con amplios límites en contenido de oxígeno libre. Los
mosquitos anofelinos son los únicos transmisores del paludismo transmiten las
filariasis de Bancroft y de Malaya, (55, 56).

FIGURA 10. MOSQUITO DEL GENERO ANOPHELES

Es considerado como un vector primario de malaria en las Américas. Dada su

importancia médica ha sido necesario profundizar en el conocimiento de su
bionomía, en especial sobre la ecología de sus criaderos, para detectar factores
vulnerables que permitan utilizar esta información en la planificación de medidas
de control, (63, 64, 65).

35
Esta especie se reproduce en una gran diversidad de hábitats acuáticos. La
calidad del agua va desde clara a moderadamente turbia, puede ser salobre o
fresca, relativamente limpia o con moderada polución y la vegetación en sus
criaderos es diversa, (63).

4.2.2. LA ARTEMIA SALINA O BRINE SHRIMPS Y SU CLASIFICACION

FIGURA 11. ARTEMIA SALINA

El "camarón de salmuera" o "brine shrimp", conocido como Artemia LEACH, es el

crustáceo anostrácodo usado durante años como modelo para realizar
investigaciones en disciplinas básicas y/o aplicadas. El género Artemia agrupa
especies que viven y se reproducen en ambientes hipersalinos continentales o
costeros alrededor del mundo, excepto en la Antártica, (66, 67).

La clasificación sistemática de la Artemia hasta el nivel de género es dado por

Flössner (1972), (67):

• Clase: Crustacea
• Subclase: Branchiopoda
• Super Orden: Anostraca
• Familia: Artemiidae
• Género: Artemia

36
Originalmente la Artemia salina ha sido descrita como la única especie dentro del
género Artemia. Y desde el principio del siglo 20 investigaciones citológicas y
genéticas complementaron los métodos tradicionales de clasificación basados en
aspectos morfológicos. El género Artemia ha sido dividido en 6 especies
hermanas, (67, 68):

-Artemia salina Lymington, Inglaterra (actualmente extinta)

-Artemia tunisiana Europa
-Artemia franciscana América (Norte, Central y Sur)
-Artemia persimilis Argentina
-Artemia urmiana Iran
-Artemia monica Lago Mono, California-EUA.

4.2.2.1. DISTRIBUCION DE LA ARTEMIA SALINA

Hasta hoy se conoce que la Artemia se encuentra en casi 400 sitios esparcidos
sobre los cinco continentes. Su amplia distribución es atribuida a la dispersión
natural por el viento o por aves migratorias y/o introducción deliberada realizada
por el hombre con fines comerciales. Estos hábitas presentan características
climatológicas, ecológicas y fisico-químicas particulares, las cuales se reflejan en
variaciones en rasgos de la historia de vida, plasticidad fenotípica y/o
heterogeneidad genética, (66).

En poblaciones permanentes la Artemia está presente durante todo el año o

sobrevive a condiciones ambientales o climatológicas adversas en un estado de
protección bajo la forma de quistes o huevos latentes. Poblaciones no
permanentes de Artemia no pueden vencer condiciones ambientales o
climatológicas adversas y el hombre tiene la necesidad de reintroducir nuevas
poblaciones sobre una base anual, (66, 69).

37
La Artemia es un filtrador no-selectivo y se alimenta filtrando materia particulada
de origen biológico (detritus orgánico de aguas de manglares) así como también
de organismos vivos de tamaño apropiado (bacterias y algas microscópicas). De
hecho debido a la ausencia de predadores y competidores por alimento, la Artemia
frecuentemente se desarrolla en grandes monocultivos, y las densidades son
principalmente controladas por la limitación de alimento. La reproducción
ovovivípara (nauplios como descendencia) ocurre mayormente en niveles de baja
salinidad, considerando que los quistes (reproducción ovípara) son producidos en
salinidades más allá de 150 ppt, (67, 69).

4.2.2.2. CICLO DE VIDA DE LA ARTEMIA SALINA

El camarón de salmuera posee la propiedad de reproducirse de dos maneras

diferentes. Dependiendo de las condiciones ambientales ya sea larvas de libre
natación (ovoviviparidad) o quistes o huevos latentes (oviparidad). La Artemia es
capaz de sobrevivir condiciones ambientales extremas. Con la interrupción de la
condición de diapausa y con la transferencia de los quistes a condiciones óptimas
de incubación, (67).

La primera etapa larval de la Artemia (liberada como tal por ovoviviparidad

reproduciendo hembras o incubando fuera de los quistes), también llamada Instar
I, tiene un color castaño-anaranjado y cuyas medidas promedian 0,5 mm de
longitud. Los aspectos típicos de esta etapa son los 3 pares de extremidades en la
región frontal, cada una de ellas con funciones específicas: las primeras antenas
(o anténulas teniendo una función sensorial), las segundas antenas (con función
locomotora y filtradora) y las mandíbulas (con función de captura de alimento), (67,
70).

38
La larva Instar I es incapaz de tomar el alimento, ya que su sistema digestivo no
es aún funcional (la boca y el ano están todavía cerrados). Después de alrededor
de 12 horas el animal muda en la segunda etapa larval (Instar II). A partir de esta
etapa el sistema digestivo es funcional y pequeñas partículas de tamaño que
oscilan entre 1-40 mm pueden ser ingeridas (células de algas, bacterias, detrito),
(67).

La larva de Artemia crece a la etapa adulta mediante una serie de 15 mudas.

Durante este desarrollo larval las extremidades en la región frontal continuamente
se diferencian resultando en, la reducción gradual de las mandíbulas larvales,
finalmente reemplazadas por las mandíbulas del adulto y por un dimorfismo sexual
de las segundas antenas. En los machos éstas se desarrollan en agarraderas
musculares en forma de gancho que desempeñarán en el futuro un rol pre-
copulatorio. Las antenas de las hembras se degeneran en pequeños apéndices
sensoriales, (67, 71).

En la Artemia adulta el aparato filtrador alimentario de la larva es reemplazado por

las maxilas, las maxilulas y 11 pares de toracópodos que se desarrollan en la
región del tronco. Las últimas estructuras son multi-funcionales y juegan un rol no
solamente en la captación alimentaria pero también en la locomoción y
respiración, (67).

Dependiendo de la cepa y de las condiciones ambientales, la etapa de actividad

reproductiva se alcanza en un período de crecimiento de 2 a 3 semanas. La
Artemia adulta posee entonces una longitud 10-20 mm (los animales más grandes
son encontrados dentro de las poblaciones partenogenéticas), (70, 71).

Los machos tienen un par de penes en la parte posterior de la región del tronco
mientras que las hembras pueden ser fácilmente reconocidas por el distintivo saco
embrionario o útero que se ubica inmediatamente detrás el undécimo par de

39
toracópodos. El par de ovarios se sitúan detrás los toracópodos sobre ambos
lados del tracto digestivo lineal, (67, 68).

La pre-copulación en la Artemia bisexual madura es iniciada por el macho con el

apego a las hembras con sus agarraderas musculares. En esta "posición de
equitación" los animales pueden nadar conjuntamente por largos períodos de
tiempo mientras ellos mueven sus toracópodos en un golpe sincrónico. La real
copulación con la consecutiva fertilización consiste de un rápido reflejo del macho
en doblarse hacia adelante e introduciendo un pene en la apertura del útero. En la
Artemia partenogenética (poblaciones hembras) la fertilización no tiene lugar y el
desarrollo embrionario comienza tan pronto como los huevos alcanzan el útero,
(67, 68, 71).

A continuación se presenta el ciclo de vida de la Artemia salina figura 12.

FIGURA 12. CICLO DE VIDA DE LA ARTEMIA SALINA, (71).

40
4.2.2.3. LA IMPORTANCIA DE LA ARTEMIA SALINA EN LAS
INVESTIGACIONES.

Actualmente, la Artemia se utiliza como especie de bioensayo para una variedad

de objetivos tales como:
Investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y
muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas,
detección de toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de
modelos de acción tóxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de
contaminantes (72).

El potencial de Artemia para investigación y aplicaciones en toxicología acuática

se ha explorado desde 1975 en el Laboratorio de Investigación Biológica en
Toxicología Acuática de la Universidad Estatal de Ghent, Bélgica. En 1981 se
desarrolló el primer ensayo estandarizado de ecotoxicología marina: el ensayo
ARC (Agencia de Residuos de Catalunya), que es un ensayo de 24 (horas de 48)
horas para determinar la concentración letal media (CL50) en nauplios de ínstares
II y III. La confiabilidad y precisión de este ensayo fue investigada durante un
extenso ejercicio de calibración involucrando a 80 laboratorios americanos y
europeos, dando resultados muy satisfactorios. La experiencia obtenida desde
entonces ha abierto el camino para mejorar uno de los ensayos de tamizaje más
sencillos, más reproducible y rentable en toxicología acuática, (72).

41
 4.3. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LAS ACETOGENINAS DE ANNONACEAE

Las acetogeninas de Annonaceae son sustancias que poseen dos importantes

actividades biológicas, actividad citotóxica y actividad biopesticida (ver tablas 6 y
7); en la citotóxica se inhibe la enzima NADH en el complejo I en la cadena
respiratoria mitocondrial, esta acción agota el ATP e induce en las células una
muerte programada (apoptosis), se ha demostrado que las acetogeninas buscan
selectivamente las células cancerígenas para atacarlas y las células normales
permanecen intactas, (73, 74).
La actividad biopesticida además de ser favorable para el medio ambiente, es una
herramienta útil para los cultivos donde no se puede fumigar, (75, 76, 78).

TABLA 6. ACETOGENINAS DE ANNONACEAE CON ACTIVIDAD BIOLOGICA

BIOPESTICIDA, (16, 75, 76, 77, 78).
ANNONACEAE ACETOGENINAS AISLADAS

• Annonacina
Annona muricata • Corossolina
(Semillas) • Corossolona
• Diepomuricanina
• Gigantetrocina
• Gigantetrocina A
• Gigantetriocina
• Muricatetrocina
• Muricatetrocina A
• Murisolina
• Rolliniastatina 1
Guanábana • Rolliniastatina2
• Solamina

42
 Annona squamosa
(Corteza)
Nombre común o vulgar: Anón, • Bullatacina
Annona, Annona blanca, Annona del • Bullatacinona
Perú, Riñón • Squamona
El Anón es una fruta parecida a la
chirimoya, con escamas exteriores
muy pronunciadas.

Annona squamosa
(Semillas)

• Annonacina
• Annonacina A
• Annonastatina
• Annonin VI
• Annonin I
• Asimicina
• Bullatalicina
• Bullatanocina
• Neoannonina

43
 Asimina triloba
(Corteza-Tallo) • Annonacina
• Cis-Annonacina-A-one
• Trans-Annonacina-Aone
• Asimicina
• Bullatacina
• Bullatacinona
• Cis-Gigantetrocinona
• Tran- Gigantetrocinona
• Squamocina
• Trilobacina

Las acetogeninas que tienen mayor actividad biológica biopesticida son el

resultado de diferentes estudios en laboratorios; concluyendo entonces que las
acetogeninas más importantes para este tipo de actividad son las que se
presentan en la tabla 7, (16, 22, 42),

También algunos estudios realizados con acetogeninas de Annonaceae en

organismos modelos (mosquitos (Diptera:Culicidae) y Artemia salina); y su efecto
en un mosquito como es el Aedes aegypti demuestra el gran potencial insecticida
que poseen estos compuestos naturales (Ver tablas 8 y 9), (45).

