Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Manual de Bacteriología PDF
Manual de Bacteriología PDF
DIAGNoSTICA
Norman rojas
Esteban chaves
Fernando garca
2006
0
Bacteriologia Diagnostica
INDICE GENERAL
INDICE GENERAL.......................................................................................................... 1
ENTEROBACTERIACEAE........................................................................................... 22
VIBRIONACEAE........................................................................................................... 32
STAPHYLOCOCCUS ................................................................................................... 69
PROCESAMIENTO DE UROCULTIVOS...................................................................... 99
1
PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS................................................................. 126
2
Bacteriologa diagnstica Bioseguridad
I
NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA
MDICA.
1. Introduccin
Es importante considerar que existen cuatro elementos necesarios para que se inicie una
infeccin; un hospedero susceptible, un agente infeccioso, la concentracin de dicho agente
infeccioso (dosis infectante), y una ruta de transmisin. Esta ltima es la nica que puede ser
controlada por medio de normas de bioseguridad y por lo tanto es indispensable brindarle
especial atencin a las rutas ms comunes de transmisin; oral, respiratoria, percutnea y
contacto directo con la piel y/o las mucosas.
Toda muestra clnica; fluidos corporales, tejidos y cultivos microbianos deben ser
considerados como infecciosos para el personal de laboratorio y deben ser manipulados bajo
determinadas medidas de contencin, las cuales incluyen adecuadas prcticas microbiolgicas,
la utilizacin de barreras fsicas, un adecuado diseo de laboratorio y cmaras de bioseguridad.
El uso de vacunas seguras y eficaces puede proporcionar un mecanismo adicional para la
reduccin de las infecciones ocupacionales.
El concepto de grupo de riesgo fue desarrollado como una manera de clasificar los
diferentes tipos de microorganismos (bacterias, virus, hongos, parsitos) dependiendo del
grado de virulencia para el ser humano, animales y plantas. Se han definido cuatro grupos de
riesgo de microorganismos, cuyas caractersticas se indican a continuacin:
3
Bacteriologa diagnstica Bioseguridad
3. Cmaras de bioseguridad
4
Bacteriologa diagnstica Bioseguridad
Las cmaras de bioseguridad clase II utilizan un flujo de aire no turbulento denominado flujo
laminar que evita tanto el escape de material infeccioso de la cmara como el ingreso de este
del cuarto hacia el interior de la misma.
4. Niveles de bioseguridad
Nivel de bioseguridad 1
En el nivel de bioseguridad 1 los microorganismos que pueden ser manipulados estn bien
definidos y caracterizados por tener una muy baja o ninguna virulencia para personas adultas
saludables y pertenecen al grupo de riesgo 1. El acceso a este laboratorio debe ser limitado o
restringido y las puertas y ventanas deben de permanecer cerradas, el mobiliario debe ser fcil
de lavar y desinfectar y tienen que estar disponibles lavamanos con jabn, desinfectante y
papel toalla. Todos los desechos generados que implican algn riesgo biolgico deben ser
autoclavados o incinerados.
5
Bacteriologa diagnstica Bioseguridad
Nivel de bioseguridad 2
En laboratorios del nivel de bioseguridad 2 es donde se efecta la mayor parte del trabajo
rutinario del laboratorio de bacteriologa clnica, incluyendo el manejo de muestras clnicas de
diversa ndole y la manipulacin de cultivos de microorganismos.
En este laboratorio debe estar disponible una autoclave para esterilizar todos los desechos
infecciosos y los procedimientos que involucren la generacin de aerosoles deben ser
efectuados en una cmara de bioseguridad clase II. Se deben utilizar guantes, anteojos
protectores y bozales cuando se manipulan muestras clnicas, cultivos microbianos o material
contaminado.
Se debe limitar al mximo el uso de agujas y jeringas y extremar los cuidados para
minimizar el riesgo de una autoinoculacin y de generacin de aerosoles. Todos los derrames
de material infecciosos y accidentes deben ser inmediatamente reportados al responsable del
laboratorio y al director del laboratorio clnico.
El director del laboratorio clnico, con el apoyo de los responsables de los diferentes
laboratorios a su cargo, es el responsable directo de establecer y/o aprobar todas las polticas y
los procedimientos para la operacin segura del laboratorio.
Nivel de bioseguridad 3
Los microorganismos que deben ser trabajados en el nivel de bioseguridad 3 son altamente
infecciosos, pueden causar graves infecciones sistmicas en seres humanos
inmunocompetentes e incluyen a Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetii y las especies
de Brucella.
Las ventanas deben ser selladas y las puertas deben tener un dispositivo para que se
cierren por s mismas. Debe tener un sistema de ventilacin diseado de tal manera que sea
unidireccional e ingrese al laboratorio por el rea de entrada.
Nivel de bioseguridad 4
6
Bacteriologa diagnstica Bioseguridad
Todo el personal debe utilizar siempre gabacha de manga larga hasta la altura de la rodilla y
cerrada, esta debe ser considerada como material contaminado, lavarse las manos
peridicamente; cada vez que entren en contacto con material infeccioso y siempre que se
haga abandono del rea del laboratorio. Se debe evitar tocarse, frotarse o rascarse mientras se
permanezca en el laboratorio.
Los desechos deben ser manejados en una forma racional, dependiendo del nivel de
bioseguridad del laboratorio, el tipo de material que constituye el desecho, el tipo de
tratamiento aplicado al desecho y la forma en que los desechos tratados son eliminados de la
institucin. Por convenio se utiliza el color amarillo para designar el desecho infeccioso del nivel
de bioseguridad 2, mientras que el color rojo se usa para designar el desecho infeccioso del
nivel de bioseguridad 3.
7
Bacteriologa diagnstica Bioseguridad
En el caso de desechos lquidos que han sido tratados se descartan directamente en los
sistemas de desage a un tanque de depuracin para seguir a los sistemas sanitarios
convencionales. Los desechos slidos procedentes de incineradores y autoclaves se deben
descartar en basureros de metal o plstico rgido, provisto de tapa para su posterior transporte
a rellenos sanitarios.
7. Bibliografa consultada.
8
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
II
NORMAS DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA MEDICA
1. Introduccin
Recoleccin de la muestra.
Preparacin del paciente.
Procedimiento de recoleccin.
Preparacin de la muestra.
Transporte de la muestra.
Mensajero (distancia & tiempo).
Procesamiento de la muestra.
Documentacin.
Evaluacin de la muestra.
Preparacin de frotis y cultivo.
Identificacin del microorganismo.
Pruebas de susceptibilidad a
antimicrobianos.
Reporte de laboratorio.
Llamada telefnica.
9
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
Se debe documentar igualmente si la muestra no cumple con los criterios de aceptacin del
laboratorio, las razones por las cuales la muestra fue rechazada y, en los casos
correspondientes, por qu la muestra fue analizada a pesar de no cumplir dichos criterios.
Los medios de cultivo pueden ser preparados a partir de ingredientes individuales o a partir
de medios deshidratados comerciales que deben ser almacenados correctamente, segn las
indicaciones del fabricante. Para el pesado de los medios de cultivo deshidratado se requiere
10
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
de balanzas granatarias ( 0.1 g) en perfecto estado. El agua para disolver los ingredientes o
los medios de cultivo deshidratados debe ser destilada o desionizada y ser medida en
cristalera en perfecto estado y completamente limpia.
Una vez disuelto el medio de cultivo se debe ajustar el pH si es necesario, ajustado el pH, el
medio de cultivo debe ser calentado en un mechero Bunsen o en una plantilla de gas para
disolver el agar agitando constantemente. Durante este calentamiento se produce evaporacin
del agua en el medio por lo que se recomienda agregar un volumen adicional de agua de
aproximadamente 5% del volumen del medio de cultivo.
Para el control de calidad se debe tomar en cuenta el aspecto general del medio preparado,
la nivelacin en la placa de Petri, la cantidad de agar (se recomienda aadir un volumen de 15-
20 ml de medio a las placas de Petri y a los tubos un volumen de 3-5 ml) y la proporcin
inclinado:fondo de los tubos.
Todas las tinciones deberan probarse a intervalos recomendados por su habilidad para
distinguir organismos positivos o negativos, y los resultados deberan documentarse. Se debe
revisar diariamente la apariencia de los reactivos, si las suspensiones han precipitado o se
observan cristales.
Al igual que todos los productos que se utilizan en pruebas qumicas y bioqumicas, los
reactivos de identificacin bacteriana, ya sean adquiridos mediante compra o preparados en el
laboratorio, deben estar claramente rotulados, conteniendo la siguiente informacin: la fecha en
que fueron abiertos por primera vez, la fecha de expiracin, concentracin y requerimientos de
almacenamiento. Para los reactivos preparados en el laboratorio, la etiqueta debe contener
adems; volumen preparado, fuente de origen, nmero de lote de la fuente y las iniciales de la
persona que los prepar.
Los productos utilizados para detectar metabolitos bacterianos deben ser probados con cepas
productoras y no productoras reconocidas. Los reactivos qumicos que pueden generar
reacciones similares no son aceptables en sustitucin de cepas bacterianas apropiadas. Los
registros deben reflejar los resultados de estas pruebas de control de calidad al grado necesario
para determinar la conveniencia de los productos para su uso en el laboratorio. Las siguientes son
observaciones y recomendaciones acerca de las pruebas especficas.
11
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
Proskauer. Debido a la naturaleza sutil de la reaccin, tanto el medio como los reactivos deben
ser cuidadosamente controlados.
La adicin del indicador rojo de metilo debe hacerse lentamente sobre el caldo incubado por 48
h, no debe agitarse y se debe leer inmediatamente. Si el indicador se mantiene rojo brillante la
prueba es positiva, el color rojizo-naranja indica una prueba dudosa, y el color amarillo una
prueba negativa. En caso de pruebas dudosas, debe repetirse el procedimiento completo.
Prueba de Voges-Proskauer.
Esta prueba mide la capacidad de las bacterias de producir acetilmetilcarbinol y otros productos
neutros a partir de glucosa por vas fermentativas. Estas sustancias producen un color rosa
intenso a rojo en medio bsico y con alta aeracin, por lo que es importante la agitacin
vigorosa despus de agregar en orden los reactivos.
La modificacin de Coblentz o de OMeara incluyen 0.3% de creatina en la solucin de KOH, lo
cual intensifica el color formado, pero disminuye la estabilidad del reactivo.
Prueba de catalasa.
Para esta prueba se utiliza perxido de hidrgeno al 3%, el cual debe almacenarse en
refrigeracin a 4C y en botella mbar. Los eritrocitos poseen actividad de catalasa por lo que
su presencia pueden ocasionar falsos positivos, pero tambin se puede utilizar sangre como
control positivo del reactivo, en ausencia de una cepa de Staphylococcus. Esta prueba se
puede realizar en lmina, en placa o en agar inclinado.
Prueba de coagulasa.
Esta prueba se puede realizar en lmina o en tubo y se debe usar plasma fresco de conejo o
de sangre humana no citratada. Debe utilizarse siempre un control positivo y uno negativo con
cada corrida de pruebas en paralelo. La mayora de cepas coagulasa-positiva producen un
cogulo en las primeras 4 horas. Los falsos positivos pueden ocurrir con cultivos mixtos o con
cepas de Pseudomonas spp., pero su mecanismo de coagulacin es diferente.
Se debe tener presente que el medio de cultivo que se est usando est libre de sal para evitar
falsos positivos por autoaglutinacin.
