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RESUMEN
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido el reconocimiento del ADN como la molcula de la
vida. El estudio de sus propiedades fisicoqumicas y biolgicas ha desarrollado, en menos de 50 aos, un enfoque
totalmente novedoso en lo referente al origen, flujo y almacenamiento de la informacin gentica en todo ser
vivo. Debido a que en el ADN se encuentran cifradas las instrucciones que definen las caractersticas propias de
cada organismo, diversas tecnologas y sistemas de anlisis se han desarrollado para la caracterizacin de esta
molcula. Los resultados de tales estudios demuestran que caractersticas como la resistencia a enfermedades,
potencialidades de produccin, tamao y color de los frutos, entre otros, son debidas a la expresin de la informacin
gentica y su interaccin con el medio ambiente. La aplicacin de este conocimiento se ha convertido en una
herramienta fundamental en programas de mejoramiento gentico. Por lo tanto, en la presente revisin se presentan
conceptos bsicos y explicaciones de los mtodos utilizados para la extraccin de esa informacin gentica
empleando, como ejemplo, el protocolo usado para el aislamiento de ADN de palma de aceite (Elaeis guineensis
Jacq.). Se espera que esta revisin sea el comienzo de una serie de artculos en los que se ver el vertiginoso
desarrollo de la gentica y la biotecnologa en los ltimos aos y la importancia de aplicar las tcnicas moleculares
en palma de aceite.
SUMMARY
One of the most important contributions to biology has been the recognition of the DNA as the lifes molecule.
The study of its physicochemical and biological properties has developed, in less than 50 years, a complete differ-
ent approach in relation to the origin, flux, and storage of genetic information in all known living-forms. Because
inside the DNA molecule are ciphered the instructions that define all the characteristics of any organism, several
technologies and systems of data analysis have been developed for the characterization of this molecule. The
results of such studies have demonstrated that characters such as resistance against diseases, productivity poten-
tial, size and colour of fruits are due to the expression of genetic information and its interaction with the environ-
ment. Nowadays, the use of this knowledge is a fundamental tool in breeding programms. In this review, some
basic concepts and explanations about methods currently used for DNA extraction, in particular the protocol used
for oil palm, are presented. This review will be the starting point of a series of papers related with the importance
of applying molecular techniques in oil palm.
1 PhD. Investigador Titular. Laboratorio de Marcadores Moleculares, rea de Fisiologa y Mejoramiento. Cenipalma.
Calle 21 No. 42C-47, Bogot, Colombia. E-mail: pedro.rocha@cenipalma.org.
INTRODUCCIN
Las caractersticas fisiolgicas y
bioqumicas de todo ser vivo estn
contenidas en sus respectivos
genomas (ver glosario). Los geno-
mas de bacterias, hongos, plantas,
animales y algunos virus estn
compuestos por molculas de cido
desoxirribonuclico (comnmente
llamado ADN). El ADN es una
estructura qumica cuyos elemen-
tos fundamentales (nucletidos) se
organizan de manera lineal
generando enormes secuencias de
informacin (Fig. 1, Tabla 1). La
informacin que define y codifica
un carcter determinado se
denomina gen (Lewin 1995). Los
genes se organizan linealmente y
se agrupan formando estructuras
llamadas cromosomas, los cuales
pueden ser vistos bajo el micros-
copio durante ciertas etapas del
ciclo de vida de la clula.
Tabla 1. Variacin del tamao del genoma para algunos genomas vegetales. (basado en Bennet y Leitch 2001).
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Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de aceite
fenotipo son transmitidos de padres a hijos y junto permitido generar y analizar mltiples puntos de
con la biologa molecular han desarrollado tcnicas informacin independientemente de su
de anlisis de poblaciones y de individuos que funcionalidad. Y es la integracin de las dos
permiten ubicar, caracterizar y explicar la he- disciplinas la que permite acelerar el proceso de
redabilidad de genes u otros fragmentos de ADN mejoramiento gentico de poblaciones e individuos
(Lewin 1995). por correlacin entre la informacin fenotpica y
la molecular.
La linealidad de la molcula de ADN y la con-
secuente disposicin de los genes en cromosomas A continuacin se describen algunas de las tcnicas
hacen posible que genes vecinos se hereden jun- empleadas para manipular el ADN de plantas. En
tos. Este hecho, junto con las herramientas la actualidad, la aplicacin de esas tcnicas es de
experimentales y de anlisis, han permitido generar especial inters para la exitosa ejecucin de
mapas, en los cuales cualquier fragmento de ADN programas de mejoramiento gentico.