44
 TABLA 7. ACETOGENINAS CON MAYOR ACTIVIDAD BIOPESTICIDA (16,
22,42).

ACETOGENINAS ESTRUCTURAS

ACETOGENINAS
DEL TIPO OH
CH3
ASIMICINA O
H3C O
Bullatacina o O

Asimicina, OH OH
O
Rolliniastatina-1,
Rolliniastatina-2.

OH

O
SQUAMOCINA CH3
O
O CH3 CH3
HO O

OH OH

CH3
H3C O
O O
ANONACINA
OH O

45
TABLA 8. ESTUDIOS REALIZADOS CON ACETOGENINAS DE ANNONACEAE
EN ARTEMIA SALINA Y MOSQUITOS (DIPTERA:CULICIDAE).

EXTRACTOS ORGANISMO OBJETIVO REFERENCIA

MODELO BIBLIOGRAFICA

Acetogeninas Realizar ensayos

Tripoxyrollin, Artemia salina citotoxicos in vitro (79)
scuamocin y sobre lineas
rolliniastatin-2. celulares KB y
VERO.

Extractos de Demostrar la
Annona muricata, Culex acción larvicida de
Ambrosia quinquefasciatus diferentes (59)
artemisiaefolia y extractos sobre el
Annona squamosa mosquito Culex
quinquefasciatus.

Evaluar la
toxicidad larvicida
de suspensiones
Extractos de Aedes aegypti acuosas de
Annona muricata extractos de las (80)
semillas, flores,
hojas, corteza de
ramas y corteza
de raices de la
annona muricata.

46
 Extractos de Larvas del IV Estudiar el efecto
semillas de Estadio de bioinsecticida de
Annona cherimolia Anopheles ambos extractos (81)
y Annona muricata sobre larvas del IV
estadio de
Anopheles.

47
 TABLA 9. DIFERENCIA ENTRE MOSQUITOS SANOS
Y AFECTADOS POR LA ACETOGENINA ANONACINA, (45).

En la pupa normal se desarrollan las

alas, patas y demás órganos del
mosquito del dengue. Las larvas normales tienen el cuerpo
arqueado, son semitransparentes y
tienen la cabeza pegada al tórax.

La anonacina provoca que la pupa

deje al descubierto las partes internas
de su cuerpo y no alcance a
completar su ciclo de desarrollo. Después de exponerla a la anonacina
la larva se rigidiza, la cabeza se
separa del tórax y la infección por la
sustancia ennegrece su cuerpo.

48
 5.0 PROTOCOLOS

A continuación se presenta una serie de protocolos resultado de una búsqueda en

diferentes fuentes, incluyendo entrevistas personales con investigadores de varias
universidades del país, donde se vienen haciendo pruebas de actividad biológica.

5.1. PROTOCOLOS CON ARTEMIA SALINA

5.1.1. PROCEDIMIENTO DEL LABORATORIO UNAL-DEPARTAMENTO DE

QUIMICA, GRUPO DE PRODUCTOS NATURALES, (82).

5.1.1.1. Incubación de huevos para la obtención de larvas:

Utilizar el sustrato de Artemia salina; huevos que se consiguen en el mercado en

las tiendas de alimentos para peces, se debe preparar agua de mar artificial, esta
agua de mar artificial se prepara, pesando 38 gramos de sal marina por litro de
agua y se filtra, con doble papel o con membrana, (filtrar 2 veces), (82).

Colocar 200mg de huevos en agua de mar a temperatura ambiente a un lado de

las divisiones del tanque y tapar ese lado (Ver figura 13); a las 24 horas
comienzan a eclosionar las larvas; se pueden utilizar máximo hasta la 48 horas, ya
que después de pasado este tiempo las larvas comienzan a morir de hambre, (82).

49
 FIGURA13. TANQUE PARA HUEVOS DE ARTEMIA

Permitir el transcurso de 2 días para la maduración de los brine shrimps (Ver

figura 14), (82).

FIGURA 14. MADURACION DE BRINE SHRIMPS

50
5.1.1. 2. Preparación de extractos y adición de larvas:

Se debe pesar 20mg del extracto a evaluar la cual se disuelve en un vial de boca
ancha, agregar 2mL de solvente el cual puede ser: etanol, metanol, hexano o
clroroformo, depende del extracto a usar; esta solución de (20mg/2mL) se
reparten en los viales que están agrupados de a tres (Ver figura 15), en los
cuales se deben tener tres concentraciones y un control, (82).

FIGURA 15. VIALES AGRUPADOS DE A TRES

Concentración 1: colocar 0.5mL de la solución patrón.

Concentración 2: adicionar 50 µL de la solución patrón.
Concentración 3: en cada uno de los viales adicionar 5 µL de la solución patrón.
Dejar evaporar el solvente; 2 días después al tener las larvas eclosionadas, se
hace el bioensayo de la siguiente manera:

• Colocar 20 µL de dimetilsulfoxido en todos los viales (también en los

controles). El dimetilsulfoxido se agrega porque es soluble en agua y
ayuda a la disolución, a que los compuestos del extracto pasen a la
solución acuosa, es decir crea una interfase.
• Adicionar 2mL de agua de mar a cada vial.
• Sacar las larvas del tanque, filtrar, (82).

51
 • Contar 10 larvas o nauplis las cuales se separan y se decantan de las
cáscaras con ayuda de una pipeta pasteur y un vaso de precipitado,
(82).

• Adicionar las larvas en cada vial (minimo 10 larvas) y llevar a un

volumen de 5mL (completar con agua de mar), dejar a temperatura
ambiente por 24 horas, (82).

5.1.1. 3. Análisis de mortalidad de las larvas:

Se evalúa el nivel de mortalidad utilizando cajas de petri pequeñas, se vierten allí

los contenidos de los viales y se espera que estos se estabilicen (Ver figura 16)
(se lavan los viales con agua de mar para asegurarse de que todas las larvas
salgan del vial a la caja de petri). Hacer una observación frente a una luz para
evaluar la movilidad de las larvas. Contar las larvas vivas y muertas, (82).

FIGURA 16. EVALUANDO MOVILIDAD DE LARVAS

Analizar los datos con un programa de computador para de terminar los valores
del DL50 (Ver anexo 3 y 4), (82).

52
5.1.2 PROCEDIMIENTO DE LA UNIVERSIDAD DEL QUINDIO, (83).

5.1.2.1. Incubación de huevos para la obtención de larvas:

Se adecua un recipiente plástico, de tal forma que quede dividido en dos

secciones por un tabique del mismo material al cual se le acondicionan pequeños
agujeros, la mitad del recipiente se oscurece con papel carbón en su exterior. Se
agregan, en la parte oscura del recipiente, aproximadamente 0.1 gramos de
huevos de Artemia salina por cada litro de solución salina, la cual se prepara
disolviendo 38 gramos de sal marina en un litro de agua potable comercial; la
utilización de agua comercial en lugar de agua destilada se debe al bajo nivel de
DO (Oxigeno Disuelto) en el agua destilada, la cual para su obtención es sometida
a un fuerte proceso de destilación que elimina la mayor parte del oxígeno disuelto
en ella; este cambio permite eliminar del procedimiento el suministro de aire a
través de bombas. A las 48 horas a temperatura ambiente e iluminación constante
las larvas de Artemia salina Leach son tomadas de a diez para someterlas a las
diferentes concentraciones de los extractos con la ayuda de una pipeta pasteur,
(83).

5.1.2.2. Preparación de extractos y adición de larvas:

A partir del residuo seco del extracto obtenido de la especie vegetal, se prepara
con agua destilada un patrón de 1000 mg de extracto por litro de solución, del cual
se preparan ocho diluciones de 6, 10, 24, 50, 100, 240, 500 y 1000 ppm de
concentración. Se adiciona un mililitro de cada dilución de extracto en un vial, se
transfirieren diez larvas de Artemia salina, tomadas con una pipeta pasteur, en
aproximadamente un mililitro de solución salina y se completa hasta cinco mililitros
con la misma solución salina en la que estaban las larvas, paralelamente se
prepararan cinco blancos por dilución de extracto de la siguiente forma: se toman
10 larvas en un vial y se completa el volumen de cada uno a 5 mililitros con
solución salina en la cual estaban las larvas. Se incuban los tubos a la luz de una
bombilla durante 24 horas, al cabo de los cuales se cuenta el número de larvas
muertas en cada tubo, después de este primer conteo se dejan los viales en las

53
mismas condiciones y se cuentan las larvas muertas al cabo de 48 horas de
sembradas, (83).

5.1.2.3. Análisis estadístico:

Con los datos obtenidos se determina la DL50 con el 95% de confianza utilizando
el método Probit, (83).

54
5.1.3 PROCEDIMIENTO DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA,
(84).

5.1.3.1. Cultivo de las Larvas de Artemia salina:

Colocar los huevos dentro de un recipiente plástico de 11.3 cm de alto, 9.5 cm de

largo y 10.5 cm de ancho, luego agregar una solución de agua de mar preparada
en el laboratorio con 37g de sal de mar y 1litro de agua destilada, cubrir el
recipiente con una tapa que tiene en el centro un orificio de un diámetro de 4 cm.
El agua debe llegar hasta este orificio. Se coloca aireación al recipiente utilizando
una de las salidas de aire en el laboratorio, a la cual se le conecta un tubo plástico
y su extremo se une a un filtro poroso que se coloca dentro del recipiente para
cultivo de las larvas, (84).

5.1.3.2. Adición de larvas:

Se toma un frasco plástico cilíndrico de 7.5 cm de alto, 4.7 cm de diámetro, color

transparente y con tapa plástica que tiene un orificio en el centro de 0.5cm, el cual
contiene agua de mar y se coloca invertido dentro del orificio de la tapa del
recipiente donde se colocaron los huevos de Artemia salina; 48 horas después se
inicia la recolección de las larvas, utilizando una pipeta Pasteur 5 ¾ pulgadas se
toman larvas del recipiente de recolección y se colocan en un acuario (tubo de
vidrio tapa rosca de 8ml de capacidad, 6 cm de alto y con un diámetro de 1.2cm)
que contiene 5ml de agua de mar, (84).

5.1.3.3. Análisis estadístico:

Se colocan 10ml de la solución del compuesto a probar y se hace lectura a las 24

horas, (84).

55
5.2 PROTOCOLOS CON MOSQUITOS

5.2.1 PROCEDIMIENTO #1 PARA LA EVALUACIÓN DE TOXICIDAD CON

MOSQUITO CULEX. QUINQUEFASCIATUS, (85).