El plasma debe someterse a un control de esterilidad mediante la incubacin por 24 horas a
35C.
12
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
Para el control de coagulacin se agrega una gota de solucin de cloruro de calcio al 5% a 0.5
ml de plasma, el cual debe coagular en un perodo de un minuto. Este tipo de control se debe
realizar con cada lote de plasma y cada vez que se realice la prueba.
Si se utiliza plasma citratado se debe agregar 5 U heparina/ml para eliminar falsos positivos, ya
que microorganismos que utilizan citrato causan coagulacin del plasma al consumirlo.
Si el cultivo a probar tiene ms de 24 horas o es escaso se puede obtener una prueba positiva
dbil.
El plasma se puede congelar a 20C para as tener un stock disponible. Asimismo, las casas
comerciales ofrecen al mercado plasmas liofilizados lo que facilita su almacenamiento.
Prueba de Oxidasa.
Esta prueba detecta la presencia de la enzima citocromo C oxidasa, y se utiliza en la
identificacin presuntiva de especies de Neisseria, en la caracterizacin inicial de bacilos Gram-
negativos y en la diferenciacin de estafilococos y micrococos.
Los procedimientos incluyen desde inundar las placas de agar (con colonias sospechosas de
Neisseria) con el reactivo, hasta la prueba rpida en papel.
Los reactivos de oxidasa se pueden preparar a partir del sustrato en polvo o en pastillas, o bien
pueden estar impregnados en un soporte inerte, listo para usar.
El reactivo de oxidasa de Kovacs para Gram-negativos (0.5 a 1% de dihidrocloruro de
tetrametil-p-fenildiamina en agua destilada) debe prepararse el da que se va a utilizar, mientras
que el reactivo para cocos Gram-positivos (6% TMPD en dimetilsulfxido) es estable a
temperatura ambiente por varias semanas.
Discos de Bacitracina.
Los discos impregnados con 0.04 unidades de Bacitracina son utilizados en la diferenciacin
presuntiva de Streptococcus beta hemolticos del grupo A de Lancefield (susceptibles) de otros
Streptococcus beta hemolticos. Tambin son tiles en la diferenciacin de los gneros de
Micrococcus (sensibles, con un halo generalmente mayor a 10 mm) y Staphylococcus sp.
(resistentes).
En el caso de los estreptococos debe utilizarse un inculo denso en el agar sangre para tener
un buen crecimiento de la bacteria. En el caso de estafilococos la prueba se realiza sobre una
placa de agar Mueller-Hinton, de forma similar a la pruebas de difusin en agar para
susceptibilidad a antibiticos.
Un 10 a 20% de los estreptococos de los grupos C y G son susceptibles a bacitracina.
Algunos Streptococcus alfa hemolticos pueden resultar sensibles por lo que no se debe
confundir la hemlisis.
Los discos deben mantenerse a 4C hasta su fecha de vencimiento.
Discos de Optochin.
Estos discos se utilizan para la diferenciacin del Streptococcus pneumoniae de otros
estreptococos alfa-hemolticos. Los resultados que pueden presentarse son los siguientes:
Si se usan discos de 6 mm el halo de inhibicin debe tener un dimetro mnimo de 14 mm y los
discos de 10 mm este halo debe tener un dimetro mnimo de 16 mm.
La incubacin debe hacerse a 35C en una atmsfera enriquecida con CO2. Los estreptococos
no crecen tan bien en atmsfera normal, por lo que se pueden presentar halos ms grandes.
Estos discos deben guardarse a 4C, realizando un control de calidad con cada lote y una vez
por semana. Los discos se eliminarn cuando los controles no cumplan los requisitos
establecidos o cuando la fecha de vencimiento as lo indique.
13
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
Los tests serolgicos son herramientas valiosas para identificar agentes patognicos de
inters clnico. Estas pruebas se utilizan para identificar y tipificar serolgicamente
microorganismos, demostrar la presencia de anticuerpos en suero y cuantificar la cantidad de
anticuerpos presentes. Existe una gran variedad de antisueros para identificacin de bacterias de
importancia clnica, tales como E. coli, Haemophilus influenzae, Brucella, Corynebacterium
dipthteriae, Listeria, Neisseria, Pseudomonas aeruginosa, Leptospira, Streptococcus spp.
Staphylococcus spp., Salmonella H, Salmonella O, Shigella, y Vibrio cholerae. Las principales
presentaciones de estos antisueros son como pruebas de aglutinacin de partculas y como
tcnicas con anticuerpos marcados, principalmente con fluorocromos o enzimas. En el caso de los
anticuerpos marcados, algunos procedimientos permiten la deteccin presuntiva del agente en
muestras clnicas, adems de la confirmacin inicial de cultivos sospechosos. Estas pruebas
complementan, no sustituyen, a las tcnicas bacteriolgicas convencionales.
Para llevar a cabo el mejoramiento y control de calidad de los equipos del laboratorio se
debe contar con una gua general, protocolizada, que incluya:
14
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
Incubadora
Una incubadora es una cabina o un cuarto aislado con estantes ajustables que mantiene
una temperatura constante, usualmente arriba de la temperatura ambiente. El aparato ms
simple consiste de un elemento productor de calor y un termostato que mantiene la
temperatura seleccionada. Los ms complejos tienen control automtico de temperatura,
indicadores de temperatura, CO2, humedad y alarmas para variaciones de los parmetros
ptimos. Como mnimo se recomienda una incubadora con dos termostatos (regulador y de
seguridad), para evitar que si falla el termostato regulador se produzcan aumentos
incontrolados de temperatura.
En el laboratorio de microbiologa la incubadora se utiliza para el crecimiento de
microorganismos a una temperatura constante y apropiada. Al menos dos incubadoras son
necesarias en un laboratorio de rutina de microbiologa clnica, una a 35C y otra a 42C. La
temperatura de 35C se usa para la mayora de cultivos bacteriolgicos, las pruebas de
susceptibilidad a antimicrobianos, algunas reacciones bioqumicas, kits de identificacin (p.
ej. API20E), tinciones fluorescentes y ensayos inmunoenzimticos (ELISAs), mientras que la
de 42C se necesita para el aislamiento de Campylobacter sp. y para la prueba de
crecimiento a 42C de Pseudomonas. Algunos kits de identificacin de levaduras y bacterias
no fermentadoras requieren de incubacin a 30C.
En un laboratorio de microbiologa clnica se debera tener al menos una incubadora que
ofrezca la condiciones necesarias para la recuperacin de microorganismos patgenos
fastidiosos como por ejemplo Neisseria gonorrhoeae, este aparato debe indicar la
temperatura, atmsfera de CO2 y humedad relativa, las cuales deben ser de 35C con un
40-50% de humedad y una atmsfera de CO2 de 5 a 7 %.
No se debe dejar la puerta de la incubadora abierta ms all de lo necesario, o bien, la
temperatura no debe caer ms de 5C cuando se tenga abierta.
15
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
La incubadora debe colocarse en un lugar bien nivelado, con suficiente espacio a cada lado
para permitir que las puertas abran completamente y que el aire circule alrededor del
aparato.
La conexin elctrica debe estar conectada a tierra y a una fuente de poder de emergencia.
No usar extensiones elctricas.
La incubadora debe colocarse lejos de radiadores, aparatos de aire acondicionado y
corrientes de aire. La temperatura ambiente debe ser al menos 5C por debajo de la
temperatura deseada del aparato para su operacin eficiente.
Llenar una bandeja con aproximadamente 1 litro de agua con un agente antimicrobiano
(p.ej. cristal violeta o un antifngico) y colocarla en el incubador para generar humedad.
Permitir al menos 3 cm de espacio entre los objetos (pilas de placas, botellas, etc.) dentro de
la incubadora. Para evitar derrames, no apilar ms de cinco placas de Petri a menos que
estn sujetas de alguna manera.
Leer y registrar diariamente la temperatura y los niveles de CO2.
Cada tres das hacer subcultivos de Neisseria gonorrhoeae y revisar su crecimiento para
incubadoras a 35C y hacer subcultivos de Campylobacter jejuni y revisar su crecimiento
para incubadoras a 42C.
16
Bacteriologa diagnstica Control de Calidad
Debe ser claro para los administradores y para todo el personal del laboratorio que el
anlisis de las muestras enviadas para el programa de control de calidad externo deben ser
analizadas exactamente en la misma forma que se analiza una muestra clnica de rutina,
incluyendo los procedimientos de anlisis y el personal que analiza la muestra, y no deben
merecer atenciones especiales. Dentro de los parmetros que son evaluados se incluyen:
9. Bibliografa consultada.
17
Bacteriologa Diagnstica Aspectos bsicos
III
ASPECTOS BASICOS EN BACTERIOLOGIA
1. Introduccin
Zona para
Zona para el frotis
identificacin
El frotis debe ser delgado, translcido y homogneo para que, durante el proceso de tincin,
reciba en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias qumicas y se
debe usar para la preparacin la tcnica asptica. Las muestras clnicas no deben ser diluidas
con agua o con algn otro diluente para la preparacin del frotis y si la muestra contiene mucho
material se reduce la cantidad de muestra o se aumenta la zona del frotis.
La preparacin se debe secar al aire antes de fijarla a la llama y al fijarla se debe tener
cuidado de no calentar demasiado porque se alteran las caractersticas tintoriales del material
contenido en la muestra, igualmente se debe permitir que la lmina se enfre antes de hacer la
tincin.
Alternativamente los frotis se pueden fijar utilizado metanol. Para ello, se coloca la lmina
sobre una superficie nivelada. Con cuidado se cubre el frotis completamente con metanol
absoluto y se deja secar al aire hasta que el metanol se haya evaporado.
3. Tincin de gram
La tincin de Gram es muy importante en el trabajo de laboratorio de Bacteriologa
Mdica. El frotis de una muestra clnica teida al Gram es el primer paso en el diagnstico de
una infeccin bacteriana.
18
Bacteriologa Diagnstica Aspectos bsicos
4. Rayado de placas
2
1
5. Cronograma de actividades
DIA 1
Entrega de cultivo mixto de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Entrega de muestra de heces.
Recoleccin de muestra de orofaringe (dos hisopados: uno para frotis y el otro para cultivo).
A partir del cultivo mixto y de cada una de las muestras realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica observada en cada una de las muestras.
Sembrar el cultivo mixto y cada una de las muestras por rayado, con el objeto de aislar al
menos 25-30 colonias, en placas de: agar Sangre, agar MacConkey y agar Manitol Sal
Incubar las placas a 35 oC por 24 horas. Las placas de Agar Sangre deben ser colocadas
en jarras con candela para crear una atmsfera capnoflica.
DIA 2
Describir la morfologa colonial de cada bacteria en los medios sembrados y considerando
los siguientes aspectos:
A partir de cada uno de los diferentes morfotipos coloniales observados en los distintos
medios preparar un frotis y teirlo por Gram. Hacer la correspondiente observacin de la
morfologa microscpica.
Inocular aquellos morfotipos coloniales que correlacionen con una morfologa microscpica
de bacilos Gram-negativos en Agar TSI inclinado utilizando el asa en punta. Inocular el
medio hasta el fondo del tubo y luego en el inclinado. Sustituir el tapn de hule del tubo con
el agar TSI por papel aluminio e incubar a 35oC por 24 horas.
DIA 3
Realizar la lectura del TSI.
