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TRABAJOS PRÁCTICOS
LABORATORIO Y PROBLEMAS
LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
LICENCIATURA EN QUÍMICA
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
- 2007 -
2
Lista de Materiales para el Trabajo en el Laboratorio
Nota: cada alumno deberá disponer y proveerse de estos insumos de forma personal
- guardapolvo
- libreta de laboratorio
- anteojos de seguridad
- guantes de látex
- tijera
- marcador de vidrio
- espátulas metálicas
- pera de goma y/o propipeta
- tetinas
- encendedor
- papel de aluminio
- algodón
- alcohol
- escobillas
- detergente
- repasador
- trapo rejilla o similar
- pañuelos de papel y/o papel higiénico y/o rollos de papel de cocina
- jabón de mano
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Orgánica
3
Trabajo Práctico Nº 1
Empleo de métodos para la evaluación rápida de algunos parámetros de la

calidad de alimentos.
Se encuentran disponibles comercialmente una serie de paquetes de

reactivos especialmente preparados en composición y concentración adecuadas
para ser empleados en al análisis de determinados componentes de alimentos.
Estos conjuntos de reactivos (o "kits") son ampliamente empleados en el área de
análisis clínicos y de aguas, y se introdujeron con éxito en los laboratorios de análisis
de alimentos.
Objetivo. El objeto de esta práctica es obtener conclusiones acerca de la calidad de

los alimentos analizados empleando algunos de estos conjuntos de reactivos o "kits".
1. Compuestos nitrogenados
Los compuestos nitrogenados son por un lado índices químicos de
contaminación de aguas por materia orgánica y por otro, frutas y vegetales
frecuentemente poseen altas concentraciones de nitrato debido a sobre fertilización
u otras características del suelo. Se encuentran también en carnes y productos
cárneos, ya que las sales sódicas y potásicas de nitritos y nitratos se utilizan
comúnmente en los procesos de curado con el fin de desarrollar y fijar el color (los
nitritos forman en la carne óxido nitroso que reacciona con compuestos hemo para
dar nitrosomioglobina, responsable del color rosado de las carnes curadas), para
inhibir el crecimiento de microorganismos (género Clostridium) y para desarrollar
sabores característicos.
Desde hace tiempo se sabe que altas concentraciones de nitratos en los
alimentos causan el síndrome de cianosis, particularmente en niños y adultos
susceptibles. Los lactantes son particularmente sensibles a la presencia de nitratos
ya que se transforma a nitrito en un medio reductor como es el intestino de los
lactantes y éste causa oxidación del Fe2+ de la hemoglobina a Fe3+ generando
metahemoglobina, que tiene mucho menor eficiencia en el transporte de oxígeno en
la sangre que la hemoglobina. La espinaca y la acelga, siendo de los primeros
alimentos típicos luego de la etapa de lactancia, y el agua potable son la causa de
niveles bajos de oxígeno en sangre en niños pequeños. Altas concentraciones de
nitratos en adultos pueden también reducirse a nitritos y generar nitrosaminas
tóxicas. Según la OMS la concentración de nitratos máxima aceptable es de 50 mg/L
(50 ppm).
El C.A.A. fija un máximo para agua potable de 0.10 mg/L de nitrito y de 45 mg/L de
nitrato (art. 982).
El C.A.A. fija un máximo para chacinados cocidos de nitrato de sodio y nitrato de
potasio de 0.03 g/100g (Cantidad residual máxima expresada como nitrito de sodio)
(art. 323bis).

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a) Determinación de nitritos
En presencia de un tampón ácido los iones nitrito forman con una amina aromática
una sal de diazonio. Ésta reacciona con N-(1-naftil)-etilendiamina dando un
azocolorante violeta roijzo.
La reacción es la siguiente:
sulfanilamida Sal de diazonio N-(1-naftil)-etilendiamina Compuesto diazoico
Método: tiras reactivas Merckoquant 10 007 (0-80 mg/ de NO2-)

La concentración de nitritos se determina semicuantitativamente por comparación
visual de la zona de reacción de la tira de ensayo con las zonas de una escala
colorimétrica.
Preparación de la muestra:
Vegetales: picar; pesar 1,0 g de muestra en un vaso de precipitado y cubrir con agua
destilada; calentar con agitación y hervir durante 15 minutos. Dejar enfriar, filtrar y
llevar a 50 ml con agua destilada.
El valor del pH debe encontrarse en el intervalo 1 - 13. Si el pH es menor que 1,
amortiguar con acetato sódico; si es mayor que 13, ajustar a un valor de aprox. 3 - 5
con ácido tartárico.
Las muestras con más de 80 mg/l de NO2- deben diluirse con agua destilada.
Procedimiento:
1. Extraer una varilla indicadora del envase y cerrar inmediatamente.
2. Introducir la varilla durante 1 segundo en la solución a examinar de tal manera
que la zona de reacción quede totalmente humedecida.
3. Sacar la varilla indicadora, sacudir ligeramente el líquido sobrante y al cabo
de 15 segundos comparar la zona de reacción con la escala de colores.
Notas sobre la medición:

• Después de transcurrido el tiempo de reacción indicado, la zona de reacción puede
continuar cambiando de color. Esto no debe ser tenido en cuenta en la medición.
• Si el color de la zona de reacción corresponde a la tonalidad más oscura de la
escala colorimétrica o es más intenso, debe repetirse la medición con nuevas
muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 80 mg/l de NO2
b) Determinación de nitratos
Los iones nitrato se reducen cuantitativamente a iones nitrito en presencia de

cadmio, que en solución ácida forman con el ácido sulfanílico una sal de diazonio.
Ésta reacciona con un derivado del ácido benzoico dando un azocolorante amarillo
anaranjado.
Método: Metodo colorimetrico Aquamerck 1.11170.0001 (10-150 mg/l NO3 –).

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La concentración de nitratos se determina semicuantitativamente por comparación

visual del color de la solución de medición con las zonas de color de una tarjeta
colorimétrica.
Productos cárneos: pesar 0.5 g de muestra, agregar 10 ml de agua, 1 ml de solución
de solución de Carrez I, agitar, agregar 1 ml de solución de Carrez II, agitar y llevar a
20 ml con agua destilada.
El valor del pH debe encontrarse en el intervalo 4 - 10. Si es necesario, ajustar con
solución de hidróxido sódico o con ácido sulfúrico.
Filtrar las muestras turbias.
Procedimiento:
Notas
• Cerrar de nuevo inmediatamente el frasco tras la toma del reactivo.
• Enjuagar los tubos de ensayo y la jeringa solamente con agua.
Llenar con una Añadir 1 Cerrar el tubo 2 y Dejar reaccionar Comparar el color
jeringa ambos microcuchara del agitar durante 5 minutos con la escala
tubos con 5 mL de reactivo NO3-1 al intensamente colorimétrica
muestra tubo 2 durante 1 min

Si el color de la solución de medición corresponde a la tonalidad más oscura
de la escala colorimétrica o es más intenso, debe repetirse la medición con
nuevas muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 150 mg/l
de NO3-.
2. Níquel
El níquel es uno de los metales pesados, que si bien no es de los más tóxicos, su
presencia es indeseable. Se lo emplea en las industrias del vidrio y cerámica, en
galvanoplastia y como componente de catalizadores. En aguas superficiales se
encuentra generalmente en la forma de carbonato ácido, aunque otras sales pueden
estar presentes en efluentes. Se puede requerir también una identificación rápida del
tipo de acero empleado en las cañerías o contenedores. En la industria de alimentos
se emplean catalizadores de Ni en la hidrogenación de aceites.
El C.A.A. fija un máximo para agua potable de 0.02 mg/L (art. 982).
Determinación de níquel
Método: Aquaquant (Merck) 1.14420 (0.02-0.5 mg/l)

El níquel divalente es oxidado con I2 (reactivo Ni-1A) a un estado de oxidación
superior. El reactivo Ni-2A contiene amoníaco para llevar el pH a 11,5 y destruir el I2
en exceso. El níquel reacciona con la dimetilglioxima (reactivo Ni-3A) para formar un
complejo pardo rojizo.