5.2.1.1. Cría del mosquito Cx. quinquefasciatus:

Para iniciar la cría se colectan huevos, larvas y pupas del mosquito Cx.
quinquefasciatus en estanques con agua sucia y en floreros, se deben colocar en
bandejas de plástico (47x35x12 cm) con agua, para su desarrollo en el laboratorio.
Las pupas formadas se colectan diariamente y se depositan en una bandeja de
plástico (24x19x9 cm) con agua. La bandeja con pupas se introduce en una jaula
entomológica (60x60x60cm) y a los adultos emergidos dentro de ésta se les
alimenta de dos maneras: con agua azucarada para los machos y adicionalmente
para las hembras se coloca un pollo (inmovilizado en una pequeña jaula) como
recurso hematofágico. Los huevos depositados en la superficie del agua, se
colectan diariamente y se colocan en bandejas de plástico (47x35x12 cm) con
agua para su eclosión. En estas bandejas se desarrollan las larvas, a las cuales se
les proporciona alimento para peces tilapia (Apitilapia nivel 1), previamente molido,
cada dos días. Al terminar el desarrollo larval y al formarse las pupas, se trasladan
a jaulas de emergencia de adultos, para así continuar cotidianamente con todas
las actividades de cría de Cx. quinquefasciatus con la finalidad de disponer
constantemente de larvas de cuarto estadio larval para efectuar los bioensayos,
(85).

5.2.1.2. Preparación de extractos y adición de larvas:

La población de larvas de cuarto estadio temprano se concentran en una bandeja

con agua limpia y de ahí se seleccionan grupos de 20 larvas para colocarlas en un
vaso de plástico de 150 mL de capacidad, al que previamente se le añaden 100
mL de agua. Posteriormente se aplica 1 mL de los extractos acuosos, aceites o

56
esencias. Al testigo no se le aplicó ningún tratamiento. Para cada dosis evaluada
se utilizaron tres repeticiones, (85).

5.2.1.3. Análisis estadístico:

A las 24 horas después de la aplicación de los tratamientos se observa la

mortalidad de las larvas, considerando muertas aquellas que no presente
movimientos normales, (85).

57
5.2.2 PROCEDIMIENTO #2 PARA LA EVALUACIÓN DE TOXICIDAD CON
LARVAS DEL IV ESTADIO DE ANOPHELES, (81).

5.2.2.1. Crianza de larvas:

La crianza de larvas se realiza en fuentes de porcelana de 40 x 28 x 5 cm con

agua potable declorinada reciclada interdiariamente. La alimentación a base de
conejilla esterilizada a 80 ºC se agrega una vez por día proporcional al número de
larvas criadas (81).

5.2.2.2. Preparación de extractos y adición de larvas:

Se utilizan 825 larvas y se someten a tres repeticiones con 25 especímenes por

repetición. A los grupos experimentales se les agrega 0,01; 0,05; 0,1; 0,8 y 1,2 mL
de los extractos, respectivamente, aforados hasta 100 mL en agua destilada
contenida en vasos de tecknopor de 250 mL de capacidad. Todos los grupos se
mantienen con un rango de temperatura entre 23 y 26 ºC y humedad entre 75 y 80
%, (81).

5.2.2.3. Evaluación de la mortalidad y análisis estadístico:

Las lecturas de mortalidad se realizan a la 1, 6, 12, 24, 36 y 48 horas. Las larvas

se consideran muertas cuando no reaccionan al momento de ser tocadas con un
puntero romo en la región cervical. Los cálculos de la mortalidad corregida se
realizan mediante la fórmula de Abbott en caso de muerte natural en el grupo
testigo cuando éste es menor al 10%. Las concentraciones letales al 50% (CL50) y
90% (CL90) y los tiempos letales al 50% (TL50) y 90 % (TL90), así como los valores
de las pendientes con sus limites de confianza, coeficientes de determinación y
valores "i" cuadrado (c2) se determinan utilizando el programa Probit, (81).

58
5.2.3 PROCEDIMIENTO #3 PARA LA EVALUACIÓN DE TOXICIDAD CON
MOSQUITO CULEX. QUINQUEFASCIATUS , (82).

5.2.3.1. Crianza de las larvas:

Tomar las larvas y colocarlas en una jaula de madera (Ver figura 17) de 60cm x
60cm x60cm que esta cubierta con nylon en unas bandejas con agua y un
algodón empapado en agua con azúcar (Ver figura 18). A los dos o tres días las
hembras ovipositan sobre el agua formando unas balsitas, se llaman balsitas
porque flotan, (82).
FIGURA 17. MOSQUITERO

FIGURA 18. ALGODÓN CON AZUCAR

59
Colocar las balsitas en vasos de icopor de 1 litro y llenar bien con agua de la
llave, encima se debe colocar una galleta de perro molida para las larvas, las
larvas comienzan a eclosionar alrededor de 2 o 3 días, presentan respiración
aeróbica; estas salen a la superficie a tomar aire y luego bajan, permaneciendo
en continuo movimiento, de arriba a bajo, (82).
Se dejan allí, mas o menos el ciclo hasta el 4 periodo, el ciclo es de 21 días, luego
se registra la fecha de inicio y su crecimiento, (82).

5.2.3.2. Preparación de extractos y adición de larvas:

Utilizar una placa de 96 posos, esta placa de 96 posos emplea 8 larvas como
replica y las concentraciones que usa varían mas o menos desde 5000, 500, 50,
5.0 y 0.5 ppm, según la disponibilidad de muestra y se usa un control. Por cada
placa de 96 pozos se debe poner dos muestras; el pozo tiene un volumen de 250
µL de los cuales se colocan 240µL de agua y 10 µL de la muestra; los 10 µL de
muestra debe dar por dilución las diferentes concentraciones que se quiere aplicar
de la solución madre de 10000 ppm que se deja al 1% (la solución madre tiene
solventes orgánicos involucrados, estos se dejan evaporar ya que cualquier traza
de cloroformo o de hexano mata la larva); luego se toman las larvas con una
pipeta pasteur larga y se adiciona una larva en cada poso, (82).

5.2.3.3. Análisis de mortalidad:

Hacer una lectura a las 48h y medir la mortalidad, utilizar el programa Probit (ver
anexo 3 y 4) para evaluar la concentración efectiva para matar el 50% de la
población, (82).

Si se obtienen muestras promisorias se debe hacer el protocolo de la

Organización Mundial de la Salud (OMS), (82).

60
Protocolo de la OMS:

Este protocolo exige colocar 249 ml de agua con 1 mL de muestra en un

erlenmeyer de 500mL al cual se le adiciona 20 o 30 larvas (por cada erlenmeyer
se hace una triplicación respectivamente, mínimo 3), esto tiene la desventaja
principal de que consume mucha muestra, al gastar para cada erlenmeyer 1 mL
de la solución que debe ser bastante concentrada, ya que esto es necesario
porque al diluir ese mililitro 250 veces debe quedar una relación lógica del orden
de 100ppm, y poderse dar un rango determinado alrededor de este, para que así
este pueda ser útil. También se hacen lecturas de mortalidad a las 24 y 48 horas.
(82).

61
5.3. PROTOCOLOS RECOMENDADOS PARA EVALUAR POSIBLE ACTIVIDAD
BIOLÓGICA BIOPESTICIDA.

5.3.1. Diagrama De Flujo #1: Bioensayo Preliminar Con Artemia salina, (82).

• Crianza De Larvas:

Un recipiente plástico y dividirlo en

dos secciones con un tabique del
ADECUAR mismo material.

Agua de mar artificial pesando 38

gramos de sal marina por litro de agua
PREPARAR destilada, filtrar 2 veces o con
membrana. Adicionarla al recipiente de
plástico.

Aproximadamente 200mL de huevos de

Artemia salina a temperatura ambiente
AGREGAR a un lado de las divisiones del tanque o
recipiente, y tapar ese lado.

El transcurso de 2 días para la

PERMITIR maduración de los brine shrimps

62
• Preparación de Extractos:

20mg del extracto a evaluar el cual se

PESAR disuelve en un vial de boca ancha.

2mL de solvente el cual puede ser: etanol,

metanol, hexano o clroroformo, depende del
extracto a usar.
AGREGAR

Concentración 1: 0.5ml de la solución patrón en

cada uno de los tres primeros viales.

PREPARAR Concentración 2: 50 µL de la solución patrón en

cada uno de los tres segundos viales.

Concentración 3: 5 µl de la solución patrón en

cada uno de los últimos tres viales.

Estos viales rotulados a temperatura

DEJAR ambiente en una cesta, se debe dejar
evaporar el solvente.

Un control por dilución de extracto de la

PARALELAMENTE siguiente forma: tomar 10 larvas en un vial
PREPARAR y completar el volumen con 5 mL de
solución salina.

63
• Adición de Larvas:

En todos los viales 20 µL de

COLOCAR
dimetilsulfoxido (también en los
controles).

2ml de agua de mar

ADICIONAR aproximadamente a cada vial.

10 larvas o nauplis que se

separan y se decantan de las
cáscaras con ayuda de una
CONTAR
pipeta pasteur y un vasito de
precipitado

Las larvas en cada vial (minimo 10

ADICIONAR larvas) y llevar a un volumen de 5ml
(completar con agua de mar). Esto
frascos de a tres y sus controles se dejan
a temperatura ambiente por 24 horas.

A las 24 horas el nivel de mortalidad y

utilizar cajas de petri pequeñas, allí se
vierten los contenidos de los viales y
EVALUAR se espera que estos se estabilicen, se
lavan los viales con agua de mar para
asegurarse de que todas las larvas
salgan del vial a la caja de petri.

64
• Análisis De Mortalidad:

Una observación frente a una luz para

HACER evaluar la movilidad de las larvas.
Contar las larvas vivas y muertas

Los datos en el programa Probit para

ANALIZAR de terminar los valores del LC50.

65
5.3.2. Diagrama De Flujo #2: Bioensayo Específico Con El Mosquito Culex.
quinquefasciatus, (82).

Se recomienda evaluar actividad con el mosquito Culex quinquefasciatus pues los

bioensayos con Anopheles se realizan en FIDIC (Fundación-Instituto de
Inmunología de Colombia) y lo bioensayos con Aedes aegypti los realizan en la
Universidad del Quindío.

• Crianza de Larvas:

Moscos adultos y las hembras

COLECTAR con sus huevos.

Las larvas, ponerlas en frascos plásticos y

colocarlas en una jaula de madera que
esta cubierta con nylon; esta también
tiene una manga para el manejo de los
TOMAR insectos. La jaula es de 60cm x 60cm
x60cm, en esta se colocan bandejas con
agua.

Un algodón empapado de agua con

azúcar en la jaula. A los dos o tres días
COLOCAR las hembras ovipositan sobre el agua
formando unas balsitas.

66
 GUARDAR Las balsitas en la nevera.

Las balsitas en vasos de icopor

de 1 litro y llenar bien con agua
PONER de la llave.