6. Discusin de resultados
3. Cul es el fundamento metablico que explica el hecho de que algunas bacterias sean
capnoflicas (requieren una atmsfera con una concentracin aumentada [5-10%] de CO2)?
20
Bacteriologa Diagnstica Aspectos bsicos
5. Cmo se evidencia la selectividad de los medios con respecto a las muestras analizadas?
21
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
IV
ENTEROBACTERIACEAE
Agar Hektoen. Se usa en el aislamiento de Shigella spp. y de Salmonella spp., las cuales
presentan colonias verdes y colonias azul-verdoso con o sin centro negro, respectivamente.
Los dems coliformes presentan colonias rosado-salmn. Algunas especies de Proteus
pueden ser semejantes a Salmonella o a Shigella.
22
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
Agar TSI. Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos Gram
negativos de fermentar carbohidratos, producir H2S y producir gas.
Prueba de orto-nitrofenil--galactopiransido (ONPG). Esta prueba detecta la produccin
de la enzima -galactosidasa y permite diferenciar organismos de lenta utilizacin de la
lactosa de aquellos que no la utilizan. La enzima -galactosidasa es codificada por el gen
lacZ del opern lactosa, el cual es inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa.
Por lo tanto, se requiere que las bacterias hayan sido crecidas en un medio con lactosa
como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
Prueba de movilidad. Para determinar la movilidad de los bacilos fermentadores.
Prueba de gelatinasa. Determina la produccin de la enzima gelatinasa, la cual produce la
hidrlisis de la gelatina.
Prueba de rojo de metilo (RM). Identifica especies de bacterias que producen cidos
fuertes a partir de glucosa.
Prueba de Voges-Proskauer (VP). Esta prueba detecta la produccin de acetil-
metilcarbinol (acetona), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2
atmosfrico. El diacetilo es convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de
- naftol y creatina. La produccin de acetona es una va alternativa del metabolismo del
cido pirvico, donde se producen cantidades pequeas de cidos mixtos que pueden ser
insuficientes para dar una prueba de RM positiva. Por este motivo, la mayora de las
especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y viceversa.
Prueba de fenilalanina desaminasa. La determinacin de la enzima fenilalanina
desaminasa es til en la diferenciacin inicial de especies de: Proteus, Morganella y
Providencia de otros bacilos Gram negativos.
23
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
24
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
25
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
Cuadro 1. (continuacin)
Organismo Pruebas bioqumicas
IND RM VP CIT H2S URE FEN LIS ARG ORN MOV SOR LAC SAC MAN ADO ARA MAL MLN
TSI
Proteus
P. mirabilis 2 97 50 65 98 98 98 0 0 99 95 0 2 15 0 0 0 0 2
P. vulgaris 98 95 0 15 95 95 99 0 0 0 95 0 2 97 0 0 0 97 0
P. penneri 0 100 0 0 30 100 99 0 0 0 85 0 1 100 0 0 0 100 0
Providencia
P. rettgeri 99 93 0 95 0 98 98 0 0 0 94 1 5 15 100 100 0 2 0
P. stuartii 98 100 0 93 0 30 95 0 0 0 85 1 2 50 10 5 1 1 0
P. alcalifaciens 99 99 0 98 0 0 98 0 0 1 96 1 0 15 2 98 1 1 0
Salmonella
S. enterica6 1 100 0 95 95 1 0 98 70 97 95 95 1 1 100 0 99 97 0
S. typhi 0 100 0 0 97 0 0 98 3 0 97 99 1 0 100 0 0 97 0
S. choleraesuis 0 100 0 25 50 0 0 95 55 100 95 90 0 0 98 0 100 95 0
S. paratyphi A 0 100 0 0 10 0 0 0 15 95 95 95 0 0 100 0 100 95 0
Serratia
S. marcescens 1 20 98 98 0 15 0 99 0 99 97 99 2 99 99 40 0 96 3
S. liquefaciens 1 93 93 90 0 3 0 95 0 95 95 95 10 98 100 5 98 98 2
S. rubidae 0 20 100 95 0 2 0 55 0 0 85 1 100 99 100 99 1 99 94
Yersinia
Y enterocolitica 50 97 2 0 0 75 0 0 0 95 2 99 5 95 98 0 98 75 0
Y. pestis 0 80 0 0 0 5 0 0 0 0 0 50 0 0 97 0 100 80 0
Los valores indican el porcentaje de positividad de cepas para las diferentes pruebas o reacciones.
2
IND, indol; RM, rojo de metilo; VP, Voges-Proskauers; CIT, citrato; URE, urea; FEN, fenilalanina desaminasa; LIS, lisina descarboxilasa; ARG,
arginina dihidrolasa; ORN, ornitina descarboxilasa; MOV, movilidad; SOR, D-sorbitol; LAC, lactosa; SAC, sacarosa; MAN, D-manitol; ADO, D-
adonitol; ARA, L-arabinosa; MAL, maltosa; MLN, malonato.
3
Citrobacter koserii se le denominaba previamente C. diversus.
4
Enterobacter agglomerans se le denomina ahora Pantoea agglomerans.
5
Shigella dysenteriae (A), Shigella flexneri (B), Shigella boydii (C)
6
Salmonella enterica se considera como una nica especie con muchos serotipos y biotipos
26
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
Cuadro 6. Diferenciacin del gnero Proteus (TSI A/A o K/A, H2S+, mvil).
Especie Indol Ornitina Fermentacin de Maltosa
descarboxilasa
P. mirabilis 2 99 0
P. vulgaris 98 0 97
P. penneri 0 0 100
27
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
5. Cronograma de actividades.
DIA 1.
Entrega de cultivos.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica.
Sembrar cada bacteria en placas de:
28
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
1. Agar Sangre
2. Agar Salmonella-Shigella
3. Agar MacConkey
4. Agar Tergitol 7
5. Agar EMB de Levine
6. Agar Hektoen
7. Agar Bismuto Sulfito
Incubar las placas de agar sangre en jarras con candela a 35C por 24 horas.
Incubar el resto de las placas a 35oC por 24 horas.
DIA 2.
Describir la morfologa colonial de cada bacteria en los medios sembrados.
Realizar un frotis de colonias para hacer la tincin de Gram.
Inocular cada bacteria a partir del Agar MacConkey a Agar TSI utilizando el asa en punta.
Incubar a 35oC por 24 horas.
Subcultivar cada bacteria en Agar Sangre e incubar a temperatura ambiente por 24 horas
para hacer tincin de flagelos.
Subcultivar cada una de las bacterias en Agar Tripticasa-Soya inclinado. Incubar a 35C por
24 horas.
Realizar la prueba de oxidasa a partir del Agar Sangre. Utilizar un cultivo de Pseudomonas
aeruginosa como control positivo.
Inocular los siguientes medios de cultivo para la realizacin de pruebas bioqumicas de
identificacin para cada una de las bacterias a partir del Agar Sangre.
Agar Movilidad
Gelatina Nutritiva
Caldo MRVP (dos tubos, uno para la prueba de Rojo de Metilo, otro para la prueba
de Voges-Proskauer)
Agar Citrato de Simmons
Caldo Triptona (prueba de produccin de indol)
Agar Urea de Christensen
Inocular la tira de API20E de acuerdo a las instrucciones del mismo.
DIA 3.
Realizar la lectura del TSI.
Realizar la prueba de ONPG a partir del TSI para cada una de las bacterias.
Realizar la prueba de catalasa a partir del Agar Tripticasa-Soya inclinado. Utilizar un cultivo
de Enterococcus como control negativo.
Realizar la tincin de flagelos utilizando el colorante de Kodaka a partir del Agar Sangre
incubado a temperatura ambiente.
Realizar la lectura del API20E de acuerdo a las instrucciones.
Realizar la lectura de los medios inoculados el da 2, utilizando los reactivos
correspondientes:
29
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
6. DISCUSION DE RESULTADOS.
1. Cul es la identificacin de la bacteria que le fue entregada en esta prctica? Cmo lleg
usted a esa conclusin?
30
Bacteriologa diagnstica Enterobacteriaceae
4. Por qu el caldo Moeller con los diferentes aminocidos, una vez inoculado, debe ser
recubierto con una capa de Aceite mineral antes de ser incubado?
31
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
IV
VIBRIONACEAE
Las especies de Vibrio se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos aerobios, con una
estructura celular curva, tienen motilidad y poseen un flagelo polar, no forman esporas, miden
de 0.5 a 0.8 m de dimetro por 1.4 a 2.6 m de largo. Las especies de Vibrio crecen en
presencia o ausencia de oxgeno. Todas estas especies producen la enzima citocromo C
oxidasa (excepto la especie Vibrio metschnikovi), fermentan la glucosa y algunos producen
gas. El cloruro de sodio estimula el crecimiento y algunas especies son estrictamente
haloflicas. El gnero Vibrio contiene ms de 30 especies y 12 de stas son especies
patgenas para el ser humano.
32
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
Es importante observar que en este medio, aunque es selectivo, pueden crecer algunas
especies entricas como Proteus y Enterococcus, pero sus colonias son usualmente pequeas
y translcidas. Las colonias de las especies de Proteus que fermentan sacarosa producen
colonias amarillas que deben ser diferenciadas de las de Vibrio. Pseudomonas y Aeromonas
pueden crecer en placas de agar TCBS y usualmente forman colonias azules.
33
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
En caso que se determine que la bacteria es haloflica, es necesario agregar NaCl a una
concentracin final de 1% a los siguientes medios antes de realizar las correspondientes
pruebas bioqumicas:
Caldo MRVP
Caldo Triptona
Caldo Base de Moeller
Caldo Malonato
Caldo Nitratos con campana de Durham
Caldo Base Prpura Bromocresol
Medio Gelatina
3. Cronograma de actividades
DIA 1
Entrega de cultivos.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Sembrar cada bacteria en placas de:
Agar Sangre
Agar MacConkey
Agar TCBS
Incubar las placas de Agar Sangre en jarras con candela por 18-24 horas a 35OC.
Incubar el resto de las placas a 35OC por 18-24 horas.
DIA 2
Describir la morfologa colonial de cada bacteria en los medios sembrados considerando
tamao, forma, elevacin, margen, tipo de superficie, caractersticas pticas, produccin de
hemlisis y produccin de pigmentos.
Realizar un frotis y fijarlo para tincin de Gram.
Inocular en Caldo Tripticasa-Soya al 0% y al 3% de NaCl. Incubar a 35oC por 24 horas.
Inocular cada bacteria en Agar TSI. Incubar a 35OC por 24 horas.
Realizar la prueba de oxidasa a partir del Agar Sangre.
Realizar la prueba de catalasa a partir del Agar Sangre.
Inocular los siguientes medios de cultivo a partir del Agar Sangre para la realizacin de
pruebas bioqumicas de identificacin para cada una de las bacterias:
Agar Movilidad
Caldo MRVP (dos tubos, uno para la prueba de Rojo de Metilo, otro para prueba de
Voges-Proskauer)
Agar Citrato de Simmons
34
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
DIA 3
Realizar la tincin de flagelos utilizando el colorante de Kodaka.
Realizar la lectura de los medios inoculados el da 2 utilizando los reactivos
correspondientes.
Realizar la lectura del TSI.
Realizar la prueba de ONPG a partir del TSI.
35
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
36
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
37
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
38
Bacteriologa Diagnstica Vibrionaceae
4. Discusin de resultados.
1. Cmo se puede diferenciar, con las pruebas bioqumicas realizadas en el laboratorio, las
especies de la familia Vibrionaceae de las de la familia Enterobacteriaceae?