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2 + Ni2+
Muestras:
Se utilizarán muestras de agua de diferentes fuentes.
Procedimiento:
a) Toma de muestra 20 ml a cada tubo
b) Añadir Ni-1A, mezclar, dejar en

4 gotas al tubo interior
reposo durante ~ 1 minuto
c) Añadir Ni-2A, mezclar 8 gotas al tubo interior
d) Añadir Ni-3A, mezclar 8 gotas al tubo interior
e) Medir Comparar al cabo de 3 minutos
Orientar el envase abierto de tal modo

que los tubos se encuentren a mano
izquierda. Llenar ambos tubos con Ia
muestra de agua. Añadir los reactivos
solamente al tubo interior, próximo al
operador.
Introducir Ia Parte de los círculos de
color de Ia escala desde Ia derecha en
Ia ranura del fondo de Ia caja y correrla
para que salga por el lado izquierdo
(rotulado), hasta que el color de Ia
muestra tratada con los reactivos
coincida con el circulo de color por
debajo del blanco. Leer el resultado en
Ia parte de Ia escala que sobresale en el
lado derecho de Ia caja.

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3. Plomo
En el pasado el empleo de tuberías de plomo para el agua corriente, de latas
con soldadura de plomo, de recipientes de barro vidriado y de láminas de plomo
utilizadas para sellar los corchos de los toneles en la elaboración de vinos condujo a
menudo a envenenamientos por plomo crónicos.
Actualmente la fuente principal de contaminación la constituyen la utilización
de combustibles en vehículos a motor y los compuestos inorgánicos formados como
consecuencia. No obstante, el contenido de plomo de los alimentos se ha elevado
poco por este motivo. Por lo general asciende a 0.02-0.30 mg/kg de alimentos (con
excepción de las verduras de hoja, especialmente si están cerca de carreteras:
superior a 0.65 mg/kg).
El C.A.A. fija un máximo para agua potable de 0.05 mg/L (art. 982) y un límite
de 2 mg/kg para alimentos en general (art. 156).
Determinación de plomo
Método: Merckoquant 10077 tiras reactivas o varillas analíticas (20-500 mg/L). El

plomo reacciona en solución ácida con el ácido rodizónico para dar un complejo de
color rojo. La concentración de plomo (II) se determina semicuantitativamente por
comparación visual de la zona de reacción de la tira de ensayo con las zonas de una
escala colorimétrica.
Pb
+ Pb (II)
Muestras:
Las muestras con más de 500 mg/l de Pb2+ deben diluirse con agua destilada.
Procedimiento

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muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 500 mg/l de Pb2+.
4. Cobalto
La determinación de cobalto tiene aplicación en el control de aguas residuales,

baños galvánicos, en la industria electrónica, la industria metalúrgica, y en el examen
y la preparación de minerales.
Determinación de cobalto
Método: Merckoquant 10002. Varillas analíticas para la identificación y la

determinación de iones cobalto (II) (0-1000 mg/L).
El test de cobalto Merckoquant es un test rápido de orientación para la
determinación semicuantitativa de iones cobalto (II).
El test se basa en la formación de un complejo (tetratiocianocobalto(II)) entre iones
cobalto (II) y tiocianato.

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Muestras:
Procedimiento:
1. Ajustar el valor de pH de la solución problema entre 1 y 7.
2. Introducir la zona de reacción de la varilla analítica 1 segundo en la solución
problema.
3. Eliminar el exceso de Iíquido de la varilIa, sacudiéndola. Al cabo de 15 segundos
comparar la zona de reacción con la escala de colores.

A un pH de 1-7 la exactitud de la identificación no depende del valor del pH de
la solución problema.
Si la coloración formada en la zona reactiva no coincide con la escala de colores, se
espera 2 minutos y luego se compara con la escala de colores. En caso de no ser
posible aún clasificar el color de esta forma, es que existe una interferencia debida a
iones extraños. En la identificación normalmente interfieren los iones hierro (III) y los
iones cobre. La zona reactiva de la varilla contiene un agente enmascarante especial
para suprimir estas reacciones secundarias interferentes.
5. Cromo
Su determinación es importante en la inspección de aguas efluentes de

curtiembres, plantas galvanoplásticas, como así también de muchos otros procesos
industriales en las que se emplean sales de cromo. En alimentos su presencia es
generalmente producto de contaminaciones involuntarias a partir del material
metálico empleado en el procesado y menos probablemente como materia colorante.
Se emplean sales de cromo en suplementos dietarios para aumentar la tonicidad
muscular.
Método: Varillas Chromat-test 10012 (3-100 mg/L).

Los iones hexavalentes de cromo en medio ácido reaccionan con difenilcarbazida
para formar un complejo rojo violeta. En primer lugar el cromo (VI) oxida la
difenilcarbazida a difenilcarbazona reduciéndose a su vez a cromo (III). Estos iones
cromo (III) se combinan con la carbazona formando el complejo coloreado intenso.
La concentración de cromato se determina semicuantitativamente por comparación
visual de la zona de reacción de la tira de ensayo con una escala colorimétrica.
difenilcarbazona
+ CrO4-2 Cr (III)
difenilcarbazida

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Muestras:
Procedimiento:
1. Lavar la probeta con la muestra y llenarla hasta el enrase (5 ml).

2. Añadir gota a gota el reactivo hasta que se obtenga un pH inferior a 1.
3. Extraer una varilla indicadora del envase y cerrar inmediatamente.
4. Introducir la zona de reacción de la varilla indicadora durante 1 segundo en la
solución a examinar de tal manera que la zona de reacción quede totalmente
humedecida.
5. Sacar la varilla indicadora, sacudir ligeramente el líquido sobrante y al cabo
de exactamente 15 segundos comparar la zona de reacción con la escala de
colores.

muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 100 mg/l de CrO4.
6. Peróxido de hidrógeno
Debido a su poder oxidante los peróxidos se emplean en la industria como

desinfectantes de equipos y cañerías, a veces en combinación con ácido peracético.
La determinación de peróxido de hidrógeno se realiza con distintas finalidades: para
cuantificar la concentración de agente efectivo en soluciones que aseguren
desinfección, para verificar su eliminación luego de la desinfección de cañerías,
superficies, etc. (industrias de bebidas gaseosas y jugos) y para controlar su uso
inadecuado como aditivo no permitido, como por ejemplo en la conservación de
leche.
Determinación de H2O2:
La peroxidasa transfiere el oxígeno del peróxido a un indicador redox orgánico.
Entonces se forma un producto de oxidación azul.
Método: Merckoquant 1.10011 varillas analíticas de 0.5-25 mg/l de H2O2.

La concentración de peróxidos se determina semicuantitativamente por
Muestras: Se utilizarán muestras de agua de diferentes fuentes.

El valor del pH de la muestra acuosa debe encontrarse en el intervalo 2 - 12. Si es
necesario, amortiguar la muestra con acetato sódico o ajustar el pH con ácido
clorhídrico.
Las muestras con más de 25 mg/l de H2O2 deben diluirse con con agua destilada.

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Procedimiento:

• Toda coloración azul dentro de 3 minutos puede interpretarse todavía como
hallazgo positivo.
escala colorimétrica o es más intenso o aparece otra coloración, debe repetirse la
medición con nuevas muestras a su vez diluidas con agua hasta que se obtenga un
valor inferior a 25 mg/l de H2O2.
7. Formaldehído
El formaldehído se utiliza como desinfectante de superficies, intercambiadores,

aparatos de análisis o como agente conservante. Debido a las limitaciones que
presenta desde el punto de vista de la salud, debería comprobarse continuamente
su ausencia en la fabricación y elaboración de productos. A pesar de todo, el
formaldehído como desinfectante no es sustituible, mientras que en el campo de los
productos alimentarios y cosméticos es reemplazado cada vez por otras sustancias.
Determinación de formaldehído:
El formaldehído forma con 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol una
tetrazina rojo púrpura.
Método: Merckoquant 10036 varillas analíticas de 10 - 100 mg/l.