Una galleta de perro molida para

las larvas; las larvas comienzan a
ADICIONAR eclosionar alrededor de 2 o 3 días.

Las larvas allí, mas o menos el ciclo

hasta el 4 periodo, el ciclo es de 21
DEJAR días, luego se registra la fecha de
inicio y su crecimiento.

• Preparación De Extractos Y Adición De Larvas:

La placa de 96 pozos con un volumen de

UTILIZAR
250 µL, esta placa utiliza 8 larvas como
replica y las concentraciones que usa
varían mas o menos desde 5000, 500,
50, 5.0 y 0.5 ppm, según la
disponibilidad de muestra.

67
 240µL de agua y 10 µL de la muestra, los
10 µL de muestra deben ser las
ADICIONAR diferentes concentraciones que se quiere
aplicar de la solución madre de 10000
ppm que se deja al 1%.

Una larva en cada pozo; se dejan

inmóvil en ese instante.
AGREGAR

• Análisis De Mortalidad:

Una lectura a las 48h y evaluar la

HACER
movilidad de las larvas. Contar
las larvas vivas y muertas.

El Probit para evaluar la

UTILIZAR concentración efectiva para
matar el 50% de la población.

68
 6.0 DISCUSIÓN GENERAL

Debido al aumento de la resistencia de los mosquitos vectores de enfermedades a

los insecticidas químicos, se viene incrementando la búsqueda de métodos
alternativos como insecticidas naturales, por su bajo costo, capacidad de
biodegradación, como elemento racionalizador en el uso de insecticidas químicos
y por su menor impacto ambiental. Estos insecticidas naturales, provienen de
plantas como: Equinácea (Equinácea angustifolia), Hisopo (Hisopus officinalis),
Lavanda (Lavandula officinalis), Poleo (Mentha pulegium), Albahaca (Ocimun
basilicum), Artemisa (Ambrosia manensis), Salvia (Salvia officinalis), Neem
(Azadirachta indica) y especies de la familia anonácea, (48, 49, 81).

Particularmente en la familia de las Annonaceae se han reportado compuestos de

gran bioactividad, presentes principalmente en las semillas de la planta, esta
actividad es debida a compuestos conocidos como acetogeninas. Las especies
mas enriquecidas con estos compuestos son: Annona cherimola, Annona
muricata, Annona diversifolia, Annona purpurea, Annona squamosa, Annona
triloba y Annona reticulata, por contener acetogeninas con una potente actividad
anticancerígena, antiparasitaria y pesticida, (2).

Colombia y Brasil son centro de origen de Annonaceae; Colombia posee

diferentes especies de las cuales se cultivan para su producción, la Annona
muricata, la Annona cherimola y la Annona squamosa, y además se han reportado
en forma silvestre la Rolina mucosa Bail, Annona colorada y la Atemoya (hibrido
no comercial), (9).

La especie de Annonaceae mas abundante en Colombia es la Annona muricata;

que ha comenzado a perfilarse en los últimos años como una alternativa para el
desarrollo sostenible en algunas regiones del país (Tolima, Huila, Valle del Cauca,
Costa Atlántica, y Risaralda). El dato mas reciente encontrado de producción de

69
guanábana en Colombia fue de 9600 toneladas, en un área de 1.441 Ha, las
cuales están distribuidas entre 10 departamentos (Antioquia, Bolivar, Cordoba,
Cundinamarca, Huila, Norte de Santander, Risaralda, Santander, Tolima y Valle),
siendo los mas grandes productores, Tolima (Falán, Guamo y San Luis) Y Valle
(Toro) con el 76% de la producción total nacional, (Ver anexo 5), (86).
El principal uso de la guanábana (Anona muricata) en Colombia industrialmente es
para la elaboración de jugos néctares, conservas, jarabes, helados, compotas,
dulces, sorbetes, concentrados, entre otros; sin embargo, se desechan su
cáscara, semillas y hojas. Teniendo en cuenta los compuestos bioactivos que
están presentes y que de las especies de annonaceae estudiadas por varios
autores, las mas enriquecidas en acetogeninas de actividad biopesticida
(Asimicina, Squamocina y Anonacina), se encuentran en las especies muricata,
triloba y squamosa, valdría la pena aprovechar estos deshechos principalmente de
las semillas para la obtención de sus compuestos activos, iniciando como línea de
investigación en la Escuela de Tecnología Química de la Universidad Tecnológica
de Pereira, con la obtención y evaluación de extractos de semillas por contener la
mayor concentración de compuestos activos y por ser el desecho mas importante,
(22, 42).

Por esta razón se elaboró la presente documentación y a partir del análisis de esta
información, se propone como siguiente paso en una línea de investigación
encaminada al estudio y aprovechamiento de compuestos activos de Annonaceae,
iniciar con la obtención de extractos de semillas como principal desecho; en este
proyecto se propone iniciar con la evaluación de la actividad biopesticida de
extractos crudos por la facilidad de implementación de los ensayos, puesto que la
actividad anticancerígena y antiparasitaria implica un alto costo y requiere de
licencias; sin embargo, estas pueden evaluarse simultáneamente en institutos
médicos especializados y otras universidades.

Igualmente se propone un protocolo (ver anexo 6) para obtener un biopesticida

natural. Iniciando con la toma de muestras de semillas de la guanábana en las

70
industrias despulpadoras de la región, seguido por su transporte a la Universidad
Tecnológica de Pereira al Laboratorio de Oleoquimica, para la obtención de
extractos con actividad biológica siguiendo los protocolos previamente realizados
en investigaciones hechas por integrantes del grupo de Oleoquimica (referencia
bibliográfica, 87) a los cuales se les realizaría la caracterización química e
identificación preliminar de los compuestos reportados por varios autores con
actividad biopesticida (Asimicina, Squamocina y Anonacina), utilizando
Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC), comparando tiempos de
retención relativos, contra perfiles reportados en la literatura de estudios previos y
la identificación de compuestos nuevos utilizando técnicas cromatografías y
técnicas espectroscópicas (RMN, ¹H, 13 C, IR, EM), (22, 23, 24).
La caracterización biológica se realizaría a partir de bioensayos con diferentes
organismos modelos, implementando en la UTP la Artemia salina como bioensayo
preliminar por ser un organismo versátil de fácil adquisición y los mosquitos como
bioensayo especifico (Culex quinquefasciatus, Anopheles, y Aedes aegypti) por
disponibilidad, economía y por ser un organismo transmisor de agentes vectores
de enfermedades; se recomienda evaluar actividad con el mosquito Culex
quinquefasciatus pues los bioensayos con Anopheles se podrían realizar en FIDIC
(Fundación-Instituto de Inmunología de Colombia) y lo bioensayos con Aedes
aegypti en la Universidad del Quindío. Igualmente seria importante realizar un
estudio minucioso de los costos de la investigación y la elaboración de estas
pruebas de actividad biológica.

71
 7.0 CONCLUSIONES

1. Las principales Annonas cultivadas en Colombia para su producción son:

Annona muricata, Annona cherimola y Annona blanca.
Así mismo en Colombia se genera una cantidad importante de semillas de
Annona muricata las cuales podrían se aprovechadas por ser las mayores
proveedoras de compuestos bioactivos para la elaboración de nuevos
productos naturales que contribuirían al aprovechamiento integral del fruto y al
cuidado del medio ambiente.

2. De acuerdo con los estudios de las acetogeninas de Annonaceae las de

mayor actividad biopesticida corresponden a la asimicina, esquamocina y
anonacina, que se encuentran presentes en la Annona muricata, lo que indica
que sería posible el aprovechamiento de las semillas para la obtención de un
biopesticida.

3. Las pruebas de Actividad Biológica con Organismos Modelos son base

fundamental para probar la potencia e inocuidad de muchas de las sustancias
biológicas; y particularmente para acetogeninas de Anonáceas se podría
implementar pruebas de actividad biológica con Artemia salina y los Mosquitos
(Diptera: Culicidae) por su bajo costo y fácil adquisición.

4. El método más viable para realizar las pruebas de actividad biológica con
Acetogeninas de la familia Annonaceae con actividad biopesticida, es el
bioensayo preliminar con Artemia salina a pesar de ser un organismo sensible a
cambios de pH, temperatura, entre otros; y el bioensayo específico con el
mosquito Culex quinquefasciatus para evaluar posible actividad bioinsecticida.

72
5. Es importante crear una investigación encaminada a la evaluación de la
actividad biológica de las acetogeninas de Annonaceae como biopesticidas;
comenzando con el aprovechamiento de las semillas de desecho de las
industrias de pulpas existentes en Colombia.

73
 BIBLIOGRAFIA

1. Romain, A. D.; Poupon, E.; Romero, V.; Peris, E.; Lewin, G.; Cortes, D.;
Brandt, U.; Hocquemiller, R. Analogues of cytotoxic squamocin using reliable
reactions: new insights into the reactivity and role of the α,β-unsaturates
lactone of the annonaceous acetogeninas, Tetrahedron, 62, 6248-6257. 2006.

2. McLaughlin, L.; Zeng, N. H.; Oberlies, G-X.; Zhao, Z-M. Recent Advances in
Phytochemistry. Mata, R and Romeo, J.T. Plenum Press, 249-310. 1995.

3. Boletín Universidad de La República (Dirección General jurídica).

Ordenanza sobre Uso de Animales en Experimentación, Docencia e
Investigación Universitaria, 15, 1-11.2005.

4. Montoya, J, Colmenares, A. J . Acetogeninas de Annonaceae como

pesticidas naturales sobre larvas del cogollero del maíz spodoptera frugiperda
(lep: noctuidae). Boletín del Museo de Entomología de la Universidad del Valle,
32-40. 2005.

5. Marmara, L.M. Veinte plantas medicinales, instituto de Ciencia Y Tecnologia

Agricola, Publicaciones Recursos Naturales, 28-35. 2004.

6. Orellana, A.D.; Martínez, E. Distribución Geográfica De Anonáceas en

Guatemala. Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícola, Publicaciones Recursos
Naturales, 3-7. 2005.

7. Rios, D.; Corrales, D. Caracterización de la Guanábana Elita, Chirimolla

otras Anonáceas promisorias para Colombia, Rev Biotec, 3, 180-2000, 2003.

74
8. Morton, J. Frutas de Climas Calientes. Revista Agrícola del Perú, 25-27.
2000.

9. Cabra, J.; Sanchez, R.N.; Mejia, A. La guanábana una nutritiva fruta del
tropico americano con un mercado rentable y promisorio. Revista optimización
de la cadena productiva, 3,132-136. 2002.

10. Zeng, L.; Ye, Q.; Oberlies, N. H.; Shi, G.; Gu, Z-M.; He, K.; McLaughlin, L.
Recent Advances in Annonaceous Acetogenins, Departament of Medicinal
Chemestry and Pharmacognosy, 2-6. 2004.

11. Makabe, H.; Hattori, Y.; Kimura, Y.; Konno, H.; Abe, M.; Miyoshi, H.;
Tanaka A.; Oritani, T. Total synthesis of cis-solamin and its inhibitory action
with bovine heart mitochondrial complex I. Tetrahedron, 60,10651-10657.
2004.