2. Cules fueron los medios de cultivo para aislamiento primario en los que crecieron
adecuadamente las especies estudiadas?
4. Podra usted afirmar que todas las bacterias que crecen en el agar TCBS pertenecen a la
familia Vibrionaceae?
39
Bacteriologa Diagnstica Pseudomonas y Burkholderia
V
PSEUDOMONAS Y BURKHOLDERIA
40
Bacteriologa Diagnstica Pseudomonas y Burkholderia
Gneros de bacilos
no fermentadores no fastidiosos
Pseudomonas
Burkholderia
Acinetobacter
Moraxella
Eikenella
Flavobacterium
Alcaligenes (Achromobacte )
Actinobacillus
Capnocytophaga
Cardiobacterium
Chromobacterium
Kingella
Stenotrophomonas (Xanthomonas)
Agar Sangre. Este medio es utilizado para el aislamiento primario de la mayora de las
cepas cultivables en el laboratorio, que producen patologas en seres humanos. A las 18
horas de incubacin se observan colonias medianas de 2 a 3 mm de dimetro y brillantes.
La mayora de las cepas no producen hemlisis, pero en algunas cepas es posible
apreciarla debido a la produccin de una esfingomielinasa que es capaz de lisar los
eritrocitos del medio. Algunas veces se puede observar la produccin de pigmentos como la
pioverdina, que se aprecia como una coloracin verdosa que difunde en el agar.
Agar MacConkey. Igual al anterior separa las bacterias que utilizan fermentativamente la
lactosa, de los que no la utilizan. Para ambos casos, tanto Pseudomonas como
Burkholderia presentan colonias translcidas lactosa negativa.
Agar OF. Se usa para determinar el comportamiento metablico de los bacilos gram
negativos ante diferentes carbohidratos. Se puede observar si lo utiliza o no, y si lo hace
oxidativamente o fermentativamente. Los tubos con medio OF se mantienen en agua
hirviendo por 10 minutos para eliminar el oxgeno que se encuentre en el medio. Despus se
deja enfriar y se procede a inocular. Para el caso de la glucosa, se requiere de un tubo
sellado con VASPAR y uno con atmsfera aerobia. Los dems carbohidratos NO se sellan
con VASPAR.
41
Bacteriologa Diagnstica Pseudomonas y Burkholderia
Agar Almidn. Determina la produccin de enzimas que producen la hidrlisis del almidn.
Si la bacteria es capaz de hidrolizar almidn, al agregarle yodo al medio, quedar un halo
transparente alrededor de la colonia. Este halo evidencia as la presencia de almidn
hidrolizado. Este medio se raya por estra.
4. Cronograma de actividades
DIA 1
Entrega de cultivos.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Sembrar cada bacteria en 2 placas de agar Sangre y 2 placas de agar MacConkey e incubar
a 37C y a TA.
DIA 2
Describir la morfologa colonial de cada bacteria en los medios sembrados considerando
tamao, forma, elevacin, margen, tipo de superficie, caractersticas pticas, produccin de
hemlisis y produccin de pigmentos.
Realizar un frotis y fijarlo para tincin de Gram.
Realizar la prueba de oxidasa a partir del agar sangre.
Inocular los siguientes medios de cultivo para la realizacin de pruebas bioqumicas de
identificacin para cada una de las bacterias:
Agar TSI
Agar Tripticasa Soya Inclinado
Caldo Tripticasa Soya (movilidad, incubar 6 horas)
Agar P
Agar F
Agar Tripticasa Soya conteniendo 6.5%NaCl
Inocular dos tubos con Caldo Tripticasa Soya, Incubar uno a 37oC y otro a 42oC.
Incubar una placa de agar Sangre a temperatura ambiente por un perodo de 18-24 horas
para realizar tincin de flagelos.
DIA 3
Realizar la tincin de flagelos utilizando el colorante de Kodaka.
Realizar la lectura prueba de la catalasa a partir del agar Tripticasa Soya inclinado.
Realizar lectura del TSI
Realizar la lectura de crecimiento a 35oC y a 42oC.
Para la lectura del agar F observar la placa bajo una luz ultravioleta (luz de Wood). La
presencia de fluorescencia indica una prueba positiva.
Para la lectura del agar P para determinar la presencia de piocianina, picar el agar con un
mondadientes y luego agregar 3 ml de cloroformo que posteriormente se depositan en un
tubo. Observar la presencia o ausencia de una coloracin azul tras un fondo blanco. La
presencia de una coloracin azul indica una prueba positiva.
42
Bacteriologa Diagnstica Pseudomonas y Burkholderia
5. Discusin de resultados.
43
Bacteriologa Diagnstica Pseudomonas y Burkholderia
44
Bacteriologa diagnstica Pseudomonas y Burkholderia
45
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
VI
OTROS BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES
1. Generalidades
46
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
47
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
A continuacin se brindan una serie de cuadros que pueden ser utilizados como una
gua para la identificacin de bacilos Gram negativos, no fermentadores, diferentes a
Pseudomonas y Burkholderia. Ntese que se utilizan las mismas pruebas bioqumicas para la
identificacin de este grupo-. El cuadro 1 puede ser utilizado para la orientacin inicial en la
identificacin. Mientras que los cuadros 2-7 se utilizan en la identificacin final a nivel de
especie.
48
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
49
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
50
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
51
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
52
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
3. Cronograma de actividades.
DIA 1.
Entrega de cultivos.
Realizar frotis y tincin de Gram
Describir la morfologa microscpica
Sembrar cada bacteria en 2 placas de agar Sangre y 2 placas de agar MacConkey e
incubar a 37C y a TA.
DA 2.
Describir la morfologa colonial de cada bacteria en los medios sembrados considerando el
tamao. la forma, la elevacin, el margen, el tipo de superficie, las caractersticas pticas y
la produccin de pigmentos de la colonia.
Realizar un frotis y fijarlo para hacer la tincin de Gram.
Realizar la prueba de oxidasa a partir del agar sangre.
Inocular los siguientes medios de cultivo para la realizacin de pruebas bioqumica de
identificacin para cada una de las bacterias:
Agar TSI
Agar Tripticasa Soya Inclinado
Caldo Tripticasa Soya (movilidad, incubar 6 horas)
Agar P
Agar F
Agar Tripticasa Soya conteniendo 6,5% NaCl
Inocular dos tubos con Caldo Tripticasa Soya. Incubar un tubo a 37oC y otro a 42oC.
Incubar una placa de agar Sangre a temperatura ambiente por un perodo de 18-24 horas
para realizar tincin de flagelos.
DIA 3
Realizar la lectura del TSI.
Realizar tincin de flagelos de Kodaka.
Realizar la prueba de la catalasa a partir del agar Tripticasa Soya inclinado.
Realizar la lectura de crecimiento a 350C y a 42C.
Para la lectura del agar F observar la placa bajo una luz ultravioleta (luz de Wood). La
presencia de fluorescencia indica una prueba positiva.
Para la lectura del agar P para determinar la presencia de piocianina. picar el agar con un
mondadientes y luego agregar 3 ml de cloroformo que posteriormente se depositan en un
tubo. Observar la presencia o ausencia de una coloracin azul tras un fondo blanco. La
presencia de una coloracin azul indica una prueba positiva.
Realizar la lectura del resto de las pruebas bioqumicas.
4. Discusin de resultados.
53
Bacteriologa Diagnstica Bacilos no fermentadores
1. Cules son las principales diferencias fenotpicas entre las especies de Pseudomonas,
Burkholderia estudiadas en la prctica anterior y los otros gneros de bacilos Gram negativos
no fermentadores estudiados en esta prctica?
54
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
VII
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS FASTIDIOSAS
En el gnero Haemophilus se han descrito nueve especies que se asocian al ser humano,
ya sea como flora normal en el tracto respiratorio superior o como agentes de infecciones:
H. influenzae
H. parainfluenzae
H. haemolyticus
H. parahaemolyticus
H. aphrophilus
H. paraaphrophilus
H. segnis
H. aegyptus
H. ducreyi
Las especies que pueden estar asociadas a infecciones en el ser humano incluyen H.
ducreyi, H. parainfluenzae, H. aphrophilus. Sin embargo la especie ms importante desde el
punto de vista de las infecciones en el ser humano es H. influenzae. H. influenzae puede
formar parte del tracto respiratorio superior hasta en un 50% de la poblacin normal. La
presencia de una cpsula de polisacridos extracelulares se considera como uno de los
principales factores de virulencia en esta especie, aunque no todas las cepas son
encapsuladas. Se han descrito seis tipos capsulares antignicamente diferentes, denominados
de a a f, presentes en cepas tipificables, mientras que a las cepas no encapsuladas se les
denomina frecuentemente no tipificables o NT. Las cepas de H. influenzae tipo b se encuentran
colonizando hasta un 5% de los nios, aunque son raras en individuos adultos, y son las que
causan ms frecuentemente infecciones invasivas graves en nios menores de cinco aos de
edad. H. influenzae de tipo b es responsable de cuadros de meningitis con precedente de
infecciones respiratorias y otitis, epiglotitis, celulitis periorbitaria, artritis sptica, neumona y
conjuntivitis. Las cepas de H. influenzae de los otros serotipos, as como las cepas no
tipificables, pueden causar infecciones como neumonas y bronquitis en adolescentes y
adultos, en su mayora con algn tipo de compromiso inmunolgico, o infecciones no invasivas
en nios.
55
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
56
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
N. lactamica
N. cinerea
N. polysaccharea
N. flavescens
N. subflava
N. sicca
N. mucosa
N. elongata
57
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
Los diplococos Gram negativos del gnero Neisseria se asemejan a granos de caf y
algunos producen cpsula. Las especies de Neisseria se caracterizan por ser de metabolismo
aerobio y el crecimiento de las especies patgenas se ve favorecido mediante incubacin en
una atmsfera altamente hmeda y enriquecida a 5-8% de CO2. Su temperatura de crecimiento
es ptima entre los 35-37oC y tienen requerimientos nutricionales complejos. Algunas especies
son capaces de degradar unos pocos carbohidratos, mientras que otras son completamente
incapaces de hacerlo, mientras que las especies saprfitas, especialmente, producen
pigmentos carotenoides.
Las muestras clnicas de origen genital deben ser inoculadas en medios enriquecidos pero
selectivos, como el agar Thayer-Martin modificado (MTM) o el agar Martin-Lewis (ML), que
contienen cuatro antibiticos que ayudan a suprimir el crecimiento de bacterias contaminantes:
vancomicina (MTM, 3 g/ml; ML, 4 g/ml), colistina (7.5 g/ml), lactato de trimetoprim (5 g/ml)
y un agente antifngico (MTM, nistatina, 13.5 g/ml; ML. anisomicina,20 g/ml). Las colonias
de N. gonorrhoeae a las 24 horas de incubacin son pequeas, de 0.5 a 1.0 mm de dimetro,
generan una coloracin blanca-griscea y son levantadas y brillantes.
58
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
mucosas de tracto respiratorio superior a nivel de epitelio columnar no ciliado. Una vez
colonizada la mucosa respiratoria, N. meningitidis puede alcanzar sangre y generar una
menngococcemia, la cual puede evolucionar a coagulacin intravascular diseminada, choque
endotxico y necrosis en glndulas suprarrenales, adems de un cuadro de meningitis aguda.