La concentración de formaldehído se determina semicuantitativamente por
+ Tetrazina rojo púrpura
Muestras: Se utilizarán muestras de agua de diferentes fuentes.

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Procedimiento:

muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 100 mg/l de HCHO.

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Trabajo Práctico No2

Espectrofotometría UV/Visible.
Comparación de la sensibilidad en la determinación de un componente en

forma directa y luego de su derivatización (forma indirecta)
1. Determinación de ácido sórbico por espectroscopía UV y de su derivado

coloreado en el visible.
(a) Construcción de la curva de calibración para el ácido sórbico.
Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solución de ácido sórbico estándar (C: 1000 ppm) y

colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml. Llevar a volumen
cada matraz con agua destilada. Tomar 0,25 ml de cada solución y colocarlos en
matraces aforados de 25 ml. Agregar a cada matraz 0,10 ml de ácido clorhídrico 0,1
N y luego llevar a volumen con agua destilada.
Tomar 2 ml de una de las soluciones finales y realizar el espectro de absorción en un
espectrofotómetro UV-visible para determinar la longitud de onda máxima de
absorción. Tomar 2 ml de las soluciones finales y medir la absorbancia de dichas
soluciones a λmax determinada en el paso anterior.
Construir una curva de calibración graficando las absorbancias leídas en función de
la concentración de ácido sórbico.
(b) Determinación de la concentración de ácido sórbico en vino (método directo).
Preparación de la muestra
Tomar 2 ml de vino y colocarlos en un balón de destilación. Lavar la pipeta con 2-3

ml de agua. Realizar una destilación por arrastre con vapor de agua y recoger el
destilado.
Procedimiento
Tomar 2 ml del destilado y colocar en un matraz aforado de 10 ml. Llevar a volumen

con agua destilada. Tomar 0,25 ml de la solución y colocarlos en un matraz aforados
de 25 ml. Agregar 0,10 ml de ácido clorhídrico 0,1 N y luego llevar a volumen con
agua destilada. Tomar 2 ml de la solución final y medir la absorbancia a la λmax
determinada en el punto (a) en un espectrofotómetro UV-visible.
Determinar la concentración de ácido sórbico a partir de la curva de calibración
determinada en el ítem (a).
(c) Construcción de la curva de calibración para la colorimetría del ácido sórbico.
Fundamento del método
El ácido sórbico reacciona con K2Cr2O7 en presencia de H2SO4 para dar un

malonaldehído intermediario, que a su vez reacciona con el ácido tiobarbitúrico
(TBA) produciendo un producto coloreado rojo.

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Malonaldehído
TBA Pigmento
Procedimiento
Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solución de ácido sórbico estándar (C: 1000 ppm) y

colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml. Llevar a volumen
cada matraz con agua destilada. Tomar 2 ml de cada solución y colocarlos en tubos
de ensayo. Hacer un blanco con 2 ml de agua destilada. Agregar 1 ml de H2SO4 0,3
N y 1 ml de solución de K2Cr2O7 (0.147 g/100ml) y calentar en un baño de agua
caliente exactamente 5 minutos. Sumergir los tubos en un baño de hielo y agregar
2 ml de solución de tiobarbitúrico 0,5%. Colocar en un baño de agua caliente y
calentar durante 10 minutos. Enfriar y realizar el espectro de absorción en un
espectrofotómetro UV-visible para determinar la longitud de onda máxima de
absorción. Medir la absorbancia de dichas soluciones a λmax determinada en el paso
anterior.
Construir una curva de calibración graficando las absorbancias leídas a la λmax en
función de la concentración de ácido sórbico.
(d) Determinación de la concentración de ácido sórbico en vino (método indirecto).
Tomar 2 ml del destilado (muestra descripta en el ítem b) y realizar la reacción según

se indicó en el item (c). Calcular la concentración de ácido sórbico en la muestra
expresada en ppm a partir de la curva de calibración determinada en el ítem (c).
2. Determinación de proteínas en gelatina.
(a) Construcción de la curva de calibración para la proteína (método directo).
Fundamento del método
Las proteínas poseen una banda de absorción en el UV entre190 y 290 nm debida

fundamentalmente a la presencia de aminoácidos aromátcos (tirosina, triptofano y
fenilalanina). El método se basa en la medición de absorbancia a 280 nm. Es un
método simple, rápido y no destructivo.
Procedimiento
Tomar 2, 4, 6 y 8 ml de la solución de proteína estándar (C: 1000 ppm) y colocar

cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml. Llevar a volumen cada
matraz con agua destilada. Tomar 2 ml de las soluciones finales y medir la
absorbancia de dichas soluciones a λmax: 280 nm en un espectrofotómetro UV-
visible.

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Construir una curva de calibración graficando las absorbancias leídas a 280 nm

contra la concentración de proteína.
(b) Determinación de la concentración de proteína en un alimento (método directo).
Pesar aproximadamente 1 g de una gelatina comercial, disolverlos en un mínimo

volumen de agua caliente, dejar enfriar y llevar a 100 ml con agua destilada. Tomar 1
ml de muestra, agregar 1 ml de agua destilada y medir la absorbancia de dicha
solución a λmax: 280 nm en un espectrofotómetro UV-visible. Calcular la
concentración de proteína en la muestra expresada en ppm a partir de la curva de
calibración determinada en el ítem (a).
(c) Construcción de la curva de calibración para la proteína (método indirecto).
Fundamento del método de Biuret

Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina,
formando un quelato color violeta de configuración desconocida. La intensidad de
color es directamente proporcional a la concentración de proteínas presente en la
muestra.
Reactivos
Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3,35 g de Na2EDTA en 350 ml
de agua destilada. Agregar lentamente y con agitación constante 100 ml de solución
fresca de NaOH 5 mol/l. Aforar a 500 ml con agua destilada.
Solución de proteína estándar: 20 mg/ml.
Procedimiento
- Preparar los tubos correspondientes a la curva de calibración de acuerdo a la
siguiente tabla:
St
Biuret
(20mg/ml) Agua
(Reactivo)
Blanco 0 200 µl 2 ml
1 50 µl 150 µl 2 ml
2 100 µl 100 µl 2 ml
3 150 µl 50 µl 2 ml
4 200 µl 0 2 ml
- Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

- Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotómetro
- Construir una curva de calibración graficando las absorbancias leídas en función de
la concentración de proteína.
(d) Determinación de la concentración de proteína en un alimento (método indirecto).

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Muestra: Pesar aproximadamente 1 g de una gelatina comercial, disolverlos en un

mínimo volumen de agua caliente, dejar enfriar y llevar a 100 ml con agua destilada.
- Preparar los tubos correspondientes a la muestra de acuerdo a la siguiente tabla:
St Muestra
Biuret
(20mg/ml) Gelatina Agua
(Reactivo)
100 mg/10ml
M1 0 200 µl 0 2 ml
M2 0 200 µl 0 2 ml
- Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

- Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotómetro
Notas
- El color del complejo proteico es estable al menos por 1 hora.
- La ley de Beer y Lambert se cumple hasta los 10g/dl

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Métodos enzimáticos en el análisis de alimentos
a. Determinación de componentes por medio de enzimas