12. Martin, S. J.; Green, D.R. Apoptosis as a Goal of Cancer Therapy, Curr
Opin Oncol, 6, 616-621. 1994.

13. Baldwins, S.; Matto, L.; Allisho, A.; Khand, W.; Mclean, S. Mono-
tetrahidrofuran Annonaceaus from Annona montana, J. Nat Prod, 63, 1235-
1238. 2000.

14. Tormo, J. R.; Gonzalez, M.C.; Cortes, D.; Estornell, E. Kinetic

Characterization of Michondrial Complex I Inhibitors Using Annonaceous
Acetogenins, Arch Biochem Biophys, 369, 119-126. 1999.

15. Feras, Q.; Liu, X-X.; McLaughlin, L. Annonaceous Acetogenins. Recent

Progress. J. Nat. Pod, 62, 505. 1999.

75
16. Fang, X-P.; Rieser, M. J.; Gu, Z-M.; Zhau, G-X.; McLaughlin, L.
Annonaceas Acetogenins, An Updated Review, Phytochenical Analysisvol 28,
4, 35- 44. 1993.

17. Gordon, J.; Johnson, H.A.; McLaughlin, L. Variations in biological activity of

Asimina triloba, J Nat Prod, 85, 609-612. 1996.

18. Ratnayeque, S.; Kent, J.; Potter, M.; Mclaughlin, L. Evaluation of the
Pawpaw Tree, Asimina Triloba, as a commercial source of the Pesticides
Annonaceous Acetogenins, J. Nat Prod, 85, 108-105. 1997.

19. He, k.; Zeng, L.; Ye, Q.; Shi, G.; Obelis, N.H.; Zho, G.; Mclaughlin, L.
Comparative Evaluations of Acetogenins for Pesticidal Activity, J Nat Prod, 14,
81-84. 1997.

20. Ye, Q.; Zhao, G.; Mclaghlin, L. Loncigin and Goniothalamicinone,

bioactivite Mono-tetrahidrofuran Acetogenins from Asimicina longifola, J Nat
Prod, 58. 1996.

21. Rieser, M.; Gu, Z. M.; Colmillo, X. P.; Zeng, L.; McLaughlin, L. Cinco
Acetogeninas del Anillo mono-tetrahidrofurano de las semillas de Annona
muricata L, J. Nat Prod, 59, 100-108. 1996.

22. Zeng, L.; McLaughlin, L.; Jonhson, H. A. Muricoreacin and Murihexocin,

MTF Acetogenin from the Leaves of Annona muricata, J. Nat Prod Rep, 14,
275-306. 1998.

23. Borice, C.; Louiseau, P.; Gayval, A.; Laurens, A.; Philippe, D. Antiparasitic
Activity of Annona muricata and Annona cherimola Seeds, J Plant Med, 29, 40-
45. 1997.

76
24. Hiroschi, S.; Misuki, S.; Yoshhida, A.; Nuriyukhara, F.; Squamocin, O.;
Squamocin, O. Two new adjacent bis- tetrahidrofuran Acetogenins from the
seeds of Annona squamosa, J. Nat Pharm, 249-310. 2002.

25. Fujimoto, J.; Mirisaky, C.; Chimodo, H.; Nishioaha, S. Annonaceous

Acetogenins from the Seed of Annona squamosa, no-adjacent bis-
tetrahidrofuran Acetogenins, J Nat Pharm, 54, 27-48. 1996.

26. Santos, M.; John, M.; Cassady, L.; Araticulin, A. bis-tetrahidrofuran

poliketyde from Annona classiflora seed, J Phytochemestry, 42. 1996.

27. Sevser, S.; Boris, P.; Loiseau, G.; Cortes, R.; Hocquemiller, D. Citotoxic
and Antiparasitic activity from Annona senegalencis seeds, J Plant Med, 60,
1911-1916. 1994.

28. Shi, G.; Dougal, M.; Mclaughlin, J. Bioactive Annonaceous Acetogenins

from Rllina mucosa, J Nat Pharm, 249-310. 1997.

29. Duret, P.; Waecher, R.; Cave, A. Atemoyin-1 and 2-two Mono-tetrahifuran
lactone Acetogenins from the seeds of Annona atemoya, J Plant Med, 19, 22-
28. 1997.

30. Arenas, I. B.; Vasquez, M.; Spadavecchina, U.; Camero S.; Gonzales, G.
Estudio Comparativo de la Bioactividad de Diferentes Materiales Cerámicos
Sumergidos en Fluido Simulado del Cuerpo, Revista Latinoamericana de
Metalurgia y Materiales, 25, 23-30. 2005.

31. Naranjo, J. P.; Cubiles, M. A.; Salvado, A. C.; Campos, C. G. Actividad

Antiparasitaria De Una Decocción De Mentha piperita Linn, Revista Cubana de
Medicina Militar, 3, 35, 37-38. 2006.

77
32. Freile, J.; Peruzotti, A.; Sturniolo, L.; Rodero, D.; Cortes, V.; Balzaretti, R.;
Enriz, L. Un Alcaloide Aislado De Berberis Serrato-Dentata. Extracción,
Elucidación Estructural Y Actividad Antifúngica. Articulo de laUniversidad
Nacional de San Luis, Departamento de Farmacognosia y Farmacología, 12-
15. 2000.

33. Nakata, H. M.; Martinez, E. Efecto Del Té Verde En La Formación De La

Placa Bacteriana Por Streptococcus mutans, Revista cientifica Odontología
Sanmarquina, 32, 23-24. 2006.

34. Loo, Y. C.; Ferrera, M. A.;Rita, M.; Pérez, Gil.; Robledo, M. R.; García R. R.
Actividad Antitumoral De Extractos De Plantas De La Flora Cubana Frente A
La Leucemia linfocítica P-388, Rev Cubana Plant Med, 2, 45-47. 2005.

35. Acevedo, A. M.; Castañeda, M. I.; Blanco, K. M.; Cardenas, C. Y.; Reyes,
J. A.; Kouznetsov, V. Composición Y Capacidad Antioxidante De Especies
Aromáticas Y Medicinales Con Alto Contenido De Timol Y CARVACROL,
Scientia et Technica Año XIII, 33. 2007.

36. Vernin, G.; Lageot, C.; Gaydou, E. Analysis Of The Essential Oil Of Lippia
Graveolens,El Salvador, Flav. Fragr. 16,219-226. 2001.

37. Zheng, W. W. Antioxidant Activity And Phenolic Compounds In Selected

Herbs, J. Agric. Food Chem , 49, 5165-5170. 2001.

38. Anderson, R. S.; Mora, L. M.; Brudacher, L. L. Sensivity Of Oyster

Hemocyte Chemiluminescence to Antibiotic-Antimycotic Agentes, J. Invert.
Pathol, 60(3), 317-318. 1992

39. Auria, M. V.; Paloma, L.; Minale, A.; Zampella, C.; Perez, J.
Neosiphoniamolide A, A Novel Cyclodepsipeptide, with Antifungal Activity From

78
The Marine Sponge Neosiphonia Superstes, J. Natur. Prod. Lloydia, 58, 121-
123. 1995.

40. Lee, Y. M.; Jeong, H. J.; Na, H. J.; Ku, J. Y.; Kim, D. K.; Moon, G.; Chae, H.
J.; Kim, H. R.; Baek, S.-H. and Kim H.-M. Inhibition Of Immunologic And
Nonimmunologic Stimulation-Mediated Anaphylactic Shocks By Water Extract
Of White Eggplant (Solanum melongena), Pharmacol. Res, 43 (4), 405 -409.
2001.

41. Monks, A.; Scudeiro, D.; Skehan, P.; Shoemaker, R.; Paull, K.; Vistica, D.;
Hose, C.; Langley, J.; Cronise, P.; Vaigro-Wolff A.; Gray-Goodrich M.;
Campbell, H.; Mayo, J.; Boyd, M. Feasibility Of A High-Flux Anticancer Drug
Screen Using A Diverse Panel Of Cultured Human Tumor Cell Lines, J. Natl.
Cancer Inst, 83, 757-766. 1995.

42. Johnson, H. A.; Obelis, N. H.; Feras, Q.; McLaughlin, J. L. Resistance

Annona, Annonaceous Acetogenins as new pesticidal and antitumor agents.
Bioorg Active Nat Prod, 5, 1911-1916. 2000.

43. Zeng, L.; Ye, Q.; Obelis, N. H.; Shi, G.; Guz, M.; McLaughlin L. Recent
Avanced in Annonaceous Acetogenins, J Nat Rep, 13, 276-307. 1996.

44. Zeng, L.; McLaughlin, L.; Alfonso, D.; Jonhson, H. A. Progress in

Annonaceous Acetogenins as new Natural Pesticides, Recent. J Nat Product.
16, 28-283. 1997.

45. Fernández, C.; Juncosa, R. Biopesticidas: ¿La Agricultura Del Futuro?

Phytoma, 141, 14-19. 2002.

79
46. Rodríguez , C. Potencial practico de ajo , anona, nim, chile y tabaco,
Editado por la red de Acción de Sobre Plaguicidas y Alternativas en México,
133, Texcoco Estado de Mexico. 2000.

47. Rodríguez, C. El Uso de Insecticidas Vegetales En El Manejo de Plagas en

la Floricultura, 5º Seminario Internacional de Flor de Corte, Ixtapan de la Sal,
Estado de México. 2001.

48. Pérez, A. Utilización de plantas en el control de plagas y enfermedades en

los cultivos, Chiquimula, Guatemala: Centro de Educación Popular El Tule.
1995.

49. Andrews, K. L.; Quezada, J. R. Manejo integrado de plagas insectiles en la

agricultura: Estado actual y futuro, Escuela Agrícola Panamericana.1990.

50. Ochoa, A. M. Cuando La Ciencia y La Sabiduría Popular Van De La Mano,

Plantas Medicinales, Plantas Medicinales,16, 45-48. 1998.

51. Hughes, H.; Pines, M. Los Genes que Compartimos una Breve Guía de
Organismos Modelos, Medical Institute HHMI, 13-18. 2007.

52. BOE.. Sobre protección de los animales destinados a experimentación y

otros fines científicos. Real Decreto 223. 1988.

53. Nevaline, T. Recommendatións for the education and training of persons of

Category A and C, Laboratory Animals, FELASA, 29, 121-131.1996.

54. Zúñiga, J. M. Técnico especialista en protección y experimentación animal.

SECAL, 269. 1997.

80
55. Cabrera, L. O.; Bernal S. I.; Carmen, M. Los Mosquitos (Diptera: Culicidae)
De Tlaxcala, México.I. Lista Comentada De Especies, Folia Entomol. Mex,
45(3), 223-224. 2006.

56. Bernal, S. I. Los díptera hematófagos y taxa relacionados de dos áreas

protegidas del estado de Yucatán, México (Insecta), Secretaría de Salud,
Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Laboratorio de
Entomología e Insectario, 2-5. 1999.