La infeccin invasiva por N meningitidis puede provocar rpidamente la muerte del paciente.
59
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
De las especies mencionadas, C. jejuni subsp. jejuni y C. coli, conjuntamente con C. fetus
subsp. fetus, son los tres agentes ms frecuentemente asociados a infecciones en el ser
humano. C. jejuni subsp. jejuni y C. coli son responsables de infecciones intestinales y
clnicamente indistinguibles. La presentacin clnica de la infeccin va desde un cuadro
asintomtico hasta una infeccin seria. Los sntomas y signos incluyen fiebre, dolor abdominal
y diarrea, con o sin sangre y leucocitos fecales, y duran desde varios das hasta ms de una
semana. C. jejuni subsp. jejuni y C. coli tambin son responsables de infecciones
extraintestinales, incluyendo bacteremias, infecciones del tracto urinario, meningitis,
endocarditis, entre otras. C. fetus subsp. fetus se asocia principalmente a bacteremia y a
infecciones extraintestinales, aunque tambin puede ser causa de gastroenteritis.
Las muestras de heces, o bien, los hisopados rectales, se utilizan para el aislamiento de la
bacteria. Estas muestras deben ser inoculadas en medios selectivos, los cuales son medios
enriquecidos, como agar sangre, a los cuales se les aade antibiticos como agentes
inhibitorios, por ejemplo, suplemento Skirrow o suplemento Btzler. Posteriormente los medios
deben ser incubados hasta por 48 horas en condiciones microaeroflicas. Dado que C. jejuni
subsp. jejuni y C. coli crecen bien a 42oC, se recomienda la incubacin a esta temperatura para
inhibir algunas otras bacterias contaminantes que crecen a 35-37oC pero no a 42oC. Sin
embargo, algunas otras especies de Campylobacter, como C. fetus subsp. fetus, crecen
adecuadamente a 35-37C pero no a 42oC.
60
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
H. pylori se asocia a diversas patologas gstricas como gastritis crnica, lcera pptica
duodenal y gstrica y adenocarcinoma gstrico. Su capacidad de residir en el mucosa gstrica
se basa particularmente en la produccin de una potente ureasa, la cual, mediante la hidrlisis
de urea a CO2 y NH3, tiende a alcalinizar el medio inmediato circundante de la bacteria,
protegindola as de la acidez estomacal. Adicionalmente, la morfologia, la motilidad y la
microaerofilia favorecen la multiplicacin de H. pyloni en el mucus gstrico.
Existe una gran variabilidad gentica y fenotpica entre las diferentes cepas de H. pylori.
Estudios iniciales han demostrado la presencia de ciertos factores de virulencia, como la toxina
vacuolizante Vac y protenas codificadas por el locus cag, en cepas aisladas a partir de
pacientes con patologa gstrica, pero muy infrecuentemente en cepas aisladas de pacientes
asintomticos.
61
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
5. Cronograma de actividades
Da 1.
Haemophilus
Entrega de cultivos.
Describir la morfologa colonial.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica.
Sembrar la bacteria en una placa de agar chocolate y en una placa de agar sangre. En la
placa de agar sangre el inculo debe ser denso. Posteriormente se realiza una inculo
transversal (en estra) con un cultivo de Staphylococcus aureus.
Incubar las placas por 18-24 horas a 35-37oC en atmsfera con 5-8% CO2.
Inocular fuertemente un caldo urea e incubarlo a 35-37oC por 18-24 horas.
Neisseria
Entrega de cultivos.
Describir la morfologa colonial.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica.
Sembrar la bacteria en una placa de agar chocolate y en una placa de agar sangre.
Incubar las placas por 18-24 horas a 35-37oC en atmsfera con 5-8% CO2.
62
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
Campylobacter
Da 2.
Haemophilus
Neisseria
Describir la morfologa colonial.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica.
Realizar la prueba de catalasa.
Realizar la prueba de oxidasa.
Da 3.
Campylobacter
6. Discusin de resultados.
3. Para qu sirven cada uno de los cuatro antibiticos que se aaden a los medios selectivos,
como Thayer-Martin modificado o Martin-Lewis, para el aislamiento de N. gonorrhoeae a partir
de muestras genitales?
63
Bacteriologa Diagnstica Bacterias fastidiosas
64
Bacteriologa Diagnstica Bacilos Gram Positivos
VIII
BACILOS GRAM POSITIVOS
L. grayi
L. innocua
L. ivanovii
L. monocytogenes
L. murrayi
L. seeligeri
L. welshimeri
65
Bacteriologa Diagnstica Bacilos Gram Positivos
El gnero Corynebacterium est constituido por un gran nmero de especies con gran
heterogeneidad gentica y fenotpica, y se caracterizan por ser bacilos Gram-positivos,
pleomficos, no-esporulados, no-encapsulados, no-mviles, que pueden presentar grnulos
metacromticos visibles mediante tincin con azul de metileno. Las especies de
Corynebacterium son catalasa-positiva y estn ampliamente distribuidas en el ambiente,
pudindose encontrar en suelos y agua, como tambin constituyen parte importante de la flora
normal en piel y mucosas del ser humano y de animales.
66
Bacteriologa Diagnstica Bacilos Gram Positivos
5. Cronograma de actividades
Da 1.
Entrega de cultivos.
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Listeria innocua
Erysipelothrix rhusiopathiae
Corynebacterium sp.
67
Bacteriologa Diagnstica Bacilos Gram Positivos
inocularon las otras bacterias, tal y como se muestra en la siguiente figura. Posteriormente
las placas deben ser incubadas a 35-370C por 18-24 horas.
Listeria
S. aureus
R. equi
Da 2.
Realizar la lectura de las pruebas bioqumicas.
Realizar la lectura de la prueba de CAMP. Observe la presencia de sinergismo en el efecto
hemoltico.
6. Discusin de resultados.
68
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
IX
STAPHYLOCOCCUS
La mayora de las especies del gnero Staphylococcus son bacterias no fastidiosas que
crecen relativamente bien en medios de cultivo sencillos como agar sangre, agar nutritivo, agar
tripticasa soya y otros. Las colonias individuales de Staphylococcus crecidas sobre agar
nutritivo son opacas, con bordes definidos, circulares, convexas y de 1 a 4 mm en dimetro. El
clsico color amarillo oro de las colonias de S. aureus es debido a la presencia de carotenoides
(aureus en latn significa oro). La pigmentacin es usualmente aparente luego de 18-24 horas
de incubacin a 37oC, pero es ms pronunciada cuando los cultivos son mantenidos a
temperatura ambiente for 24-48 horas adicionales. Esta caracterstica es pronunciada tambin
por la presencia de monofosfato o monoacetato de glicerol en el medio de cultivo. La
pigmentacin no es producida durante el cultivo anaerobio o en cultivos lquidos. Por otra parte,
existe una gran variacin en cuanto a la pigmentacin de las colonias, de un anaranjado
profundo a blanco, entre las diferentes cepas de S. aureus o incluso entre colonias individuales
de una misma cepa. Es importante destacar, sin embargo, que la pigmentacin colonial no es
una propiedad exclusiva de S. aureus, sino que est tambin presente en otras especies del
gnero incluyendo a S. arlettae, S. chromogenes, S. haemolyticus y otras.
69
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
70
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
Los cocos Gram-positivos aislados de muestras clnicas deben ser inicialmente analizados
por la produccin de la enzima catalasa. Esta es una prueba muy sencilla pero fundamental
para distinguir dos grandes grupos: cocos Gram-positivos catalasa-positivos que incluyen
Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomatococcus, y cocos Gram-positivos
catalasa-negativos con Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus y Planococcus entre otros.
Como se indic anteriormente, las especies S. aureus subsp. anaerobius y S. saccharolyticus
son catalasa-negativa. Sin embargo, la produccin de catalasa puede ser inducida en S.
saccharolyticus por la adicin de hemina en el medio de cultivo, pero no en S. aureus subsp.
anaerobius.
Los Staphylococcus, a su vez, pueden ser diferenciados de los Micrococcus mediante las
pruebas de oxidasa y resistencia a la furazolidona y de los Planococcus y Stomatococcus por
la prueba resistencia a la lisostafina. Es importante recordar, sin embargo, que ciertos
Staphylococcus pueden ser resistentes a la lisostafina debido a sustituciones en residuos de
glicina por L-serina o L-alanina en el interpptido del peptidoglicn, como en el caso de S.
epidermids y en S. sciuri respectivamente. En caso de duda, se puede realizar la prueba de
resistencia a la bacitracina, en la cual los Staphylococcus se muestran resistentes, mientras
que Mcrococcus y Stomacoccus son sensibles. Adicionalmente las especies S. sciuri, S. lentus
y S. caseolyticus tienen citocromos tipo c y son, por lo tanto, oxidasa-positivos. Sin embargo,
estas tres especies tienen poca importancia clnica.
71
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
Una variedad de plasmas pueden ser utilizados para realizar estas pruebas. Sin embargo,
plasma deshidratado de conejo conteniendo citrato o EDTA se obtiene comercialmente y es
adecuado para la identificacin de S. aureus, S. intermedius y S. hyicus. El plasma humano es
usualmente ms satisfactorio para la identificacin de S. lugdunensis y S. schleferi. El plasma
humano no debe ser rutinariamente utilizado, a menos que se analice cuidadosamente por su
capacidad coagulante y por la presencia de sustancias que puedan inhibir la prueba
(anticuerpos, antibiticos).
72
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
preliminar en unas cuatro horas utilizando la tarjeta de identificacin para Gram-positivos. Los
programas de este sistema automatizado convierten los resultados en nmeros que son
comparados contra una base de datos. Este sistema puede realizar tambin determinaciones
rpidas de susceptibilidad a los antibiticos adems de la identificacin del microorganismo.
3. Cronograma de actividades
Da 1.
Entrega de cultivos.
Inocular en una placa de agar sangre e incubar a 35-37oC en jarra con candela por 18-24
horas.
Inocular una placa de agar manitol-sal e incubar 35-370C por 18-24 horas.
Realizar frotis y tincin de Gram
Da 2.
Describir la morfologa colonial en cada uno de los medios utilizados.
Realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica.
Realizar la prueba de catalasa. Utilizar cepas de S. aureus y Enterococcus sp. como
controles positivo y negativo, respectivamente.
Realizar la prueba de coagulasa utilizando plasma humano en un tubo 12 mm x 75 mm e
inocular densamente con la bacteria. Incubar en bao mara a 35-370C por 18-24 horas y
observar por aparicin de un cogulo. Utilizar cepas de S. aureus y S epidermidis como
controles positivo y negativo, respectivamente.
Inocular por estra un tubo de agar P conteniendo novobiocina (1.6 g/ml) e incube a 35-
370C por 18-24 horas.
Calentar en bao mara hasta ebullicin un tubo de tioglicolato. Dejarlo enfriar a
temperatura ambiente e inocular la bacteria hasta el fondo de los tubos. Incubar a 35-370C
por 48 horas.
Da 3.
Realizar la lectura de las pruebas a las 24 horas, segn lo indicado, para las siguientes
pruebas:
Coagulasa.
Crecimiento en anaerobiosis en caldo tioglicolato.
Crecimiento en agar P conteniendo 1.6 g/ml de novobiocina.
5. Discusin de resultados.
2. Por que para las pruebas de utilizacin de carbohidratos para Staphylococcus se utilizan
medios slidos y no medios lquidos?