Determinación de la cinética de hidrólisis enzimática de lactosa y del efecto de
factores que la modifican.
Objetivo: El objetivo de este trabajo práctico es determinar el efecto de la

temperatura y la presencia de sales sobre la cinética de una reacción enzimática,
determinando su producto mediante una reacción enzimática.
La hidrólisis de lactosa se llevará a cabo empleando una enzima comercial. El

seguimiento de la hidrólisis se realizará por la determinación de la glucosa obtenida
mediante un método enzimático.
Preparación de la muestra: Diluir convenientemente la muestra tal que la

concentración de lactosa inicial sea de 5%. Preparar un volumen de 30 ml de esta
dilución. Ej.: suero de queso en polvo (3g/30ml de agua destilada; leche o suero: 30
ml de muestra tal cual; etc.).
Procedimiento:
1. Ajustar la mezcla de reacción a pH 6.0 con KOH 20%.
2. Distribuir 8 ml de muestra en tubos de ensayo rotulados de la siguiente manera:
37°C, 4°C y 50°C. Agregar 2 ml de agua destilada en cada tubo.
3. Para estudiar la influencia de cationes monovalentes y divalentes distribuir 8 ml
de muestra en tubos rotulados de la siguiente manera: Ca2+/Mg2+ 37°C y Na+
37°C. Agregar 2 ml de CaCl2 0,05 M ó 2 ml de NaCl 0,05 M ó 2 ml de MgCl2.
4. Preincubar a la temperatura de reacción durante 10 minutos (4º, 37º o 50ºC).
5. Agregar 20 µl de enzima a cada tubo y agitar.
6. Inmediatamente después de agregar la enzima retirar una alícuota de 0.5 ml (por
duplicado) de cada muestra y colocar en tubos de ensayo, e inactivar la enzima
colocando los tubos a 90ºC durante 3 minutos. Este será el tiempo cero de la
cinética.
7. Colocar en baño de agua a 37º o 50ºC, o en heladera a 4ºC según corresponda.
Colocar bolitas de vidrio sobre los tubos que se incubarán a 50°C para evitar la
evaporación de la muestra.
8. Retirar alícuotas de 0.5 ml (por duplicado) en tubos de ensayo a los tiempos
indicados en la tabla e inactivar la enzima colocando los tubos a 90ºC durante 3
minutos.
9. Luego de inactivar la enzima, agregar 4.5 ml de agua destilada.
10. Determinar la concentración de glucosa de las distintas alícuotas empleando un
método enzimático.
Técnica para determinar glucosa
1. Extraer 20 µl de muestra de cada tubo y colocar en un tubo de ensayo

2. Agregar 2 ml del reactivo de trabajo preparado.
3. Incubar en baño de agua a 37ºC durante 10 minutos.

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4. Realizar el mismo procedimiento con una solución standard de glucosa 0.1%

y un blanco con agua.
5. Medir la absorbancia de las muestras a 505 nm en cubetas de vidrio o
plástico.
Cálculos
Abs muestra x 0.1 x 5

% glucosa en cada muestra = -------------------------------- = G
Abs standard x 0.5
% lactosa hidrolizada en cada muestra al tiempo t = G x 1.9 = Lt
% lactosa hidrolizada = Lt / Lo x 100
Lo = concentración de lactosa inicial = 5% P/V
% Hidrólisis de Lactosa
Muestra 1 2 3 4 5
Tincub: 37 ºC Tincub: 4 ºC Tincub: 50 ºC Ca2+/Mg2+ Na+

Tincub: 37ºC Tincub: 37ºC
Tiempo
0´
10´
20´
40´
60´
120´
V máx
Informe:
1. Graficar % lactosa vs. tiempo.
2. Graficar % hidrólisis vs. tiempo, estimar velocidad máxima y concluir sobre las
condiciones óptimas de actividad enzimática de la lactasa.

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Métodos Enzimáticos II
Determinación de actividad enzimática en alimentos.
y su termorresistencia
Objetivo: determinar la actividad de distintas enzimas (ureasas, diastasas, fosfatasa

alcalina) presentes en alimentos y observar su resistencia térmica.
I.- Determinación de actividad ureásica en harina de soja
El calentamiento o tostado de la harina de soja es esencial para eliminar factores

biológicamente activos tales como inhibidor de tripsina, hemoaglutinación, inhibidor
de lipasa, antivitamínicos, goitrogénicos. Las condiciones óptimas de calentamiento
se logran a través del control de: humedad, temperatura y tiempo. Uno de los
mejores indicadores in vitro para controlar si el tratamiento térmico fue el adecuado
es la medición de la actividad ureásica. Altos valores de actividad ureásica indicarían
que el producto ha sido calentado suavemente. Bajos valores, sugieren que pudo
haber habido sobrecalentamiento. Poder controlar la intensidad del tratamiento
térmico aplicado es importante ya que un calentamiento inadecuado, tanto por
exceso como por defecto, conduciría a la obtención de harinas de soja con un menor
valor nutritivo. En el caso de sobrecalentamiento, habría pérdida de aminoácidos
esenciales (lisina y arginina1); en el caso de un calentamiento insuficiente, la
eliminación de factores biológicamente activos no sería completa.
I.1.- Preparación del extracto enzimático - Método de Natelson (modificado):
Mezclar 30 g de harina de soja (recién molida) con 50 mL de ácido sulfúrico N/1000.

Agitar en un agitador de Khan durante 20 min. Añadir 150 mL de agua destilada y
continuar la agitación durante 15 min más (producto A). Realizar el tratamiento
térmico según se indica más adelante, filtrar y, sobre el filtrado así obtenido,
determinar actividad ureásica.
I.2.- Tratamiento térmico:

Al producto obtenido de la extracción sólido líquido del paso anterior (producto A) se
le aplicarán los siguientes tratamientos térmicos:
- autoclave: 0 y 30 min
- 90ºC: 0 y 30 min
1
Algunos autores consideran que a la arginina, y también a la histidina, como esencial para niños pero no para
adultos.

20
I.3- Medición actividad enzimática
Usando urea como sustrato, se determinará la actividad ureásica en la harina de

soja. Para ello se practicará, con agua destilada, una dilución del extracto de soja
tratado térmicamente en proporción 1:82.
I.3.1.- Fundamento del método:
La ureasa, al actuar sobre la urea, la hidroliza originando anhídrido carbónico y

amoníaco. El amoníaco reacciona con fenol e hipoclorito (reacción de Berthelot), en
presencia de un catalizador (nitroprusiato de sodio), generando un producto cuya
coloración es proporcional a la cantidad de urea hidrolizada.
I.3.2.- Reactivos:
- Solución de sustrato estándar: 0.6 g urea/L.
- Reactivo 1: fenol, nitroferricianuro de sodio y etilen-bis-ditiocarbamato manganoso.
- Reactivo 2: hipoclorito de sodio y p-toluen sulfocloramida en hidróxido de sodio.
I.3.3.- Procedimiento:
Se mezcla por agitación suave 50 µL de extracto de dilución adecuada y 20 µL de
sustrato. Juntamente realizar un blanco. Incubar durante 5 minutos a 37ºC. Agregar
1 mL del reactivo 1 y 1 mL del reactivo 2. Mezclar por agitación suave e incubar 5
minutos a 37ºC. Luego agregar 8 mL de agua destilada y mezclar por inversión.
Medir A 540nm, dentro de los 20 min. Ajustar el cero del espectrofotómetro con agua
destilada.
Esquemáticamente:
muestra blanco
muestra (µL) 50 -
agua destilada (µL) - 50
sustrato (µL) 20 20
incubar a 37ºC x 5 min
reactivo 1 (mL) 1 1
reactivo 2 (mL) 1 1
mezclar x agitación suave
incubar a 37ºC x 5 min
agua destilada (mL) 8 8
mezclar x inversión
leer A (540 nm)
2
Las diluciones adecuadas pueden variar, dependiendo de cada partida de harina y del estado de conservación de
las muestras.