57. Ansari, M. A.; Razdan, R. K.; Tandon, M.; Vasudevan, P. Larvicidal and
Repellent Actions of Dalbergia sissoo (F. Leguminosae) oil against
Mosquitoes, Bioresource Tech, 73, 207-211. 2000.

58. Salazar, M. J.; Moncada, M. I. Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus

Say, 1826 (Diptera: Culicidae) bajo condiciones no controladas en Bogotá,
Biomédica, 24, 386-387. 2004.

59. Pacheco, C. J. Búsqueda de Sustancias Toxicas en Plantas Medicinales,

contra Larvas de Mosquito casero Culex quinquefascitus, Tesis de
Licenciatura para Citología Agrícola, UACH, 63, 26-28. 1983.

60. Spinosa, P. J. Búsqueda de Plantas del Área del Lago de Texcoco con
Actividad Toxica contra Mosquito casero Culex quinquefascitus, Tesis de
Licenciatura, para Citología Agrícola, UACH, 68, Chapingo México. 1985.

61. García, L. M. Aedes aegypti: Incidencia y Comportamiento En El Municipio

De Jiguaní Durante Los Años 1997 – 2002. Centro Municipal de Higiene y
Epidemiología de Jiguaní, Departamento de Control de Vectores, 14, 1-2.
2003.

81
62. Rivera, R. I. Toxicidad de Extractos Acuosos Vegetales en Larvas de
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae), Tesis de Licenciatura, Parasitología
Agrícola, UACH, 59, 26, 30. 1992.

63. Obando, R. G. Efecto Del Criadero Sobre La Duración Del Ciclo De Vida Y
Productividad De Anopheles Albimanus Wiedemann (Diptera: Culicidae),
Boletín del Museo de Entomología de la Universidad del Valle, 6, 1-6. 2005.

64 . Bowers, W. S.; Sener, B.; Evans, B. H.; Bingol, F.; Erdogan, I. Activity of
Turkish Medicinal Plants against Mosquitoes Aedes aegypti nand Anopheles
gambie, Insect Sci Appl, 16(3), 339-342. 1995.

65. Pushpalatha, E. J. Larvicidal activity of a Few Plants Extracts Against

Aedes aegypti and Anopheles stephensi, Indian J. Malariology, 32, 14-23.
1995.

66. Crespo, J. E.; Baessolo, L. A. Biogeografía y Taxonomia del Genero

Artemia (crustacea, anostraca) en Chila: una Revision, Historia Natural
(segunda serie), 4, 17. 2002.

67. Arellano, E. M. Manual Para La Producción Y Usos De Organismos

Zooplanctonicos, Centro Nacional De Acuicultura E Investigaciones Marinas,
3-12. 2006.

68. Gajardo, G. Genetical and phenotypical characterization of Artemia strain

from South América: relevance for Aquaculture, Memorias II Congreso
Ecuatoriano de Acuicultura, 91-95. 1993.

69. Amat, F. Diferenciación y Distribución de las Poblaciones de Artemia

(crustáceo braquiópodo), Investigación Pesquera, 44, 485-503. 1980.

82
70. Crespo, J. E. Sobre la Reproducción de Tres Poblaciones Sudamericanas
de Artemia franciscana KELLOGG, Boletín de la Sociedad de Biología de
Concepción, 70, 37-43. 1999.

71. Gilchrist, B. M. Growth and Form of the Brine shrimp Artemia salina ,
Proceedings Zoological Society of London, 2, 221-235. 1960.

72. Sagastume, P. M. Microbioensayos ecotoxicológicos para monitoreo

ambiental y otras aplicaciones, II Congreso Nacional de Ingeniería
Sanitaria y Ambiental, Ciudad de Guatemala, 10-11. 2001.

73. Le, R. S.; Y, Huerou, B.; Renoux, P. R.; Gree, R. New Cytotoxic
analogues of Annonaceous Acetogenins, Anti-cancer Drug design, J Med
Chem, 16, 356-360. 2001.

74. Nicholas, H.; Obelis, N. H.; Jlu, J.; Cobertt, L.; Mclaughlin, L. Tumor cell
growth inhibition by several Annonaceous acetogenins in an in vitro disk
diffusion assay, Cancer Letter, 16, 73-76. 1995.

75. Roth, I. T.; Lindford, H. Monografía y Anatomía Foliar de Plantas de la

Selva Nublada de Rancho Grande,Acta Científica Venezolana, 205-241. 1986

76. Sanchez M. D.; Aguirreolea J. Fisiologia y Bioquímica Vegetal, 55, 49-90.

1996.

77. Scaloppi, A. E.; Geraldo, A. U. Clonagem de Cuatro Especies de

Annonaceae Potenciais como porta-enxertos, Revista Brasilera de Froticultura,
25, 285-289. 2003.

78. Trewavas, A. Aspects of Plant Intelligence, Annals of Botany, 92, 1-20.

2003.

83
79. Saez, J.; Cardona, W.; y Saphaz, S. Efecto Citotoxico y Antiparasitario en
Annonalactonas de Rollinia membranacea (Annonaceae), Articulo de la
Universidad de Antioquia, 1, 1-9. 1998.

80. Bobadilla, M.; Zavala, F.; Sisniegas, M.; Zavaleta, G.; Mostacero, J.;
Taramona, L. Evaluacion Larvicida de Suspensiones acuosas de Annona
muricata Linnaeus sobre Aedes aegypti Linnaeus (Diptera, Culicidae), Rev.
Peru biol, 12, 1-8. 2005.

81. Bobadilla, M .; Espejo, G. Z.; Franco, F. G.; Velásquez, L. P.; Gonzales, M.

S. Efecto Bioinsecticida del Extract Etanólico de las Semillas De Annona
Cherimolia Miller "Chirimoya" y A. muricata Linneaus "Guanabana" Sobre
Larvas Del IV Estadio De Anophles, 9 (2): 64 -73. 2002.

82. Moreno, B. Entrevista Laboratorios UNAL-Departamento de Quimica,

Grupo de Productos Naturales. (Entrevista Realizada en Septiembre). 2006.

83. Yepes, P. N.; Osorio, J. Análisis del Procedimiento para la Determinación de

la dl50 (dosis letal media) a través del Método de Probit en un Bioensayo.
Revista de investigaciones de la Universidad del Quindío, 12: 1-6. 2003.

84. Muete, C M.; Palomino, E.; Reguero, M. T.; Evaluacion de Cinco

Compuestos Esteroidales En La Linea Celular MCF-7 Y En Larvas De Artemia
Salina. Revista Colombiana De Ciencias quimico-Farmaceuticas, 21:56. 1993.

85. Pacheco, R. P.; Hernández, C. R.; Reyna, J. L.; Belmont, R. M.; Valverde,
G. Toxicidad De Aceites, Esencias Y Extractos Vegetales En Larvas De
Mosquito Culex Quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae), Acta Zoológica
Mexicana, 20: 141-142. 2004.

84
86. Jhonson, D. Frutas y hortalizas de Colombia para el mundo. Secretarias de
Agricultura Departamentales - URPAS´s, UMATA´s, Ministerio de Agricultura y
Desarrollo Rural, Colombia. 2003.

87. Saldarriaga, A. M. Monografía sobre el aprovechamiento de Compuestos

Activos de la Guanábana , Annona muricata, 45,47,61-64. 2006.

88. Valsecia, M. Caracterización de los Efectos de las Drogas.,

Factores que Modifican la Acción de las Drogas, Farmacometria, 2-5. 2007.

85
ANEXOS

86
 ANEXO 1. MATERIAL Y REACTIVOS A UTILIZAR

Bioensayo Para La
Bioensayo Estándar De Evaluación De
Toxicidad Con Artemia Toxicidad Con El Protocolo de la OMS
Salina Mosquito Culex.
quinquefasciatus
Recipiente plástico
dividido en dos Succionadores Pipetas
secciones
Papel carbón Jaula de madera de Erlenmeyers de 500ml.
60cm x 60cm x60cm.
38 gramos de sal marina Nylon Extracto de la Anonácea
Agua destilada Bandejas con agua Beakers
200 mg de huevos de Agua con azúcar Pipeta pasteur larga
Artemia salina
Una lámpara Algodón

Matraz (según las Vasos de icopor de 1

diluciones a realizar). litro.
Viales (según las Una dog-cooke, (galleta
repeticiones a realizar). de perro) molida.

Set de microjeringas. Placa de 96 pozos.

Matraz (según las
Beakers diluciones a realizar).
Extracto de la anonácea. Pipeta pasteur larga
Pipeta pasteur larga Set de microjeringas.

5
Cajas de petri pequeñas Extracto de la anonácea.
Beakers.

ANEXO 2. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS MOSQUITOS

A continuación se muestra una amplia descripción de los mosquitos de la
Familia Culicidae.
TABLA 10. CARACTERISTICAS DE LOS MOSQUITOS, (51, 55, 56).

PHILUM: Artrópodos METAMORFOSIS COMPLETA

CLASE: Insecta Huevo
ORDEN: Díptera larva
FAMILIA: Culicidae pupa
SUBFAMILIA: Culicinae y adulto
Anophelinae
GENEROS: Aedes, Culex y
Anopheles

LOS HUEVOS SE CARACTERIZAN HUEVOS

POR:

Anopheles: presencia de flotadores,

impiden que se sumerjan.

Aedes: estructura poligonal,

aislados.

Página - 2 -
.

Culex: dispuestos en grupo, como

una corona “balsa flotante”.

Continuación tabla 1.
LAS LARVAS LARVAS

(Estadío evolutivo en que el insecto

se alimenta vorazmente con su
aparato bucal masticador) se
caracterizan:

Anopheles: ausencia de sifón

respiratorio, presenta una placa con
aberturas espiraculares, se disponen
paralelo a la superficie,.

Aedes: sifón respiratorio corto,

cuelgan con la cabeza hacia abajo
perpendicular a la superficie del
agua Culex Anopheles Aedes
,.
Culex: sifón respiratorio largo,

Página - 3 -
cuelgan con la cabeza hacia abajo
oblicuo respecto a la superficie del
agua.

LAS PUPAS
(estadío evolutivo en el que el
insecto NO se alimenta) se
diferencian por las características de
las trompetillas.

Aedes: medianas en bisel.

Culex: largas, cilíndricas, estrechas.
Anopheles: cortas.

Respectivamente, como están en

las figuras.
Continuación tabla 10.

Los mosquitos adultos se diferencian por la longitud de los palpos maxilares

respecto a la probóscide.
Anophelinae: igual longitud que probóscide.

Culicinae: machos largos e incurvados y las hembras cortos.

Página - 4 -
 ESQUEMA CORPORAL DE UN MOSQUITO

ANEXO 3. PROGRAMA UTILIZADO (PROBIT)

PROGRAMA PROBIT:

La determinación de la DL50, se utiliza para encontrar umbrales de toxicidad

para determinadas sustancias; en el desarrollo de pesticidas se utiliza para

Página - 5 -
determinar los límites de resistencia de insectos, por ejemplo, ante ciertos
biocida, (83).