73
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
74
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
Cuadro 4. Pruebas para la identificacin de especies de Staphylococcus con mayor importancia clnica.
Crecimiento Coagulasa Fosfatasa Ornitina
Especie Pigmento Hemlisis Oxidasa Nucleasa Ureasa
anaerobio Libre Fija alcalina descarboxilasa
S. aureus subsp. aureus + + + + + + + v
S. capitis subsp. capitis (v) (+)
S. capitis subsp. (v) (v) (+) +
ureolyticus
S. cohnii subsp. cohnii (v) v
S. cohnii subsp. v (v) (+) + +
urealyticum
S. epidermis (v) + + (v) +
S. haemolyticus v (+) (+)
S. hominis v +
S. hyicus + v + + v
S. intermedius v (+) + v + + +
S. kloosii v (v) v v
S. lugdunensis v (+) + (+) + v
S.saprophyticus v (+) +
S. schleiferi subsp. (+) + + + + ND
coagulans
S. schleiferi subsp. (+) + + + +
schleiferi
S. sciuri v (+) + +
S. simulans (v) + (v) +
S. warneri v (v) + +
S. xylosus v v v +
Ver comentarios en el texto.
Smbolos: +, 90% o ms de las cepas dan reaccin positiva; , 90% o ms de las cepas dan reaccin negativa; , 90% o ms de las especies
dan una reaccin dbil; v, 11 a 89% de las cepas dan reaccin positiva; ( ), reaccin retardada; ND, no determinado.
75
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
Cuadro 4. Pruebas para la identificacin de especies de Staphylococcus con mayor importancia clnica (continuacin).
Produccin de Reduccin de Resistencia a Resistencia a
Especie -Galactosidasa
acetona nitratos Novobiocina Polimixina B
S. aureus subsp. aureus + + +
S. capitis subsp. capitis v v
S. capitis subsp. ureolyticus v + ND
S. cohnii subsp. cohnii v +
S. cohnii subsp. urealyticum + v +
S. epidermis + + +
S. haemolyticus + +
S. hominis v v
S. hyicus + +
S. intermedius + +
S. kloosii v v +
S. lugdunensis + + v
S.saprophyticus + + +
S. schleiferi subsp. ND + + ND
coagulans
S. schleiferi subsp. schleiferi (+) + +
S. sciuri + +
S. simulans + v +
S. warneri + v
S. xylosus + v v +
Ver comentarios en el texto.
Smbolos: +, 90% o ms de las cepas dan reaccin positiva; , 90% o ms de las cepas dan reaccin negativa; , 90% o ms de las especies
dan una reaccin dbil; v, 11 a 89% de las cepas dan reaccin positiva; ( ), reaccin retardada; ND, no determinado.
76
Bacteriologa Diagnstica Staphylococcus
Cuadro 4. Pruebas para la identificacin de especies de Staphylococcus con mayor importancia clnica (continuacin).
Especie Produccin aerbica de cido a partir de
Arabinosa Lactosa Maltosa Manitol Manosa Trehalosa Sacarosa Xilosa
S. aureus subsp. aureus + + + + + +
S. capitis subsp. capitis + + (+)
S. capitis subsp. ureolyticus (v) + + + +
S. cohnii subsp. cohnii (v) v (v) +
S. cohnii subsp. urealyticum + (+) + + +
S. epidermis v (+) (+) +
S. haemolyticus v + v + +
S. hominis v + v (+)
S. hyicus + + + +
S. intermedius v (v) + + +
S. kloosii v (v) v + + () (v)
S. lugdunensis + + + + +
S.saprophyticus v + v + +
S. schleiferi subsp. coagulans v v + v
S. schleiferi subsp. schleiferi + v
S. sciuri v (v) (v) + (v) + + (v)
S. simulans + () + v v +
S. warneri v (+) v + +
S. xylosus v v + + + + + +
(contina)
Ver comentarios en el texto.
Smbolos: +, 90% o ms de las cepas dan reaccin positiva; , 90% o ms de las cepas dan reaccin negativa; , 90% o ms de las especies
dan una reaccin dbil; v, 11 a 89% de las cepas dan reaccin positiva; ( ), reaccin retardada; ND, no determinado.
77
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
X
STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS
78
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
Algunas especies pueden ser patgenas y otras comensales avirulentos que forman parte de la
flora normal del tracto respiratorio y tracto genital, colonizando adems piel y membranas
mucosas. Las especies del gnero Streptococcus son bacterias anaerobias facultativas
esfricas u ovales que miden menos de 2 m de dimetro. Mediante tincin de Gram se
pueden observar como cocos Gram-positivos que se encuentran frecuentemente formando
parejas o cadenas. Entre otras caractersticas importantes destacan su no-movilidad, carecen
de flagelos y no forman esporas, adems de que todas las especies reaccionan negativamente
a la catalasa. Las especies del gnero Streptococcus son bacterias relativamente fastidiosas
con requerimientos nutricionales que varan segn la especie. La mayora de las especies
crecen adecuadamente en medios nutritivos enriquecidos con sangre o suero. Algunas cepas
requieren de atmsferas elevadas en CO2 (5-10%), lo cual incrementa el crecimiento y la
actividad hemoltica. Luego de 18-24 horas de incubacin a 35-37oC, las colonias aisladas
miden de 0.3 a 2 mm de dimetro, son opacas, blanquecinas, circulares, de bordes definidos y
presentan hemlisis variable. Algunas de las especies ms frecuentemente asociadas a
cuadros clnicos en seres humanos y animales se muestran en el cuadro 3, cuya clasificacin
en los diferentes grupos se basa en el anlisis del ARNr 16S.
Cuadro 3. Ejemplos de especies asignados a los diferentes grupos del gnero Streptococcus
basados en el anlisis del ARNr 16S.
Grupo Designacin Especies Grupo de Lancefield
S. pyogenes A
S. agalactiae B
Grupo piognico
S. equi C
I S. dysgalactiae C
Varias especies G
S. canis L,M
S. porcinus E,P,U,V
II Grupo S. bovis S. bovis, S equinus D,D
S. mitis, S. gordonii, S.
III Grupo S. mitis No aplicable
pneumoniae
IV Grupo S. mutans S. mutans, S. sobrinus No aplicable
V Grupo S. salivarius S. salivarius No aplicable
S. anginosus, S
VI Grupo S.milleri No aplicable
constellatus
S. acidominimus, No aplicable
VII Otras especies
S. suis R, RS,S,T
Los microorganismos de este gnero que son patgenos pueden encontrarse produciendo
erisipela, fiebre puerperal, infecciones generalizadas, faringitis, piodermia estreptoccica
(imptigo), endocarditis aguda y subaguda, infecciones fulminantes por estreptococos del
grupo A, sndrome de choque txico, infecciones del sistema urinario, de vas biliares,
enfermedad post-estreptoccica (fiebre reumtica y glomerulonefritis), neumonas, sinusitis,
otitis, bronquitis, bacteremias, meningitis e infecciones nosocomiales.
79
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
especies de Enterococcus crecen a una temperatura ptima de 35oC, pero la mayora de las
especies pueden crecer entre 10C y 45oC, crecen en caldo tripticasa soya (CTS) conteniendo
6.5% de NaCl e hidrolizan la esculina en presencia de sales biliares. Algunas especies de
Enterococcus son mviles. La expresin de un fenotipo hemoltico es altamente variable entre
las diferentes especies de Enterococcus as como entre cepas de una misma especie. Por
ejemplo, algunas cepas de E. faecalis son -hemolticas en medios con sangre de conejo o
caballo, pero no hemolticas en medio con sangre de oveja.
Actividad hemoltica.
80
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
dicho efecto en forma de flecha cuando se utilizan placas de agar sangre preparadas con
eritrocitos ovinos o bovinos. Una vez inoculados, los medios de cultivo deben ser incubados a
35-37oC por 18-24 horas. Algunos autores recomiendan no incubar las placas de agar sangre
para la prueba de CAMP en una atmsfera enriquecida con CO2 debido a un probable efecto
inhibitorio sobre el sinergismo.
81
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
82
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
5. Cronograma de actividades.
Da 1
Entrega de cultivos en placas de agar sangre.
Describir la morfologa colonial
Realizar frotis y tincin de Gram.
Describir la morfologa microscpica.
Realizar la prueba de catalasa utilizando una cepa de S. aureus y una cepa de
Enterococcus como controles positivo y negativo, respectivamente.
Inocular una placa de agar sangre para evaluar la actividad hemoltica. Para esto, inocular
una placa de agar sangre preparada con eritrocitos bovinos o equinos (rotulada como
CAMP), y realizar varias hendiduras en el agar, de manera que posteriormente al perodo
de incubacin ocurra crecimiento por debajo de la superficie del medio. Inocular una placa
de agar sangre corriente y procesar de la misma manera que la anterior. Incubar a 35-37oC
en una atmsfera enriquecida con CO2.
83
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
Inocular una placa de agar sangre para realizar las pruebas de resistencia a bacitracina y a
optochin. Para esto, inocular densamente la placa de agar sangre con la correspondiente
bacteria. Colocar un disco conteniendo optochin (marcado con una P de pneumococccus)
y otro disco conteniendo 0.04 U de bacitracina (marcado con una A) sobre el inculo, de
manera que cada uno de los discos queden colocados hacia una mitad de la placa (ver la
siguiente figura). Presionar levemente cada uno de los discos para que se adhieran a la
superficie del medio. Incubar a 35-370C por 18-24 horas en una atmsfera enriquecida con
CO2.
P A
Inocular una placa de agar sangre preparada con eritrocitos ovinos o bovinos mediante
estra para realizar la prueba de CAMP. Para realizar esta prueba, la placa debe ser
inoculada en el centro por estra con una cepa de Staphylococcus aureus productora de la
toxina (esfingomielinasa). Perpendicularmente al inculo de S. aureus se inocula por
estra la especie de Streptococcus o Enterococcus, sin tocar el sitio donde se inocul la otra
bacteria, tal y como se muestra en la siguiente figura. Posteriormente las placas deben ser
incubadas a 35-37oC por 18-24 horas.
S. aureus
Streptococcus-Enterococcus
84
Bacteriologa Diagnstica Streptococcus y Enterococcus
Inocular un tubo conteniendo caldo tripticasa soya con 6.5% de NaCl e incubar a 35-370C
por 18-24 horas.
Inocular un tubo conteniendo agar bilis-esculina e incubar a 35-370C por 18-24 horas.
Da 2.
Realizar la lectura de las pruebas inoculadas en el da 1.
Realizar la identificacin de las cepas utilizando los cuadros 4, 5, 6, 7.
6. Discusin de resultados.
1. Cul es la composicin del agar bilis-esculina? Cul es la funcin de cada uno de sus
ingredientes?
85
Bacteriologa Diagnstica Pruebas Serolgicas
XI
PRUEBAS SEROLOGICAS EN BACTERIOLOGIA
1. Rosa de bengala
Las pruebas serolgicas son las herramientas ms tiles para evaluar la epidemiologa de
la brucelosis y la eficacia de los programas de vacunacin. Los mtodos ms comnmente
usados incluyen aglutinacin, fijacin de complemento, inmunodifusin en gel e
inmunoensayos enzimticos. Actualmente, mediante la combinacin de una buena informacin
clnico-epidemiolgica, junto con el uso de pruebas serolgicas presuntivas y confirmatorias, se
obtienen mejores resultados en el diagnstico preliminar de casos sospechosos. Es importante
adems capacitar al personal mdico y de laboratorio, ya que la brucelosis es una entidad de
origen insidioso, difcil de identificar, y representa un riesgo de contaminacin a nivel de
laboratorio si no se siguen procedimientos apropiados con personal conciente del peligro de
esta infeccin bacteriana.
