Microbiologa Ambiental UAM J.

L Sanz

3. MTODOS EN MICROBIOLOGIA II. TCNICAS MICROSCPICAS. Microscopia ptica.

Caractersticas. Observacin de los microorganismos. Tinciones. Otras microscopas pticas.
Confocal. Microscopia electrnica: transmisin y barrido. Tamao, forma y agrupaciones
bacterianas.

MICROSCOPA PTICA.

El microscopio es un instrumento que permite ampliar el tamao de la imagen aparente de los

objetos, lo que hace posible ver detalles estructurales de los microorganismos. El microscopio
ptico normal es un microscopio compuesto que consta de una fuente luminosa, una lente
condensadora de la luz y dos juegos de lentes (oculares y objetivos) que permiten la
ampliacin de la imagen. Caractersticas:
- Amplificacin. Producto del aumento individual de los oculares y los objetivos.
- Resolucin. Espacio de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an pueden
observarse stos como entidades separadas. Determina la mxima amplificacin til del
microscopio.

El poder de resolucin depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de la abertura

numrica de las lentes: d= 0.61 /AN
AN = x sen /2
: ndice de refraccin
: ngulo con que los rayos de luz (ms oblicuos) entran en el objetivo
Ejercicio: calcular el poder de resolucin de un microscopio ptico en las mejores condiciones
posibles. El aumento til viene a ser 1000xAN. Cul es el mximo terico?.

Observaciones de los microorganismos

Dos posibilidades:
"In vivo" (v.g. gota pendiente). Indicada para observar movimiento, inclusiones,
morfologa,..
Con tincin. Aumenta el contraste entre el objeto a observar y el medio acuoso que lo
rodea.
Tincin simple. Utiliza un solo colorante. Se basa en la carga negativa asociada a la
capa externa de la clula bacteriana.
Tincin diferencial. Ciertos microorganismos y/o estructuras celulares poseen diferente
afinidad por determinados colorantes. La ms empleada es la tincin de Gram
(descripcin, fundamento). Otras tinciones diferenciales: Ziehl-Neelsen (cido-alcohol
resistentes); Giemsa (para rickettsias); para estructuras celulares (v.g.esporas),..

OTRAS MICROSCOPAS PTICAS

Contraste de fases.
Se basa en que las clulas tienen un ndice de refraccin ms elevado que el medio, lo que
implica un retardo en la que las atraviesa y una alteracin en la fase de la luz. El contorno
celular se observa con gran nitidez. Muy bueno para observaciones in vivo, flagelos, ...
De interferencia.
El fundamento es similar al de contraste de fases. El microscopio de interferencia ms
empleado es el microscopio de contraste diferencial de Nomarski. Es muy til para
observaciones de cl. sin teir pues produce imgenes de alto contraste y gran relieve
topogrfico (casi tridimensionales).
De campo oscuro.
El condensador normal es reemplazado por un condensador de campo negro que no
permite transmitir la luz directamente a travs del espcimen hacia el objetivo. Contraste
excelente.
 Microbiologa Ambiental UAM J. L Sanz

De fluorescencia.
Utiliza luz de una longitud de onda tal que es capaz de excitar alguna substancia a
fluorecer (emite luz de diferente). Se utiliza para:
- microorganismos que tienen fluorescencia natural: metanobacterias (P420)
- tinciones especiales: FISH, inmunofluorescencia
De luz ultravioleta.
Tiene un poder de resolucin mayor, pues la longitud de onda de la luz UV es menor que
la de la luz visible ( =200nm --> R=0.1).
Inconvenientes:
- no se observa directamente, si no por fotografas
- utiliza lentes de cuarzo, que son muy caras.

Microscopa laser confocal.

El microscopio ptico convencional tiene una, relativamente hablando, gran profundidad de

campo. Esto hace que la imagen sea difusa, turbia, abigarrada, ... El CLSM (Confocal
scanning laser microscopy) utiliza una luz lser que incide sobre un nico punto del
espcimen y hace un barrido del mismo, formando una imagen ptica. Si diferentes planos-
secciones del objeto son escaneados, la reconstruccin de las diferentes imgenes pticas
origina una imagen tridimensional. Los especimenes a estudiar estn teidos con una sonda
fluorescente y las imgenes tienen excelente contraste y resolucin. Es el complemento
ideal de la tcnica denominada Hibridacin in situ con sondas florescentes (FISH), la
tcnica ms potente en la actualidad para hacer ecologa molecular microbiana.

MICROSCOPA ELECTRNICA

Hay dos tipos bsicos:

De transmisin.
Similar al del microscopio ptico compuesto, sustituyendo la fuente luminosa por un haz
electrnico y las lentes por una serie de electroimanes. La fuente de e- es un filamento de
tungsteno caliente, siendo los e- acelerados como un fino haz mediante un alto voltaje
entre el filamento y el nodo. El haz se enfoca mediante una lente electromagntica. El
can por el que atraviesan los e- est al vaco.
Debido a que la asociada a los e- es muy corta se consigue una ampliacin (105-106x) y
resolucin til ( terica de 0.2 nm) muy grande. Para aumentar el contraste en MET se
utilizan tinciones con sales de metales pesados de elevada densidad electrnica.
De barrido.
Utiliza un haz de e- muy fino que barre la superficie del espcimen. El haz electrnico
primario arranca e- de la superficie del espcimen y los e- secundarios son transmitidos a
un colector, amplificados y utilizados para formar una imagen en una pantalla de rayos
catdicos.
 Microbiologa Ambiental UAM J. L Sanz

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS: TAMAO Y FORMA Y AGRUPACIONES

BACTERIANAS

Tamao
Es muy variable. Tamaos medios: bacterias bacilares: 0.5-1 x 2-3 m; cocos: dimetro entre
0.75-1.25 m.

Forma
- esfrica u oval: cocos
- cilndrica o de bastn: bacilos
- coma: vibrio (bacilo curvo)
- espiral o helicoidal: espirilo (espiroqueta)
- formas "raras": de estrella, cuadradas, pleomrficas, etc.

Modelos de agrupacin
Los cocos se agrupan como:
- diplococos: se dividen en un plano y permanecen unidos
- estreptococos: se dividen en planos paralelos y quedan unidos formando cadenas
- estafilococos: se dividen en tres planos irregulares formando "racimos" de cocos
- sarcinas: se dividen en tres planos perpendiculares formando cubos.
Los bacilos no forman agrupaciones caractersticas, si bien a veces se presentan en cadenas
("estreptobacilos") o filamentos. Los actinomicetos presentan agrupaciones miceliares.