En la investigación fotoquímica valiéndose del principio de que farmacología es

simplemente toxicología a bajas concentraciones o toxicología es farmacología
a concentraciones altas se puede correlacionar la bioactividad con el valor de la
DL50 y al mismo tiempo su grado de toxicidad, (83).

La determinación de la DL50 requiere de la estadística cuantal, para lo cual es

necesario transformar los valores de respuesta obtenidos en unidades Anglit,
Logit o Probit y las dosis suministradas en unidades logarítmicas conocidas
como dosis metamétricas, (83).

Existen algunos programas especializados que realizan este tipo de cálculos

automáticamente, pero su confiabilidad depende de la persona o institución que
los haya desarrollado, (83).

ANEXO 4. DETERMINACION DE LA DOSIS LETAL DE UNA SUSTANCIA

• DOSIS LETAL MEDIA (DL50):

Página - 6 -
La toxicidad de una droga puede medirse con el conocimiento de la dosis letal
50 (DL50), que es la dosis capaz de provocar la muerte del 50% de los animales
de laboratorio (88).

• LA DOSIS EFECTIVA 50 (DE50)

Es por otra parte la dosis que produce los efectos deseados o terapéuticos en el
50% de los pacientes u organismos (88).

• DOSIS LETAL MÍNIMA (DLmin):

La menor cantidad de sustancia que introducida en el organismo produce la
muerte a algún animal de experimentación bajo un conjunto de condiciones
definidas (88).
TABLA 11. DOSIS EFECTIVA MEDIA Y DOSIS LETAL MEDIA

Página - 7 -
ANEXO 5. PRODUCCION DE GUANABANA EN COLOMBIA EN EL AÑO
2003.

Municipio Área sembrada Producción Rendimiento

Año 2003 (has) (Ton.) (kg/ha)

Antioquia 170 596 3.505

Bolívar 10 150 15.000

Córdoba 59 840 14.237

Cundinamarca 60 608 10.133

Huila 123 902 7.363

Norte de Santander 6 20 3.333

Risaralda 36 288 8.000

Santander 42 530 12.619

Tolima 557 4.991 8.962

Valle 335 3.380 10.084

Total Guanábana 1.398 12.305

Fuente: Secretarias de Agricultura Departamentales - URPAS´s, UMATA´s,

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, (86).

Página - 8 -
ANEXO 6.

PROTOCOLO GENERAL PARA LA ELABORACIÓN DE UN

BIOINSECTICIDA NATURAL

Hacienda Calamar
Ubicada en la vereda la
Honda
Desechos de guanábana
(annona muricata)
preferiblemente semillas,
TOMA DE MUESTRAS en la región.
Hacienda Halcones
Ubicada en la cadena
el Tigre vía cerritos.

Al laboratorio de
Oleoquimica de la UTP
TRANSPORTE

En metanol, (Referencia bibliográfica (87).

EXTRACCION

identificación de Ascimicina, Squamocina y

Anonacina.
CARACTERIZACON Química

Identificación de compuestos nuevos

Biológica

Artemia salina Protocolo (5.3.1). UTP

Realizar bioensayos

Mosquito Culex Protocolo (5.3.2).

UTP
Página - 9 -

ELABORACION DE
UN Mezclando con Anopheles y Aedes aegypti
BIOINCECTICIDA extractos de plantas Enviar extracto a otras Universidades
NATURAL sinérgicas. y Centros de Investigación
ANEXO 7. CONDICIONES AMBIENTALES PARA EL MANTENIMIENTO DE
ORGANISMOS MODELOS:

Aire y ventilación.

Las condiciones ambientales de temperatura, humedad, ventilación, alumbrado

e interacción con otros animales deberán ser compatibles con las necesidades
de la especie en cuestión, contando con espacios al aire libre en casos en que
sean requeridos, (4).

Los ruidos y olores deberán minimizarse dentro de lo posible.

Habrán de existir las instalaciones apropiadas para cadáveres y desechos.

Los locales deberán contar con las siguientes exigencias de aire y ventilación:

• La inyección de aire debe realizarse en los ángulos superiores de los

locales y la extracción en los inferiores, (4).

• Los locales en su interior deben poseer presión positiva de aire respecto

a los pasillos y/o áreas exteriores, (4).

Página - 10 -
• En caso de poseer un bioterio doble pasillo con locales centrales
(Circulación limpia y sucia), el gradiente de presión será del limpio al sucio, (4).

Temperatura y humedad.

Las exigencias de temperatura y humedad, son:

• Para roedores de 20  2 C.-

• La humedad relativa ambiente oscilará entre 40 y 70%, (4).

Intensidad y tipo de iluminación

Los locales deberán contar con las siguientes exigencias de intensidad y tipo de
iluminación:

La luz deberá ser artificial y provista por tubos fluorescentes con incidencia
oblicua, de forma tal que todas las jaulas, independientemente de su ubicación,
reciban intensidades similares, (4).

Condiciones de alojamiento.-

El alojamiento debe contribuir a la salud general de los animales, y evitarles

todo estrés innecesario, para lo cual deberá asignársele a cada animal, de

Página - 11 -
acuerdo a la especie, un espacio adecuado, preservando mínimas condiciones
de higiene y de protección contra depredadores, roedores y otras plagas, (4).

• Deberán existir instalaciones de cuarentena y aislamientos

pertinentes,(4).

• Normalmente la entrada debe estar restringida a las personas

autorizadas, (4).

• Los animales serán alojados en jaulas adecuadas para cada especie, (4).

• El área requerida para cada especie se ajustará a las disposiciones

vigentes, (4).

• El número de animales por jaula estará en relación al tamaño corporal

evitándose la sobrecarga, de acuerdo a la reglamentación emitida por la CHEA,
(4).

Adquisición de animales

Los animales de experimentación serán adquiridos en establecimientos de cría

especializados, (4).

Podrán emplearse animales no específicamente criados con este fin, sólo si se

observan los requisitos establecidos en materia de investigación, sobre todo en
lo que respecta a salud y calidad de los mismos (4).

Página - 12 -
ANEXO 8. LISTA AMPLIADA DE GÉNEROS DE LA FAMILIA ANNONACEAE
CON SUS RESPECTIVAS ESPECIES, (5, 6, 7).

GENEROS ESPECIE

Alphonsea boniana

Alphonsea elliptica

Alphonsea javanica

Alphonsea kinabaluensis
Alphonsea
Alphonsea sp. Kessler 3112

Alphonsea sp. Kessler 3186

Alphonsea sp. Mols 16

Ambavia
Ambavia gerrardii

Anaxagorea
Anaxagorea acuminata

Anaxagorea allenii

Página - 13 -

Anaxagorea angustifolia

Anaxagorea borneensis

Anaxagorea brachycarpa

Anaxagorea brevipedicellata

Anaxagorea brevipes

Anaxagorea crassipetala

Anaxagorea dolichocarpa

Anaxagorea floribunda

Anaxagorea gigantophylla

Anaxagorea guatemalensis

Anaxagorea inundata

Annickia
Annickia chlorantha

Annickia kummeriae

Annickia pilosa

Annona
Annona cherimola (cherimoya)

Annona cherimola x Annona
squamosa (atemoya)

Annona deceptrix

Annona glabra (alligator-apple)

Annona hybrid cultivar

Annona montana (mountain
soursop)

Annona muricata (prickly custard
apple)

Annona reticulata (bullock's-heart)

Annona senegalensis (wild
custard-apple)

Annona squamosa (sugar-apple)

Annona sp. SM-1999

Anonidium
Anonidium sp. Cheek 7896

Artabotrys
Artabotrys hexapetalus

Artabotrys odoratissimus

Artabotrys sp. Wieringa 4018

Página - 14 -
 Asimina
Asimina angustifolia

Asimina longifolia (polecat bush)

Asimina parviflora (dwarf pawpaw)

Asimina triloba (pawpaw)

Bocageopsis
Bocageopsis multiflora

Bocageopsis pleiosperma

Cananga
Cananga odorata (ilang-ilang)