Materiales y reactivos
Suspensin concentrada de Brucella abortus (cepa Weybridge 99) inactivada por calor y
fenol 0.5%, dispersa en buffer de lactato pH 5.0 y teida con Rosa de Bengala.
Pipeta automtica
Placa de cermica blanca lisa
Aplicadores descartables
Agitador inclinado (opcional)
Sueros y antgeno almacenados a 2-8C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar
Solucin salina 0.85 % o PBS 0.01 M pH 7.4
Procedimiento
Animales
1. Colocar una gota de 15 a 30 l de cada suero en la placa
2. Colocar una gota de 15 a 30 l de Rosa Bengala a la par de cada suero
3. Mezclar con el aplicador para homogenizar
4. Agitar manualmente o en agitador por 5 a 10 minutos
Humanos
1. Hacer diluciones dobles seriadas hasta 1:64 con solucin salina o PBS
2. Diluir el antgeno 1:5 con PBS
3. Colocar 15 a 30 l de cada dilucin junto a una cantidad igual de antgeno diluido en la placa
4. Mezclar y agitar de la misma forma que el procedimiento anterior
86
Bacteriologa Diagnstica Pruebas Serolgicas
Interpretacin
2. Antiestreptolisina O (ASO)
La estreptolisina O (SO), es una de las toxinas producidas por bacterias del gnero
Streptococcus pyogenes, o estreptococos beta hemolticos del grupo A de Lancefield. Es una
citolisina lbil al oxgeno y sensible a colesterol. Debido a la inmunogenicidad de la toxina, es
posible determinar los anticuerpos en el suero de pacientes que han estado en contacto con
esta bacteria Gram positiva. En personas sanas se pueden encontrar ttulos bajos de
anticuerpos contra SO, sin embargo, un aumento en el ttulo es indicativo de una infeccin
activa (reciente) como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal o erisipela.
El primer test serolgico para la determinacin de ASO fue descrito por Todd en 1932. Esta
prueba se basa en la neutralizacin de la SO mediante cantidades crecientes del suero
problema. El exceso de SO no neutralizada, es revelado por medio de hemlisis de los
eritrocitos sensibilizados. Se pueden detectar tambin anticuerpos contra los estreptococos
utilizando isoenzimas del ADN, as como mediante una prueba de hemaglutinacin,
denominada "Streptozyme" en la cul se adsorben varios antgenos bacterianos sobre
eritrocitos (hialuronidasa, estreptokinasa, ADNasa B, etc). El presente mtodo se basa en la
deteccin de anticuerpos anti-estreptolisina O en suero por su reaccin contra la SO adsorbida
sobre un soporte inerte de ltex, lo que produce una aglutinacin visible microscpicamente.
Materiales y reactivos
Procedimiento
Prueba cualitativa
1. Agitar el reactivo ltex varias veces con el gotero
2. Colocar una gota (50 l) de suero junto a 50 l de reactivo ltex en la placa
3. Mezclar con aplicador hasta homogenizar
4. Agitar por dos minutos y leer
Prueba semicuantitativa
1. Los sueros positivos en la prueba cualitativa se diluyen seriadamente en viales plsticos o de
vidrio con salina o PBS hasta 1:64
87
Bacteriologa Diagnstica Pruebas Serolgicas
Interpretacin
No aglutinacin: suspensin se mantiene homognea
Aglutinacin visible: presencia de anticuerpos ASO
Ttulo: inverso de la mxima dilucin a la que se observa una aglutinacin visible
ASO (UI/ml) = ttulo sensibilidad de la reaccin (200 UI/ml)
Materiales y reactivos
Procedimiento
Prueba cualitativa
1. Colocar 50 l de suero en un anillo de la lmina con micropipeta
2. Agregar una gota de la suspensin del antgeno con el gotero calibrado
3. Poner a rotar las lminas por 4 minutos a 180 rpm.
4. Observar al microscopio sin carro y aumento de 100X con la mxima iluminacin.
Prueba semicuantitativa
1. Preparar diluciones dobles seriadas del suero hasta 1:32 en solucin salina
88
Bacteriologa Diagnstica Pruebas Serolgicas
Interpretacin
R (reactivo): grumos grandes y medianos
DR (dbilmente reactivo): grumos pequeos
NR (no reactivo): grumos ausentes
Ttulo: inverso de la mxima dilucin que se observe reactiva
89
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
XiI
SELECCION, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLINICAS.
1. Consideraciones generales.
Siempre que sea posible, la muestra clnica debe ser recolectada antes de iniciar la terapia
con agentes antimicrobianos.
90
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
Se debe evitar la contaminacin con flora normal para asegurar que la muestra clnica sea
representativa del proceso infeccioso.
Se debe seleccionar el sitio anatmico correcto del cual obtener la muestra clnica y utilizar
las tcnicas y los materiales apropiados para la recoleccin de las muestras clnicas. Los
materiales, instrumentos y equipos deben estar estriles.
Es necesario especial cuidado en la recoleccin de muestras clnicas para cultivos por
bacterias anaerobias. En general, las muestras de escogencia son las biopsias y los
aspirados, mientras que el material infeccioso recolectado por torunda es indeseable. Las
muestras clnicas para cultivo por bacterias anaerobias deben ser mantenidas a
temperatura ambiente y no deben ser refrigeradas.
Es esencial recolectar un volumen de muestra adecuado, por cuanto un material en
cantidad insuficiente puede provocar resultados falsos-negativos.
Se deben utilizar solamente recipientes estriles para la recoleccin de las muestras
clnicas, preferentemente de boca ancha, con tapa de rosca para muestras de orina, otros
fluidos corporales, esputo y tejidos. Con pocas excepciones, no se deben utilizar placas de
Petri para el transporte de muestras clnicas. Los contenedores o recipientes deben ser de
un material adecuado, diseado para promover la sobrevivencia de los agentes bacterianos
y para eliminar riesgos de derrame y de bioseguridad.
Cuadro 2. Aceptabilidad de las muestras clnicas para cultivo por bacterias anaerobias
Muestras aceptables Muestras Inaceptables
Aspirado (por aguja o jeringa) Aspirado de traqueostoma
Aspirados de senos Aspirado endotraqueal
Aspirado endometrial (tero) Esputo expectorado
Aspirado suprapbico (orina) Esputo inducido
Aspirados transtraquales Fluido seminal o prosttico
Bilis Heces o muestras rectales
Cepillado bronquial (broncoscopa) Lavado broncoalveolar
DIU1 para Actinomyces spp. Loquios
Glndula de Bartholin Orina obtenida por cateterizacin
Heces para Clostridium spp.2 Orina obtenida por miccin
Mdula sea Torunda cervical
Ovario Torunda endocervical
Placenta obtenida por cesrea Torunda farngea
Torundas y tejidos obtenidos por ciruga Torunda nasofarngea
Trompas de falopio Torunda perineal
Torunda vulval
1
DIU, dispositivo intrauterino.
2
Excepciones: botulismo infantil, infecciones por C. perfringens o por C. difficile
91
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
Idealmente, todos los recipientes conteniendo muestras clnicas deben ser transportados en
bolsas plsticas sellables, con dos compartimientos separados, uno para el recipiente y otro
para la documentacin.
La mayora de las muestras clnicas recolectadas con torundas y que se han secado
durante el transporte son inaceptables para su procesamiento.
En el caso que sea necesario utilizar torundas, se debe hacer una seleccin adecuada del
tipo de material:
Material Caractersticas
Algodn Los cidos grasos residuales presentes en algunos tipos de
algodn pueden inhibir algunas bacterias, particularmente
Chlamydia
92
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
Cuadro 3. Muestras que no deben ser procesadas debido a la poca informacin microbiolgica
que puede ser obtenida
Tipo de muestra Alternativa/Comentario
Torundas de quemaduras Recolectar tejido o aspirado
Descarga de colostoma No procesar
Torundas de lceras decbito Recolectar tejido o aspirado
Puntas de catter Foley No procesar
Aspirado gstrico de neonato No procesar
Loquios No procesar
Torundas de abscesos perirrectales Recolectar tejido o aspirado
Torundas de lesiones gangrenosas Recolectar tejido o aspirado
Torundas de lesiones periodontales Recolectar tejido o aspirado
Torundas de lceras varicosas Recolectar tejido o aspirado
Vmito No procesar
Una vez que las muestras clnicas han sido recolectadas deben ser transportadas al
laboratorio lo ms pronto posible con el objeto de asegurar la sobrevivencia y el aislamiento de
microorganismos fastidiosos y para evitar el sobrecrecimiento de microorganismos menos
fastidiosos, disminuir el tiempo de contacto de los microorganismos con agentes anestsicos
locales que pudieron haber sido utilizados durante la recoleccin y proporcionar un diagnstico
ms preciso del proceso infeccioso. Las siguientes son recomendaciones generales para el
transporte y el almacenamiento de muestras clnicas para cultivo de agentes bacterianos.
93
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
1. Una muestra clnica sin rotular, mal rotulada o que no concuerda con la informacin de la
solicitud es inaceptable para su procesamiento en el laboratorio.
2. Si una muestra inaceptable puede ser reemplazada por una segunda muestra, notificar por
telfono inmediatamente al servicio, explicando las razones del rechazo y solicitar una
segunda muestra.
3. No descartar la primera muestra hasta que se haya confirmado la recoleccin de la
segunda muestra.
94
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
1. Si existe evidencia clara que el recipiente est contaminado externamente por la muestra, el
recipiente estaba abierto cuando fue recibido o est roto o quebrado, la muestra no debe
ser procesada.
2. Proceder a solicitar una segunda muestra, como se indic anteriormente.
1. Si existe evidencia clara que la muestra recibida est contaminada con otro tipo de muestra
(por ejemplo, una muestra de orina contaminada con heces o visceversa), la muestra no
debe ser procesada.
2. Solicitar una segunda muestra, como se indic anteriormente.
95
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
Una vez que las muestras clnicas han sido aceptadas y se les ha asignado un nmero o
cdigo, es importante determinar la calidad de las muestras antes de su procesamiento
bacteriolgico. La evaluacin de la calidad de las muestras es importante para todos los tipos
de muestras, aunque es particularmente imperativo en las muestras provenientes del tracto
respiratorio inferior, incluyendo muestras de esputo expectorado, aspirados transtraqueales,
lavados o cepillados bronquiales. Este procedimiento tambin es aplicable a cualquier muestra
que pueda ser fcilmente contaminada con flora normal de sitios anatmicos adyacentes.
96
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
Muestras del tracto respiratorio inferior con valores Q de + 1, +2 +3 son apropiadas para
cultivo por bacterias aerobias.
Muestras del tracto respiratorio inferior con un valor Q de 0, -1, -2 -3 son inapropiadas
para cultivo y se debe reportar Muestra no es representativa del tracto respiratorio
inferior. Favor enviar una segunda muestra.
Muestras de heridas con un valor Q de +3 son apropiadas para cultivo por bacterias
aerobias y anaerobias, si se ha solicitado.