21
II.- Determinación de actividad α-amilásica en miel
La actividad diastásica de la miel ha recibido considerable atención por años como

indicador de "frescura". El tratamiento térmico (63ºC/30 min. o 77ºC/pocos seg), ha
sido rutinariamente usado para destruir levaduras y retardar la granulación en
mieles.
El Codex Alimentarius y el CAA exigen valores mínimos de diastasa como control de

la exposición de la miel al calentamiento.
II.1.- Tratamiento térmico de las muestras:

Sobre aprox. 2 g de miel se realizarán los siguientes tratamientos térmicos:
- 63 ºC a 0, 15, 30, 45 y 60 min.
- 85ºC a 0, 10, 15, 30 y 45 min.
Luego del calentamiento, enfriar las muestras en baño de hielo. Pesar aprox. 1g de
muestra y diluir a 10 mL con agua destilada. Realizar las determinaciones de
actividad enzimática por duplicado.
II.2.- Medición actividad enzimática

II.2.1.- Fundamento del método:
El sustrato, almidón tamponado, al ser incubado con la muestra se hidroliza

enzimáticamente. Esta se detiene por el agregado de reactivo de iodo, que al mismo
tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado3. La disminución
de color respecto de un sustrato color (sin muestra) es la medida de la actividad
enzimática, que se expresa en UA (unidad amilolítica: la cantidad de enzima
contenida en 100 mL de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 min).
UA = A control - A muestra x 1000

A control
II.2.2.- Reactivos:4,5
- Solución de sustrato: solución de almidón 500 mg/L, tamponada a pH 7 con buffer
fosfatos 0.1 mol/L en NaCl 0.15 mol/L. Almacenar en heladera.
- Reactivo de iodo: solución 0.01 eq/L de I2 en ácido clorhídrico 0.02 mol/L.
Almacenar en heladera.
3
El color de la reacción del Amilokit no es azul debido a un exceso de yodo que junto con el HCl presentes en el
reactivo de yodo son necesarios para asegurar (i1) la completa inhibición de la reacción enzimática; (i2) la
estabilidad del color y para (ii) eliminar la influencia que pudiera haber de las proteínas en la reacción de color.
4
Amilokit – Wiener lab
5
Debido a la alta actividad amilásica de la saliva, hay que evitar toda contaminación donde esta esté
involucrada. El sustrato debe medirse con pipeta de 5 mL o con pipeta de 1 mL de doble aforo. No debe soplarse
por la pipeta ya que la mínima contaminación con saliva deteriora definitivamente al sustrato.

22
II.2.3.- Procedimiento:
Incubar 1 mL de sustrato atemperado a 37°C, con 400 µL de muestra en baño de

agua a 37°C. Realizar paralelamente un control. A los 7 min y medio exactos, se
agrega 1 mL de reactivo de iodo. Se mezcla por agitación suave y se retiran los
tubos del baño. Inmediatamente se agregan 8 mL de agua destilada. Luego se
mezcla por inversión.
Medir A 640nm, dentro de 1h. Si la temperatura ambiente es superior a 25ºC, leer

antes de los 20 min. Ajustar el cero del espectrofotómetro con agua destilada.
Esquemáticamente:
muestra control
sustrato (mL) 1 1
baño de agua a 37ºC x unos minutos
muestra (µL) 400 -
agua destilada (µL) - 400
incubar a 37ºC x 7 min 30 seg exactos
iodo (mL) 1 1
mezclar x agitación suave y retirar del baño
agua destilada (mL) 8 8
mezclar x inversión
leer A (640 nm)
III.- Determinación de la actividad de fosfatasa alcalina en productos lácteos
La determinación de fosfatasa alcalina está destinada a decidir si un producto lácteo

ha sido pasteurizado en condiciones de tiempo y temperatura adecuados. El CAA y
las Normas Mercosur exigen que la prueba de fosfatasa alcalina en productos
lácteos dé negativa.
III.1.- Preparación de muestra:

- leche en polvo: reconstituir aprox. 1g en 10 mL de agua.
- leche fluida: tal cual
- manteca: pesar aprox. 1 g de muestra, extraerla por debajo de la superficie con un
cuchillo limpio.
- crema de leche: tal cual
III.2.- Medición actividad enzimática

III.2.1.- Fundamento del método:
La determinación de actividad fosfatasa se basa en la hidrólisis enzimática, en medio
alcalino, del fenilfosfato disódico (NaFF) a fenol y posterior determinación
colorimétrica del fenol liberado con 4-aminoantipirina (4-aminofenazona) y
ferricianuro como agente oxidante.

23
III.2.2.- Reactivos:
- Solución sustrato: NaFF (1.4 mM) en buffer de pH 10 de aminometilpropanol (3 M)
y 4-aminoantipirina (29 mM). Conservar en heladera durante no más de 5 meses.
- Reactivo de color: ferricianuro de K (10 mM). Estable durante 5 meses a
temperatura ambiente y al abrigo de la luz.
- Estándar: solución de fenol (200 UI/L)
III.2.3.- Procedimiento:
Preincubar 0.5 mL de solución de sustrato unos minutos a 37°C. Luego, agregar 50

µL de muestra, mezclar e incubar exactamente 10 min6. Realizar paralelamente el
estándar y un blanco de reactivos. Agregar 2.5 mL de reactivo de color y retirar los
tubos del baño.
Medir A 520nm, dentro de los 30 min. Ajustar el cero del espectrofotómetro con agua
destilada.
Esquemáticamente:
blanco estándar muestra
sustrato (mL) 0.5 0.5 0.5
incubar a 37ºC en baño de agua x unos minutos (4 min)
muestra (µL) - - 50
estándar (µL) - 50 -
H2O destilada 50 - -
(µL)
mezclar bien (vortex)
incubar a 37ºC x 10 min exactos
react. de color 2.5 2.5 2.5
(mL)
mezclar inmediatamente (vortex)
leer a A (520 nm)
III.3.- Informe:
La cantidad de producto formado luego del tratamiento, U, está relacionada con la

cantidad de producto formado en el tiempo cero (sin tratamiento térmico), Uo. La
actividad remanente (RA) se puede expresar como:
RA = 100 U/Uo
Nota: En trabajos prácticos tomaremos U = A al tiempo correspondiente

U0 = A al tiempo 0
Construir el gráfico de actividad enzimática remanente en función de las condiciones

de tratamiento.
Concluir sobre la cinética de inactivación y la estabilidad relativa de las enzimas.

6
El tiempo y la temperatura de reacción son críticos. Un min o 1ºC en exceso o defecto pueden producir un error
de ± 10%.

24
Trabajo Práctico No. 5.
Aplicaciones de microscopía en ciencia de alimentos
La primera aplicación de la microscopía en el estudio de alimentos data de1850,

cuando Arthur Hassall demostró que con ayuda del microscopio era posible diferenciar
el café molido de la achicoria. Fue desde entonces un tipo de análisis muy empleado
para detectar adulteraciones en alimentos, aditivos e ingredientes. Durante el siglo XX
una legislación cada vez más rígida limitó la adulteración en alimentos y drogas, y por
lo tanto fueron necesarios procedimientos analíticos más precisos.
Actualmente, la microscopía es una herramienta poderosa para complementar
técnicas tales como reología o calorimetría y se emplea cada vez más para estudiar la
influencia de los ingredientes y las condiciones de procesado en la estructura de los
alimentos.
Las técnicas más empleadas tradicionalmente para caracterizar componentes
y estructuras en alimentos son: microscopía óptica, microscopía con luz polarizada y
con contraste de fase
Se han desarrollado potentes herramientas para la caracterización
microscópica de materiales, cuya aplicación en tecnología de alimentos tiene
amplias oportunidades de favorecer la investigación Entre algunas de las más
importantes de las técnicas más actuales se encuentran:
Microscopía de estéreo fluorescencia.
Microscopía láser confocal de barrido..
Microscopía de fluorescencia confocal.
Microscopía electrónica de barrido.
Microscopía electrónica de transmisión.
Microscopía de fuerza atómica.
Además, mediante el acoplamiento con platinas térmicas controladas se
pueden registrar los efectos de la temperatura simultáneamente con los cambios de
estructura y el desarrollo de métodos computacionales de análisis de imágenes
permite una cuantificación de los fenómenos.
Objetivo: Observar cambios estructurales producidos en los alimentos al atravesar

los materiales temperaturas críticas, como aquellas correspondientes a sus
transiciones de estado.
Desarrollo de la práctica. Se realizarán observaciones en función de la temperatura

y el tiempo de exposición a temperaturas dadas.
Materiales
Muestras: Sacarosa amorfa.
Polivinilpirrolidona (PVP)
Maltodextrinas.
Café instantáneo.
Microscopios ópticos con polarizadores.
Baños secos.
Platina de Koffler con luz polarizada.
Pinzas y espátulas metálicas pequeñas.