Cleistopholis
Cleistopholis glauca

Craibella
Craibella phuyensis

Cremastosperma brevipes

Cremastosperma bullatum
Cremastosperma
Cremastosperma cauliflorum

Cremastosperma cenepense

Cremastosperma gracilipes

Cremastosperma leiophyllum

Cremastosperma macrocarpum

Cremastosperma magdalenae

Cremastosperma megalophyllum

Cremastosperma microcarpum

Cremastosperma monospermum

Cremastosperma napoense

Cremastosperma novogranatense

Cremastosperma oblongum

Cremastosperma panamense

Cremastosperma pedunculatum

Cremastosperma pendulum

Cremastosperma peruvianum

Cremastosperma venezuelanum

Cremastosperma westrae

Cremastosperma yamayakatense

Cremastosperma sp. Chatrou 268

Cremastosperma sp. Chatrou et al.
103

Página - 15 -

Cremastosperma sp. Escobar
3309

Cremastosperma sp. Foster 3418

Cremastosperma sp. Gentry
45510

Cremastosperma sp. Graham 635

Cremastosperma sp. Killip 28961

Cremastosperma sp. Maas 9148

Cremastosperma sp. Pirie et al. 57

Cremastosperma sp. Pirie et al. 71

Cremastosperma sp. Smith 1577

Cremastosperma sp. Steyermark
94314

Cremastosperma sp. Tello 3416

Cremastosperma sp. Woytkowski
7128

Cyathocalyx
Cyathocalyx biovulatus

Cyathocalyx martabanicus

Cyathostemma
Cyathostemma hookeri

Cyathostemma micranthum

Cyathostemma viridiflora

Cymbopetalum
Cymbopetalum brasiliense

Cymbopetalum torulosum

Cymbopetalum sp. Chatrou et al.
44

Cymbopetalum sp. Maas et al.
8811

Dasymaschalon
Dasymaschalon blumei

Dasymaschalon macrocalyx

Dasymaschalon sootepense

Desmopsis
Desmopsis microcarpa

Desmopsis schippii

Página - 16 -
Diclinanona
Diclinanona tessmannii

Disepalum
Disepalum platypetalum

Disepalum sp. Takeuchi et Kulang
18201

Duguetia bahiensis

Duguetia cadaverica

Duguetia calycina

Duguetia cauliflora

Duguetia chrysea

Duguetia confinis

Duguetia confusa

Duguetia echinophora

Duguetia guianensis

Duguetia hadrantha
Duguetia
Duguetia lucida

Duguetia macrocalyx

Duguetia macrophylla

Duguetia marcgraviana

Duguetia megalocarpa

Duguetia moricandiana

Duguetia neglecta

Duguetia odorata

Duguetia panamensis

Duguetia peruviana

Duguetia pycnastera

Duguetia quitarensis

Duguetia riedeliana

Duguetia salicifolia

Duguetia sessilis

Duguetia sooretamae

Duguetia staudtii

Duguetia stelechantha

Duguetia surinamensis

Duguetia ulei

Duguetia uniflora

Duguetia yeshidan

Página - 17 -
 Ellipeia
Ellipeia dulcis

Ellipeiopsis
Ellipeiopsis ferruginea

Enicosanthum fuscum

Enicosanthum membranifolium
Enicosanthum
Enicosanthum paradoxum

Enicosanthum sp. Ambriansyah et
al. 2067

Ephedranthus boliviensis

Ephedranthus parviflorus
Ephedranthus
Ephedranthus sp. Chatrou et al.
173

Ephedranthus sp. Maas et al. 8826

Fissistigma
Fissistigma glaucescens

Fissistigma uonicum

Fitzalania
Fitzalania bidwilii

Fitzalania heteropetala

Friesodielsia
Friesodielsia desmoides

Friesodielsia sp. Wieringa et al.
3605

Fusaea
Fusaea longifolia

Fusaea peruviana

Goniothalamus curtisii

Goniothalamus giganteus

Goniothalamus griffithii

Goniothalamus holttumii

Goniothalamus lanceolatus

Goniothalamus laoticus

Goniothalamus macrophyllus

Página - 18 -

Goniothalamus malayanus

Goniothalamus montanus
Goniothalamus
Goniothalamus rotundisepalus

Goniothalamus scortechinii

Goniothalamus tapis

Goniothalamus tenuifolius

Goniothalamus tomentosus

Goniothalamus tortilipetalus

Goniothalamus umbrosus

Goniothalamus uvarioides

Goniothalamus wrayi

Greenwayodendron
Greenwayodendron oliveri

Greenwayodendron suaveolens

Guamia
Guamia sp. Rainer 1593

Guatteria aeruginosa

Guatteria alata

Guatteria allenii

Guatteria alta

Guatteria alutacea

Guatteria amplifolia

Guatteria anomala

Guatteria atra
Guatteria
Guatteria australis

Guatteria aff. australis Lobo and
Fiaschi 499

Guatteria blainii

Guatteria boliviana

Guatteria brevicuspis

Guatteria brevipedicellata

Guatteria cf. candolleana Harley et
al. 17360

Guatteria caribaea

Guatteria chiriquiensis

Guatteria diospyroides

Guatteria discolor

Guatteria dolichopoda

Guatteria dumetorum

Página - 19 -

Guatteria dusenii

Guatteria elata

Guatteria elegantissima

Guatteria ferruginea

Guatteria foliosa

Guatteria galeottiana

Guatteria glabrescens

Guatteria gracilipes

Guatteria guianensis

Guatteria heterotricha

Guatteria cf. hilariana Gottsberger
and Gottsberger 21-9274A

Guatteria hyposericea

Guatteria inuncta

Guatteria inundata

Guatteria jefensis

Guatteria cf. lasiocalyx Krukoff
11086

Guatteria cf. lasiocalyx Maas et al.
9000

Guatteria latifolia

Guatteria latisepala

Guatteria liesneri

Guatteria cf. lucens Gomez et al.
23305

Guatteria macropus

Guatteria maypurensis

Guatteria megalophylla

Guatteria cf. meliodora Maas et al.
9231

Guatteria mexiae

Guatteria modesta

Guatteria multivenia

Guatteria notabilis

Guatteria oligocarpa

Guatteria olivacea

Guatteria oliviformis

Guatteria ouregou

Guatteria pacifica

Guatteria paraensis

Guatteria parvifolia

Guatteria pittieri

Guatteria poeppigiana

Página - 20 -

Guatteria pogonopus

Guatteria pohliana

Guatteria polyantha

Guatteria polycarpa

Guatteria pubens

Guatteria pudica

Guatteria punctata

Guatteria puncticulata

Guatteria recurvisepala

Guatteria reflexa

Guatteria rigidipes

Guatteria rotundata

Guatteria rupestris

Guatteria salicifolia

Guatteria scandens

Guatteria schlechtendaliana

Guatteria schomburgkiana

Guatteria schunkevigoi

Guatteria scytophylla

Guatteria sellowiana

Guatteria sessilicarpa

Guatteria sessilis

Guatteria sordida var. ovalis

Guatteria sphaerantha

Guatteria stipitata

Guatteria subsessilis

Guatteria talamancana

Guatteria tonduzii

Guatteria trichoclonia

Guatteria venezuelana

Guatteria verruculosa

Guatteria villosissima
Guatteria sordida
Guatteria wachenheimii

Guatteria sp. Chatrou et al. 118

Guatteria sp. Chatrou et al. 174

Guatteria sp. Chatrou et al. 196

Guatteria sp. Chatrou et al. 245

Guatteria sp. Chatrou et al. 65

Guatteria sp. Lobo et al. 565

Guatteria sp. Maas et al. 9570

Guatteria sp. Pirie et al. 143

Página - 21 -

Guatteria sp. Pirie et al. 50

Guatteria sp. Prevost 4247

Guatteriopsis
Guatteriopsis ramiflora

Haplostichanthus
Haplostichanthus longirostris

Hornschuchia
Hornschuchia citriodora

Isolona
Isolona campanulata

Isolona cooperi

Isolona sp. Chase 542

Klarobelia candida

Klarobelia cauliflora

Klarobelia inundata

Klarobelia megalocarpa
Klarobelia
Klarobelia stipitata

Klarobelia sp. Meier and Llamozas
3685

Letestudoxa
Letestudoxa bella

Letestudoxa glabrifolia

Malmea dielsiana

Malmea dimera
Malmea
Malmea surinamensis

Malmea sp. Chatrou et al. 8

Marsypopetalum
Marsypopetalum pallidum

Meiogyne cylindrocarpa

Meiogyne stenopetala
Meiogyne
Meiogyne virgata

Página - 22 -

Meiogyne sp. Kessler 3219

Melodorum
Melodorum fruticosum

Melodorum cf. fruticosum Mols 10

Melodorum cf. fruticosum Mols 2

Mezzettia
Mezzettia parviflora

Mezzettiopsis
Mezzettiopsis creaghii

Miliusa campanulata

Miliusa cuneata
Miliusa
Miliusa horsfieldii

Miliusa lineata

Miliusa longipes

Miliusa thorelii

Miliusa velutina
Miliusa mollis
Miliusa sp. Middleton and Lamxay
269

Mitrella
Mitrella kentii

Mitrephora alba

Mitrephora celebica
Mitrephora
Mitrephora keithii

Mitrephora maingayi

Mitrephora polypyrena

Monanthotaxis
Monanthotaxis whytei

Monanthotaxis sp. Wieringa 3833

Monocarpia
Monocarpia euneura

Página - 23 -

Monodora crispata

Monodora myristica
Monodora
Monodora tenuifolia

Mosannona
Mosannona costaricensis

Mosannona discolor

Mosannona garwoodii

Mosannona pacifica

Mosannona papillosa

Mosannona vasquezii

Mosannona sp. Chatrou et al. 71

Neo-uvaria
Neo-uvaria acuminatissima

Neo-uvaria parallelivenia

Neostenanthera
Neostenanthera myristicifolia

Onychopetalum
Onychopetalum amazonicum

Onychopetalum periquino

Orophea brandisii

Orophea celebica

Orophea creaghii

Orophea enneandra
Orophea
Orophea enterocarpa

Orophea kerrii

Orophea cf. malayana Hoffmann
11

Orophea myriantha

Orophea polycarpa

Oxandra asbeckii

Oxandra espintana

Oxandra euneura

Oxandra laurifolia

Oxandra longipetala

Página - 24 -

Oxandra macrophylla

Oxandra nitida
Oxandra
Oxandra polyantha

Oxandra sphaerocarpa

Oxandra venezuelana

Oxandra xylopioides

Petalolophus
Petalolophus megalopus

Phaeanthus
Phaeanthus ebracteolatus

Phaeanthus splendens

Piptostigma fasciculatum

Piptostigma mortehani
Piptostigma
Piptostigma pilosum

Platymitra
Platymitra macrocarpa

Polyalthia borneensis

Polyalthia cauliflora

Polyalthia celebica

Polyalthia cerasoides

Polyalthia cinnamomea

Polyalthia congesta

Polyalthia debilis

Polyalthia discolor

Polyalthia flagellaris

Polyalthia cf. glabra Rastini 224

Polyalthia glauca

Polyalthia lateriflora

Polyalthia littoralis

Polyalthia longifolia
Polyalthia
Polyalthia cf. longifolia Mols 14

Polyalthia longipes

Polyalthia obliqua

Polyalthia pendula

Polyalthia rumphii

Página - 25 -

Polyalthia sclerophylla

Polyalthia stenopetala

Polyalthia stuhlmannii

Polyalthia subcordata

Polyalthia suberosa

Polyalthia sumatrana

Polyalthia viridis

Polyalthia xanthopetala

Polyalthia sp. Ridsdale DV-M1-
12314

Popowia
Popowia hirta

Popowia odoardi

Popowia pisocarpa

Porcelia
Porcelia steinbachii

Pseudartabotrys
Pseudartabotrys letestui

Pseudephedranthus
Pseudephedranthus fragrans

Pseudomalmea diclina

Pseudomalmea sp. Idarraga 13
Pseudomalmea

Pseudoxandra bahiensis

Pseudoxandra longipes
Pseudoxandra
Pseudoxandra lucida

Pseudoxandra aff. pacifica van
Rooden et al. 565

Pseudoxandra polyphleba

Pseudoxandra spiritus-sancti

Página - 26 -

Pseuduvaria brachyantha

Pseuduvaria coriacea
Pseuduvaria
Pseuduvaria pamattonis

Pseuduvaria rugosa

Rauwenhoffia
Rauwenhoffia siamensis

Rollinia edulis

Rollinia herzogii
Rollinia
Rollinia mucosa (wild sweetsop)

Ruizodendron
Ruizodendron ovale

Sageraea
Sageraea lanceolata

Sapranthus
Sapranthus microcarpus

Sapranthus viridiflorus

Stelechocarpus
Stelechocarpus burahol

Stelechocarpus cauliflorus

Stenanona
Stenanona costaricensis

Stenanona panamensis

Tetrameranthus
Tetrameranthus duckei

Tetrameranthus laomae

Tridimeris
Tridimeris hahniana

Trigynaea
Trigynaea duckei

Trigynaea lanceipetala

Página - 27 -
 Trivalvaria
Trivalvaria macrophylla

Unonopsis elegantissima

Unonopsis pittieri
Unonopsis
Unonopsis rufescens

Unonopsis stipitata

Uvaria chamae (finger-root)

Uvaria cordata

Uvaria faulknerae

Uvaria grandiflora
Uvaria
Uvaria hahnii

Uvaria hamiltonii

Uvaria lobbiana

Uvaria lucida

Uvaria macropoda

Uvaria micrantha

Uvaria microcarpa

Uvaria pierrei

Uvaria rufa

Uvaria vietnamensis

Woodiellantha • Woodiellantha sp. Lugas 311

Xylopia ferruginea

Xylopia frutescens
Xylopia
Xylopia hypolampra

Xylopia peruviana

Página - 28 -