(marcador molecular) puede ser utilizado como una
va indirecta para seguir el patrn de herencia de
una caracterstica. Los marcadores moleculares
establecen relaciones de vecindad con genes de
inters, determinando su localizacin dentro del
genoma del organismo estudiado. En Arabidopsis
thaliana, la primera planta cuyo genoma fue
secuenciado completamente, existen alrededor de
25.500 genes (The Arabidopsis Genome Initative
2000). Cada uno de ellos vara en longitud,
teniendo la mayora de ellos entre 500 hasta varios
miles de nucletidos. Sin embargo, con base en la
informacin obtenida para A. thaliana y las
estimaciones para otras plantas, se calcula que slo
del 15 al 30% del genoma contiene secuencias
codificantes (genes). El restante 85 a 70% se
distribuye en secuencias reguladoras indispensables
para la expresin de los genes y en secuencias
repetidas que varan entre una y miles de copias
por clula (The Arabidopsis Genome Initative 2000).
Estas secuencias repetidas se pueden encontrar
agrupadas en regiones particulares del cromosoma
(centrmeros y telmeros) o dispersas a lo largo Figura 2. Esquema paraseguir el comportamiento de una
del genoma (Flavell y Twell 1996). A la de- caracterstica (gen responsable del color) en una
poblacin hipottica. Una planta femenina que
terminacin de la posicin de genes particulares,
expresa el color (gen dominante) se cruza con
secuencias reguladoras y repetidas dentro del una planta masculina que no lo exhibe (gen
genoma se le denomina mapeo gentico. recesivo). El resultado del cruce es una
descendencia en la que todas las plantas de esa
Para mapear genes, es decir, para determinar la primera generacin filial (F1) presentan color. Si
ubicacin de una caracterstica (gen) en el genoma, se cruzan dos miembros de esta descendencia se
genera una poblacin (F2), en la cual se puede
se hace necesario realizar cruzamientos y analizar
apreciar que tres de las cuatro individuos posee
sus progenies con procedimientos estadsticos color y uno no. Este modelo de herencia de
relativamente sencillos (Fig. 2). El fitomejoramiento genesha sido observado para muchas
tradicional ha dado las herramientas conceptuales caractersticas. Es conocido como la ley de
para analizar la herencia de caracteres fenotpicos segregacin de caracteres y fue propuesta de J.G.
evidentes, tales como tamao, color, productividad, Mendel hacia 1865. La aplicacin de este
concepto permite predecir las proporicones
forma de frutos, etc. (Griffiths et al. 1993). Por su
esperadas para algunas caractersticas en
parte, el rea de marcadores moleculares ha cruzamientos particulares. (Lewin 1995).
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Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de aceite
Tabla 2. Algunos agentes contaminantes en preparaciones de ADN y alternativas para su extraccin (basado en
Sambrook et al. 2001; Taylor et al. 1993; Rogers y Bendich 1988).
Contaminante Tratamiento
mantener humedecido a temperatura am- 18. Aadir 0,5 ml de agua destilada estril y resus-
biente por no ms de tres das. Sin embargo, pender el botn de ADN agitando suavemente.
el tejido foliar se puede almacenar a 80C por 19. Aadir 0,1 ml de una solucin de ARNasa de
tiempo indefinido. 0,1 mg/ml. Incubar durante una hora a 37C.
2. Pulverizar el tejido con nitrgeno lquido. 20. Almacenar el ADN extrado a 4C si se va a
3. Aadir 8 ml de solucin de extraccin. Dicha utilizar en menos de tres das. Alterna-
solucin contiene: 150 mM de Tris-HCl, pH tivamente, el almacenamiento por largos
8,0; 15 mM de EDTA, pH 8,0; 1 M de cloruro perodos puede realizarse a 20C.
de sodio; 1% (peso/volumen) de CTAB; 1%
(peso/volumen) de PVP-3600 y 5% (volumen/ Con la aplicacin de este protocolo, se considera
volumen) de -mercaptoetanol. Las funciones una buena extraccin aquella que presenta niveles
de cada reactivo en la solucin se presentan muy bajos de agentes contaminantes y permite
en la Tabla 3. obtener alrededor de 80 mg de ADN por cada
4. Incubar a 65C en bao Mara durante 30 min. gramo de tejido foliar utilizado. Una muestra de
Mezclar el tubo delicadamente cada 10 ADN con estas caractersticas puede almacenarse
minutos. Este paso permite desnaturalizar (des- durante varios aos a bajas temperaturas sin perder
truir) las enzimas y dems protenas presentes sus caractersticas fsicoqumicas ni biolgicas.
en el tejido foliar pulverizado.