25
Dispositivo para tratamiento térmico y observación de las muestras. El dispositivo

que muestra la figura ha sido diseñado para mantener el contenido de agua
constante a medida que la muestra se somete a tratamiento térmico.
Portaobjetosglass slide
Microscope Supercooled material
Muestra
a)
O-ring
Rubberde goma
O-ring
b)
Sujetador
Metal clip
metálico
Las observaciones a realizar son las siguientes:
a) Cambios de estructura en polímeros provocados por la transición vítrea.
b) Cristalización de sacarosa amorfa.
c) Apelmazamiento debido a la temperatura en café instantáneo.
d) Gelatinización de almidón.
Datos:
- Temperaturas de transición vítrea de los materiales a analizar en función del
contenido de agua.
- Temperaturas de gelatinización del almidón.
Informe:
1. Realizar observaciones preliminares de: opacidad del material, color, presencia de
anisotropía, formas y tamaños de las partículas, definición de las formas.
2. Someter al material dado a temperaturas inferiores, superiores y cercanas a las
críticas de acuerdo con los datos suministrados. La sacarosa amorfa se someterá a
tratamiento térmico en la platina de Koffler y se realizarán observaciones periódicas
para concluir acerca de la velocidad de cristalización.
3. Observar nuevamente el material y concluir acerca de los cambios ocurridos,
explicándolos en base a las temperaturas y tiempos de tratamiento.
4. Analizar las condiciones para observación de las muestras (con/sin luz polarizada,
con/sin tinciones).

26
Trabajo Práctico No. 6.
Medida de los tiempos de relajación transversal en sistemas modelo situados

en distintas regiones del diagrama de fases.
La espectroscopía de resonancia magnética nuclear se basa en la medida de

la absorción de la radiación electromagnética en la región de las radiofrecuencias,
aproximadamente de 4 a 900 MHz. En el proceso de absorción están implicados
núcleos de átomos que tienen propiedades de espín y momento magnético tales que
al ser expuestos a un campo magnético intenso absorben radiación
electromagnética como consecuencia del desdoblamiento de sus niveles de energía
inducido por el campo magnético.
Desde hace unas décadas existen en el mercado equipos que operan a bajas
frecuencias para el análisis de rutina en alimentos. Estos funcionan midiendo una
cantidad de átomos de hidrógeno para ciertos componentes en la muestra de
interés. Los átomos de H más comúnmente analizados por esta técnica son los de
lípidos o agua, en fases líquidas o sólidas y polímeros. Los núcleos de H en estas
moléculas se comportan como pequeñas barras de imán y cuando la muestra se
coloca en un campo magnético se alinean paralelas al mismo. Posteriormente, la
orientación de los núcleos se cambia por medio de la aplicación de un pulso de
radiofrecuencia. Luego, estos núcleos de H vuelven a alinearse con el campo
magnético del imán, emitiendo una señal de radiofrecuencia que es detectada por el
equipo.
Básicamente, el equipo consta de un imán permanente con un espacio entre
los polos para colocar las muestras y una fuente de radiofrecuencias. En el método
por pulsos los núcleos se excitan por un pulso de radiofrecuencias (de unos
microsegundos de duración) que excita los H de todas las fases. Luego el pulso se
apaga y los núcleos retornan a su estado original, mediante el proceso de relajación,
emitiendo una señal a medida que lo hacen. La señal emitida tiene una intensidad
máxima cuando todos los núcleos han rotado 90° respecto de la dirección del campo
magnético estático. La evolución de la señal en el tiempo contiene la información
más importante para propósitos analíticos. A medida que la muestra retorna a su
posición de equilibrio, la oscilación del vector magnetización en el plano x,y
(perpendicular al campo magnético permanente) emite el exceso de energía en
forma de una señal de voltaje decreciente que se denomina decaimiento libre de la
inducción: FID (free induction decay). Esta señal es recibida por un sepentín
colocado en el plano x,y. La amplitud inicial de la señal FID es proporcional al
número de protones en la muestra. Ya que esta señal es una medida de amplitud en
función del tiempo, se llama gráfico en el dominio de los tiempos.
Características de las aplicaciones analíticas:
1. La amplitud inicial de la señal es proporcional al número total de núcleos que

absorben a la frecuencia dada
2. Las señales debido a núcleos en distintos ambientes (físicos o químicos) relajan a
distinta velocidad. Cada componente decae con un tiempo de relajación
característico. Las señales debidas a H en fase sólida decaen más rápido que las de
H en fase líquida.

27
3. A veces se obtiene más información si se aplican series de pulsos de

radiofrecuencias en secuencias determinadas en lugar de un único pulso.
4. Por medición de la señal en intervalos de tiempo adecuados se obtiene toda la
información necesaria para el análisis. Se hace por microprocesadores acoplados.
5. La relación entre la amplitud de la señal y el tiempo es logarítmica y se aproxima a
0 a aproximadamente 5 veces el tiempo de relajación. Ejemplo: El tiempo de
relajación para la manteca de cacao en cacao en polvo es 10 ms. Todos los núcleos
vuelven a su estado alineado en menos de 1s. Para mejorar la reproducibilidad se
acumulan varios barridos de una muestra.
Aplicaciones de rutina
Las aplicaciones de rutina de la RMN son las determinaciones de contenido

de agua, de lípidos totales, y el índice de grasa sólida.
En las mediciones relativas, como aquellas en las que se determina el índice de
grasa sólida, se realiza el cociente entre la amplitud de dos señales (una que
corresponde al contenido total de lípidos en ambas fases y otra a los lípidos en la
fase líquida) y la medición no requiere el conocimiento de la masa de muestra. En
las mediciones absolutas la amplitud de la señal se normaliza por la masa de
muestra para obtener el porcentaje en peso de un determinado componente.
Existen diferentes tipos de técnicas desarrolladas para equipos de resonancia
magnética nuclear resuelta en el tiempo, entre ellas hay algunas aplicaciones de
gran interés en el área de alimentos. Las aplicaciones “absolutas” permiten
cuantificar de manera sencilla y rápida algunas variables de gran importancia como
por ejemplo contenido de agua, de azúcares, de aceite.
En muchas aplicaciones absolutas se emplea la medición del eco de espín en
el que se aplica más de un pulso de radiofrecuencias para dar la señal a ser medida.
El experimento comienza con un pulso de 90° pero a un cierto tiempo T (de unos
ms) luego del primer pulso se aplica otro de 180° y al tiempo 2T aparece la señal del
eco de espín. Esta metodología es especialmente útil para la medición de aceite en
semillas en donde también hay una cierta cantidad de agua. Se puede medir a un
tiempo (entre 7 y 10 ms) en el que solo el aceite contribuye a la amplitud de la señal.
Aplicaciones especiales
Las aplicaciones especiales se basan en que la técnica permite relacionar la
movilidad de los átomos en análisis a través de sus procesos de relajación. De esta
manera, es posible obtener información que se relaciona con las carácterísticas
mecánicas y térmicas de los materiales, con sus transiciones de fase y estado y con
procesos de difusión, complementando otras técnicas como la calorimetría de
barrido diferencial, o análisis térmico mecánico. Es por eso que se aplica en Ciencias
de polímeros y alimentos, farmacia.
Existen dos tipos fundamentales de procesos de relajación (regreso a la

condición de equilibrio) en espectroscopía de RMN 1) relajación longitudinal o espín-
red y 2) relajación transversal o espín- espín. Las relajaciones espín-espín se realiza
entre los núcleos que absorben y las relajaciones espín-red se realizan con todo el
conjunto de átomos de la muestra. En este último caso, cuando dos núcleos vecinos
se hallan en diferentes estados cuánticos magnéticos los campos magnéticos de los
mismos pueden interactuar entre sí produciendo un intercambio de estados
cuánticos. Como consecuencia el tiempo de vida promedio de un núcleo excitado se

28
acorta. La relajación espín-espín es un proceso de disminución exponencial de

primer orden que se caracteriza con un tiempo de relajación T2. Para sólidos
cristalinos o líquidos muy viscosos el fenómeno de relajación espín espín es más
eficiente y los tiempos son muy pequeños (10-4 s). Cuanto menor es la viscosidad de
la muestra más largos son estos tiempos.
Desarrollo de la práctica
Realizaremos observaciones de sistemas con distintos tiempos de relajación en

función de la viscosidad o características físicas del medio.
Objetivo 1: evaluar la influencia de las transiciones de fase o estado sobre los

cambios en los tiempos de relajación transversal.
Se analizará el efecto de:
a) El tratamiento térmico de suspensiones de almidón, seguido de enfriamiento.
b) El tratamiento térmico en soluciones de gelatina, seguido de enfriamiento.
c) La recristalización de azúcares de soluciones sobresaturadas
Materiales
Almidón. El almidón es un polímero de glucosa parcialmente cristalino y

parcialmente amorfo. La amilosa y algunas ramificaciones de amilopectina
contribuyen a formar las regiones amorfas y las cadenas externas de amilopectina
contribuyen a la región cristalina.
El almidón se vuelve totalmente amorfo después de la gelatinización.
Cuando el producto gelatinizado se enfría, la fracción amilosa liberada del gránulo
gelifica durante el enfriamiento posterior, aumentando notablemente la viscosidad
del medio.
Proteínas. Gelatina. Está compuesta por fracciones de colágeno hidrolizado

y tiene la propiedad de gelificar al enfriar, generando una estructura ordenada de
características mecánicas más semejantes a un sólido.
Azúcares Según la zona del diagrama de estado en que se encuentren los

sistemas, se observará la re-cristalización de azúcares.
Se analizarán transiciones de los distintos componentes mencionados, a distintas

temperaturas y tiempos de calentamiento/enfriamiento.
Procedimiento
Colocar 4 mL en tubos estandarizados para RMN de cada una de las muestras.

Medir T2 empleando la secuencia de eco de espín Carr-Purcel-Meiboon-Gill (CPMG)
(90º τ 180 τ).
Calcular T2 interpretando los datos X, Y con la siguiente ecuación:

I = A1 exp (-t/T2)
Donde, I es la intensidad en la escala de ordenadas y t es el tiempo. A1 es una

constante relacionada con la fracción de agua no congelada (cuanto mayor es A1

29
menor es la formación de hielo) y T2 se relaciona con la movilidad molecular (cuanto

mayor es T2 mayor es la movilidad de los protones en la matriz).
Informe.
a) Indicar en cada caso qué proceso está detectando a través de T2.

b) Relacionar los resultados con las características de cada material.
Objetivo 2: Observar la transición vítrea en muestras de productos de cereal a un

dado contenido de agua, a través del análisis de los tiempos de relajación T2
obtenidos por RMN en el dominio del tiempo.
Materiales
Se analizarán muestras de cereales de un dado contenido de agua en función de la
temperatura.
Procedimiento
Se colocarán aproximadamente 2 g de muestra en tubos de vidrio de 8 mm de

diámetro (tubos para RMN). Se determinarán los tiempos de relajación T2 a través
del análisis del decaimiento libre de la señal luego de un pulso de 90°(FID).
Informe.
a) Graficar los tiempos de relajación en función de la temperatura y concluir
sobre el valor de Tg .
b) Explicar los resultados obtenidos.
c) Comparar con datos de bibliografía para sistemas relacionados (almidón,
gluten, harinas, etc.).

30
Métodos electroanalíticos para la caracterización de alimentos
Objetivo: Caracterizar la variación de la conductividad eléctrica y el pH con el

contenido acuoso, complementadas por la determinación de cenizas.
Sobre distintas muestras de miel se realizarán las siguientes determinaciones:
• Contenido de agua.
• Conductividad específica en función del % de miel en base seca.
• pH en función del % de miel en base seca.
Contenido de agua. (A.O.A.C., 969.38 B,1990).
El contenido de agua en mieles se determinará por refractometría a 20°C

(refractómetro Abbé).
Procedimiento:
Abrir el doble prisma y esparcir la muestra con ayuda de una varilla sobre la cara
inferior, cerrar los prismas firmemente y dejar un minuto para que la temperatura de la
muestra y el aparato se equilibren. Buscar en el campo del visor la franja que indica
reflexión total; ajustar dicha franja en el punto de intersección de la cruz del visor,
rotando el tornillo compensador si la línea no fuera nítida y presentara coloración.
Leer el índice de refracción directamente sobre la escala, hacer 2 o 3 lecturas y

promediarlas. Calcular el % de agua a partir de la tabla correspondiente (A.O.A.C.,
940.39, 1990).
Como el refractómetro a utilizar no cuenta con camisa termostatizada, se hará circular

agua durante las observaciones, se leerá la temperatura en el termómetro del aparato
y se corregirá la lectura para obtener la equivalencia a 20°C, como se indica la nota al
pie de la tabla.
El instrumento puede chequearse con agua destilada a 20°C (índice de refracción =
1,3330).
Conductividad.
El valor de conductividad es muy usado en el análisis de aguas para obtener un

valor estimativo rápido del contenido de sólidos disueltos. La conductividad está
íntimamente relacionada con la suma de la concentración de los cationes o aniones
determinados químicamente. Aproximadamente el valor de la conductividad en
µS/cm por un factor que oscila entre 0,55 y 0,7 es igual al contenido de sólidos en
mg/L. El agua de mar tiene conductividades de alrededor de 50000 µS/cm; aguas
residuales entre 600 a 2000 µS/cm; aguas de pozo 150 a 1000 µS/cm y de río de
100 a 3000 µS/cm.

31
La determinación de la conductividad específica en mieles, es un parámetro que

permite establecer la calidad de las mismas. Además puede emplearse para
determinar la procedencia botánica de la miel, particularmente para distinguir entre
miel floral y miel de mielada.
La conductividad se mide mediante instrumentos comerciales de lectura directa de

µS/cm a una dada temperatura (generalmente 20 o 25°C) con un ε < 1%.
Se puede realizar la determinación mediante una celda adecuada y un dispositivo

puente de Wheatstone o similar, para lo cual se debe calcular la constante de
conductividad de la celda con una solución de KCl 0,01 M.
Determinación de la constante de la celda.
Solución de KCl 0,01M: Disolver 745,6 mg de KCl en agua bidestilada y diluir a 1 L.
Se coloca la solución de KCl, previamente diluída 1:10, en un vaso de precipitados.

Sumergir en esta solución un termómetro y los electrodos de conductividad
(previamente enjuagados en la solución de KCl diluída). Leer el valor de la
conductancia eléctrica en µS o mS. Para evitar que los resultados de la medición se
desvirtúen a causa de fenómenos de polarización, el proceso de medición debe ser
rápido.
La constante de la celda K se calcula con la siguiente fórmula:
K = 1,278
GKCl
K = constante de la celda en cm--1.

GKCl = conductancia en mS (lectura del conductivímetro).
1,278 = conductancia teórica de la solución de KCl 0,01 M a 20ºC en mS*cm-
1
.
Luego de cada lectura enjuagar el electrodo con agua destilada y para evitar el
envejecimiento del platinado, se guarda en agua destilada mientras no se use.
Determinación de la conductividad específica
Medir el contenido de agua de la muestra de miel con el refractómetro. Preparar 100

ml de las siguientes soluciones de miel, expresadas en % base seca: 5, 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80 y 90.
Colocar en un vaso de precipitados un volumen de solución de miel tal que cubra los
electrodos. Con el resto de la solución enjuagar cuidadosamente los electrodos de
conductividad y colocarlos en la solución. Leer el valor de la conductancia de la
solución a 20 ºC en mS o µS.
La conductividad específica (k) de la solución es:

32
k=K*G
k = conductividad específica en mS/cm o µS/cm.