5. Centrifugar a 2.000 x g, durante 15 min. Este
paso remueve todos los residuos slidos de la VERIFICACIN DE LA CALIDAD Y
preparacin. LA CANTIDAD DE UNA
6. Transferir la fase acuosa superior (sobrena- PREPARACIN DE ADN
dante) a un tubo limpio y aadir medio
volumen (4 ml) de fenol. Agitar suavemente. El ADN que ha sido extrado de un tejido debe ser
En este paso se siguen destruyendo las cuantificado y su calidad verificada. El mtodo ms
protenas (debido a la presencia del fenol). empleado para la determinacin simultnea de
7. Centrifugar a 2.000 x g, durante 20 min. estas caractersticas es la electroforesis en gel de
8. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y agarosa (Fig. 3). Esta tcnica se fundamenta en la
aadir medio volumen (4 ml) de clo- migracin de las molculas de ADN, a travs de
roformo:octanol. una matriz gelatinosa, debida a la aplicacin de
9. Incubar la mezcla con agitacin, durante una un campo elctrico. La deteccin visual del ADN
hora, a temperatura ambiente. se lleva a cabo utilizando una sustancia sensible a
10. Centrifugar a 2.000 x g, durante 20 min. la luz ultravioleta, el bromuro de etidio (Sambrook
11. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y et al. 2002). Este compuesto es un agente carcino-
aadir 1/10 del volumen (aprox. 0,8 ml) de gnico que actua intercalndose dentro de la doble
acetato de sodio 3M, pH 5,2, fro (-20C) y 6/ hlice del ADN.
10 del volumen (aprox. 5 ml) de isopropanol
fro (-20C). La cuantificacin tambin se puede realizar
12. Incubar a 20C durante dos das. empleando un espectrofotmetro, el cual detecta
13. Despus de la incubacin, centrifugar a 2.000 la radiacin emitida por las bases nitrogenadas
x g, durante 30 min a temperatura ambiente. presentes en el ADN luego de ser excitadas con luz
14. Desechar el lquido teniendo cuidado de no de 260 nm. De igual manera se puede emplear un
perturbar el botn de ADN que se forma al fluormetro, el cual cuantifica la emisin de
fondo del tubo. energa de los compuestos qumicos (fluorocromos)
15. Aadir 2 ml de etanol al 70%. Esto ayuda a que se intercalan dentro del ADN.
retirar las sales que se precipitaron junto con
el ADN.
16. Centrifugar a 2.000 x g, durante 3 min a tem- CONSIDERACIONES FINALES
peratura ambiente.
17. Dejar secar el botn de ADN a temperatura El desarrollo de la gentica y la biotecnologa ha
ambiente. sido vertiginoso en los ltimos aos y ha hecho
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Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de aceite
Tabla 3. Caractersticas y funciones de algunos de los reactivos empleados en la extraccin de ADN proveniente de
diversas fuentes vegetales (Sambrook et al., 2001).
Tris (hidroximetil amino metano) Tampn biolgico Estabiliza el pH de la solucin (entre 7,0 y 8,0)
EDTA (cido etilendiamintetractico) Agente quelante Atrapa los iones magnesio presentes en el medio
para evitar la accin de enzimas que degradan al
ADN.
Figura 3. Electroforegramas de preparaciones de ADN proveniente de diversas palmas de aceite. Se muestran geles de
agarosa al 0,8%, teidos con bromuro de etidio. (A) ADN de buena calidad. (B) ADN con impurezas. (C) ADN
con presencia de ARN contaminante. (D) ADN degradado por accin mecnica o presencia de ADNasas.
Registros tomados del centro de documentacin de geles del Laboratorio de Marcadores Moleculares de
Cenipalma.
de las tcnicas que permiten obtener la informacin DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J.; HICKS, J.B. 1983. A plant
cifrada en esta molcula. DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Bio-
logy Reporter (Estados Unidos) v.1 no.14, p.19-21.
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Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de aceite
GLOSARIO
Gen: Es un fragmento de ADN que codifica para una caracterstica determinada. En otros
trminos, es la unidad fsica y funcional de la herencia pasada directamente de los padres a
su descendencia. Por ejemplo, caractersticas tales como color, altura y forma estn codificadas
por uno o ms genes.
Genoma: Es la dotacin gentica completa de cada ser vivo. En otros trminos, es la coleccin
de informacin hereditaria que un individuo ha recibido de sus progenitores.
Secuenciacin: Es una tcnica que permite conocer el orden de los nucletidos en una
molcula de ADN