K = constante de la celda.
G = lectura del conductivímetro en mS o µS.
Graficar k en función del % de miel en base seca.
Determinación de pH.
Se determinará el pH de las soluciones de miel preparadas para medir

conductividad. Para ello se utilizará un pHímetro calibrado con buffers a pH 4 y 7.
Graficar pH en función del % de miel en base seca.
Informe. Observar y analizar las diferencias de comportamiento entre las mieles de

distinto origen y explicar los gráficos obtenidos en función del contenido de agua.

33
Trabajo Práctico No. 8
Intermediarios y productos de reacciones de deterioro: Maillard y oxidación de

lípidos
1) Reacción de Maillard. Determinación de la cinética de formación de

fluorescencia y de absorbancia en el espectro visible.
La incubación de proteínas o aminoácidos con glucosa lleva a la formación de

productos de glicosilación a través de la reacción de Maillard. Productos
intermediarios de esta reacción compleja se caracterizan por su fluorescencia y con
el tiempo llevan a la formación de pigmentos pardos y/o formación de
entrecruzamientos.
La composición del medio (pH, presencia de sales) y de factores ambientales
(temperatura, humedad a la que el producto está expuesto) determinan la cinética de
las reacciones.
Objetivos: determinación de las características y cinética de generación de

compuestos fluorescentes y pigmentos marrones (productos finales) provenientes de
la reacción de Maillard. Selección de los intermediarios adecuados para la
determinación del avance de la reacción.
Preparación de las soluciones modelo:

Preparar soluciones de glucosa - glicina (1:1) en buffer fosfato 0,1M de pHs 5 y 7.
Colocar 4 ml de sistemas en frascos y taparlos adecuadamente. Incubar a 45 y
70ºC. A intervalos de tiempo adecuados, retirar 2 frascos y medir la absorbancia a
420 nm y la fluorescencia (excitación a 347 nm y emisión a 415 nm).
Informe:
* Caracterizar los espectros de fluorescencia y absorbancia de los sistemas
previamente tratados en condiciones (tiempo, temperatura) en las que se desarrolló
la reacción de Maillard.
* Determinar la cinética de cambios de pH, desarrollo de fluorescencia y absorbancia
en dichos sistemas previo almacenamiento a temperaturas entre 45 y 70°C.
* Observar las curvas típicas de intermediarios y productos.
2) Reacción de oxidación de lípidos.
Determinación de la absorbancia a 234 nm (dienos) y a 268 nm (trienos), y de la

concentración de hexanal (producto secundario).
Se emplean diferentes métodos para monitorear la oxidación de aceites y alimentos
lipídicos: índice de peróxido, disminución de O2, medición a dos longitudes de onda,
compuestos volátiles, etc.
El análisis de compuestos volátiles, producidos por la oxidación de lípidos, es un
buen indicador para evaluar la estabilidad y el flavor en alimentos. Algunos de los
compuestos volátiles que se forman y más empleados para el seguimiento de la
oxidación son: hexanal, pentano, 2-heptenal, octanal, nonanal.

34
Se envasan las muestras correspondientes (según lo indicado por los docentes,
estas pueden ser: aceite de soja comercial, papa y/o tomate deshidratados), y se
sellan herméticamente. Se realiza un tratamiento térmico a 70ºC, o se almacenan a
25°C a la luz y en oscuridad. A distintos intervalos de tiempo se retiran frascos,
sobre los cuales se determinarán hexanal por GC y la absorbancia a 234 y 268 nm.
Previo al análisis por CG, las muestras deben ser acondicionadas en un baño de
agua a 60ºC por 10 min.
Determinación de hexanal por la técnica de headspace:

Se toma 1 ml del espacio cabeza con una jeringa para headspace y se inyecta
directamente en el cromatógrafo gaseoso. Las condiciones de corrida son:
- T inyector = T detector (FID) = 250ºC

- Modo splitless
- Flujo = 1 ml / min
- Columna: SPB-1 (no polar)
- Programación de temperaturas: 50ºC, 0' 70ºC, 1' 200ºC, 10'
5ºC / min 35ºC/min
Se graficará área del pico de hexanal en función del tiempo de tratamiento térmico.
Determinación de absorbancia:
Hacer una dilución conveniente de la muestra con éter etílico y leer las absorbancias
a 234 y 268 nm. Graficar absorbancia (corregida por concentración) en función del
tiempo de tratamiento térmico.
Objetivos: determinar las características y cinética de generación de compuestos

secundarios (productos finales) provenientes de la oxidación de lípidos.
Informe:
* Determinar la cinética de formación de hexanal y absorbancia a dos longitudes de
onda en productos grasos previo almacenamiento a 70°C y distintos tiempos.
* Observar las curvas típicas de intermediarios y productos.
Decidir acerca de la sensibilidad de los distintos marcadores.


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TRABAJOS PRÁCTICOS

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Lista de Materiales para el Trabajo en el Laboratorio

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Empleo de métodos para la evaluación rápida de algunos parámetros de la

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Objetivo. El objeto de esta práctica es obtener conclusiones acerca de la calidad de

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sulfanilamida Sal de diazonio N-(1-naftil)-etilendiamina Compuesto diazoico

Método: tiras reactivas Merckoquant 10 007 (0-80 mg/ de NO2-)

Notas sobre la medición:

Los iones nitrato se reducen cuantitativamente a iones nitrito en presencia de

Método: Metodo colorimetrico Aquamerck 1.11170.0001 (10-150 mg/l NO3 –).

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La concentración de nitratos se determina semicuantitativamente por comparación

Notas sobre la medición:

Método: Aquaquant (Merck) 1.14420 (0.02-0.5 mg/l)

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

a) Toma de muestra 20 ml a cada tubo

b) Añadir Ni-1A, mezclar, dejar en

c) Añadir Ni-2A, mezclar 8 gotas al tubo interior

d) Añadir Ni-3A, mezclar 8 gotas al tubo interior

e) Medir Comparar al cabo de 3 minutos

Orientar el envase abierto de tal modo

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Método: Merckoquant 10077 tiras reactivas o varillas analíticas (20-500 mg/L). El

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Notas sobre la medición:

La determinación de cobalto tiene aplicación en el control de aguas residuales,

Método: Merckoquant 10002. Varillas analíticas para la identificación y la

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Notas sobre la medición:

Su determinación es importante en la inspección de aguas efluentes de

Método: Varillas Chromat-test 10012 (3-100 mg/L).

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

1. Lavar la probeta con la muestra y llenarla hasta el enrase (5 ml).

Notas sobre la medición:

Debido a su poder oxidante los peróxidos se emplean en la industria como

Método: Merckoquant 1.10011 varillas analíticas de 0.5-25 mg/l de H2O2.

Muestras: Se utilizarán muestras de agua de diferentes fuentes.

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Notas sobre la medición:

El formaldehído se utiliza como desinfectante de superficies, intercambiadores,

Método: Merckoquant 10036 varillas analíticas de 10 - 100 mg/l.

+ Tetrazina rojo púrpura

Muestras: Se utilizarán muestras de agua de diferentes fuentes.

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Notas sobre la medición:

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Trabajo Práctico No2

Comparación de la sensibilidad en la determinación de un componente en

1. Determinación de ácido sórbico por espectroscopía UV y de su derivado

(a) Construcción de la curva de calibración para el ácido sórbico.

Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solución de ácido sórbico estándar (C: 1000 ppm) y

(b) Determinación de la concentración de ácido sórbico en vino (método directo).

Tomar 2 ml de vino y colocarlos en un balón de destilación. Lavar la pipeta con 2-3

Tomar 2 ml del destilado y colocar en un matraz aforado de 10 ml. Llevar a volumen

(c) Construcción de la curva de calibración para la colorimetría del ácido sórbico.

Fundamento del método

El ácido sórbico reacciona con K2Cr2O7 en presencia de H2SO4 para dar un

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solución de ácido sórbico estándar (C: 1000 ppm) y

(d) Determinación de la concentración de ácido sórbico en vino (método indirecto).