Muestras de heridas con un valor Q de +1 +2 son apropiadas para cultivo por bacterias
aerobias. Si se ha solicitado cultivo por bacterias anaerobias se debe reportar Muestra
tiene evidencia de contaminacin superficial y es inaceptable para cultivo por
bacterias anaerobios. Favor enviar una segunda muestra
Muestras de heridas con un valor Q de 0, -1, -2 -3 son inapropiadas para cultivo y se debe
reportar Clulas epiteliales escamosas en la muestra indican la presencia de material
superficial que puede contener bacterias contaminantes no relacionadas con la
infeccin. Favor enviar una segunda muestra.
97
Bacteriologa Diagnstica Muestras Clnicas
98
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
XiII
PROCESAMIENTO DE UROCULTIVOS
Las infecciones del tracto urinario tienen un gran impacto en la sociedad debido a que son
una causa importante de ausentismo laboral y escolar con sus obvias consecuencias
econmicas. Adicionalmente, las infecciones del tracto urinario son la principal causa de sepsis
y choque sptico a nivel comunitario, la principal causa de infecciones intrahospitalarias y la
segunda causa en importancia de choque sptico a nivel nosocomial.
La orina dentro del tracto urinario normal es estril y los microorganismos llegan a colonizar
solamente las porciones distales de la uretra. La orina, al pasar por las porciones distales de la
uretra durante la miccin, se puede contaminar con las bacterias comensales. El nmero de
bacterias presentes en la orina recin recolectada de una persona saludable es relativamente
bajo, usualmente 102 UFC/ml.
La prevalencia de las infecciones bacterianas a nivel del tracto urinario depende de una
serie de atributos del hospedero, particularmente del sexo y de la edad del individuo. La
prevalencia de las infecciones bacterianas a nivel del tracto urinario depende de una serie de
atributos del hospedero, particularmente del sexo y de la edad del individuo. Las infecciones
urinarias se presentan, en trminos generales, ms frecuentemente en mujeres que en
hombres por varias razones anatmicas, fisiolgicas y conductuales o sociales.
La gran mayora de las infecciones del tracto urinario son causadas por bacterias que se
originan de la flora intestinal normal del mismo individuo. Sin embargo, el espectro de los
agentes etiolgicos depende, en gran parte, de si la infeccin es de origen comunitario o de
origen nosocomial. En todo caso, Escherichia coli es el agente etiolgico ms importante como
responsable tanto de infecciones del tracto urinario comunitarias como de infecciones
nosocomiales. Algunos resultados de diferentes estudios sobre los principales agentes
bacterianos de infecciones del tracto urinario se muestran a continuacin:
99
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Infeccin complicada3 o
Infeccin no complicada2 % %
nosocomial
Escherichia coli 75-85 Escherichia coli 40-50
Rutas de ingreso.
Las bacterias logran llegar hasta diferentes sitios en el tracto urinario bsicamente por tres
rutas diferentes:
Ruta hematgena. Por medio de esta ruta, bacterias que se encuentran circulantes en
sangre como causantes de una bacteremia, con o sin sintomatologa concomitante, llegan
hasta el sistema urinario, particularmente a nivel de los riones, y pueden provocar una
infeccin renal, como los abscesos renales. Esta es una ruta de infeccin relativamente
infrecuente para bacterias provenientes de la flora intestinal, pero puede ser importante
para otros patgenos como Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae (en nios),
Salmonella y Candida entre otros.
Como sistema orgnico, el tracto urinario tiene varios mecanismos de defensa que permite
evitar en gran medida la colonizacin y la infeccin causada por bacterias. Algunos de los
100
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Una gran cantidad de diferentes factores del individuo pueden predisponer o llevar al
establecimiento de una infeccin en el tracto urinario, incluyendo:
Existen mltiples razones por las cuales las infecciones del tracto urinario se presentan
mucho ms frecuentemente en mujeres que en hombres, incluyendo:
101
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Razones fisiolgicas. Existen factores fisiolgicos por los cuales las infecciones del tracto
urinario son ms frecuentes en mujeres, incluyendo, por ejemplo, los cambios hormonales
que se presentan durante el embarazo, lo cual puede conducir a alteraciones en la flora
normal. Asimismo, durante el embarazo y despus del parto puede ocurrir una disminucin
del vaciamiento vesical debido a estiramiento de los tejidos. Conforme mayor sea el nmero
de hijos, mayor ser el riesgo a sufrir una infeccin del tracto urinario. Por otra parte, la
presencia de restos de sangre y de otras secreciones, que durante la menstruacin
permanecen en la regin periuretral, puede promover la multiplicacin y la colonizacin
bacteriana de la uretra distal y proximal.
102
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
establecimiento de las infecciones de las vas urinarias bajas (cistitis). Las fimbrias tipo P
reconocen residuos de digalactsido (Gal-Gal) localizados en la superficie de la pelvis renal
y, por lo tanto, se presume que las fimbrias tipo P median la colonizacin de dicho sitio
anatmico facilitando el establecimiento de infecciones de las vas urinarias altas
(pielonefritis). Las fimbrias tipo P solamente se encuentran solamente en ciertas cepas de
Escherichia coli denominadas pielonefrognicas.
Produccin de ureasa. La produccin de una enzima con actividad urealtica es frecuente
en muchos uropatgenos de origen intestinal, incluyendo Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Providencia stuartii y Staphylococcus saprophyticus. La hidrlisis de urea
incrementa la concentracin de amonio en la orina con la subsiguiente elevacin del pH
urinario. El pH urinario elevado puede llevar a una serie de efectos importantes incluyendo
la formacin de clculos debido a la precipitacin de sales de fosfato de magnesio y
amonio. La formacin de clculos puede provocar la obstruccin de las vas urinarias e
interferir con la miccin y favorece el establecimiento de las infecciones bacterianas.
Adicionalmente, la alcalinizacin de la orina por la generacin de amonio favorece la
multiplicacin y la sobrevivencia bacteriana en el tracto urinario, probablemente porque se
logra un pH ms adecuado para el crecimiento bacteriano, se obtiene amonio a
concentraciones elevadas como una fuente de nitrgeno ms asimilable y el amonio puede
inactivar el cuarto componente del complemento y prevenir as algunas funciones del
sistema inmunolgico.
Produccin de hemolisinas. La gran mayora de las especies bacterianas aisladas de
infecciones en el tracto urinario son hemolticas cuando se observa su morfologa colonial
sobre placas de agar sangre. El caso ms estudiado es el de la hemolisina de Escherichia
coli, una citolisina formadora de poros que tiene la capacidad de interactuar y muchas
veces lisar diferentes tipos de clulas del hospedero. La lisis de los eritrocitos provoca la
liberacin hemoglobina, la cual sirve como una fuente de hierro, un elemento esencial para
la multiplicacin bacteriana. Adicionalmente, la interaccin de la hemolisina sobre clulas
nucleadas puede alterar la fisiologa celular, de manera que se inhiben muchas funciones
de leucocitos polimorfonucleares y otras clulas de respuesta inflamatoria. Tales efectos
inhibitorios bloquean la actividad del sistema inmunolgico y favorecen entonces la
multiplicacin de las bacterias en el tracto urinario. Por otra parte, la hemolisina de
Escherichia coli puede tener un efecto txico sobre las clulas uroepiteliales y del
parnquima renal, provocando as un dao directo adicional. Otros casos menos estudiados
incluyen las hemolisinas de Proteus mirabilis y Proteus vulgaris, las cuales muestran una
gran homologa con la hemolisina de Escherichia coli, la hemolisina de Serratia marcescens
y la toxina a de Staphylococcus aureus, entre otras.
Produccin de endotoxinas. El lipopolisacrido (LPS), un componente estructural de la
membrana externa de las bacterias Gram-negativas, tiene un efecto txico directo sobre
clulas de respuesta inflamatoria como leucocitos polimorfonucleares, clulas monocticas y
linfocitos T y B, alterando la produccin de una serie de citoquinas involucradas en la
respuesta inmunolgica. El LPS es uno de los principales inductores de fiebre en los
individuos con infecciones bacterianas en las vas urinarias superiores. Otros componentes
estructurales bacterianos, como fragmentos de pared celular y cidos teicoicos
provenientes de bacterias Gram-positivas, tienen efectos muy similares a los producidos
por el LPS de bacterias Gram-negativas.
103
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Diagnstico clnico:
Cistitis Disuria
Frecuencia
Urgencia
Poco volumen de orina
Incontinencia
Dolor suprapbico
Urocultivo:
Recuento del nmero de microorganismos presentes por mililitro de muestra (UFC/ml).
Identificacin del/de los microorganismo(s) aislados.
Prueba de susceptibilidad a los antibiticos.
Pacientes asintomticos:
Bacteriuria (1O~ UFC/mI) por una misma especie bacteriana detectada en dos urocultivos
en un lapso de 7 a 15 das.
No se da tratamiento con antimicrobianos a los individuos, con excepcin de pacientes
inmunosupresos y mujeres embarazadas por el riesgo de partos prematuros y mortinatos.
Pacientes sintomticos:
Pacientes con una primoinfeccin, definida como la primera infeccin en la vida o un
perodo superior a seis meses entre las infecciones. Se da tratamiento de rutina.
Pacientes con una infeccin a repeticin, definida como dos o ms infecciones en un
perodo igual o inferior a seis meses entre las infecciones. Se puede presentar una de
dos condiciones:
Reinfecciones, las cuales ocurren por agentes bacterianos diferentes. A estos
pacientes se les da un tratamiento de rutina y un tratamiento de profilaxis por un periodo
mnimo de seis meses. La mayora de los pacientes ( 80%) no presenta problemas de
fondo y aproximadamente un 20% de los pacientes tiene alteraciones funcionales o
104
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Para muestras de orina recolectadas por miccin se debe realizar una cuantificacin del
nmero de microorganismos presentes por volumen de muestra mediante recuento en medios
slidos, determinando el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de
muestra. Esta metodologa se puede aplicar a muestras de orina recolectadas por
cateterizacin, pero no se debe aplicar a aquellas muestras de orina recolectadas por puncin
suprapbica por cuanto se evita la contaminacin uretral o periuretral.
La orina puede ser un buen medio de cultivo para los diferentes microorganismos, tanto los
causantes de infecciones como los contaminantes provenientes de la uretra o de la regin
periuretral. Por lo tanto, las muestras de orina deben ser refrigeradas a 4C hasta por 24 horas
si no van a ser procesadas inmediatamente en el laboratorio.
Recoleccin de muestras de orino por miccin (orina con tcnica orina a medio chorro ,
orina de segundo chorro).
Se recomienda recolectar la primera orina de la maana siempre que sea posible, por
cuanto proporciona recuentos bacterianos ms altos luego de que las bacterias han sido
incubadas en la vejiga durante toda la noche.
No se debe forzar la recoleccin de la orina, por cuanto la muestra se puede diluir y se
pueden obtener recuentos falsamente ms bajos que 105 UFC/m1.
Debido a que es el mismo paciente quien recolecta su propia muestra de orina por miccin,
es fundamental instruir al paciente adecuadamente para la recoleccin de muestras de orina
por miccin, particularmente con respecto a la limpieza de los rganos genitales externos
femeninos. La explicacin para los pacientes debe ser clara y puede ser verbal y/o escrita. A
continuacin se da un ejemplo de las instrucciones que se les puede entregar a los pacientes:
105
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Las muestras de orina deben ser siempre recolectadas en frascos estriles con tapa de
rosca, rotulados adecuadamente. Los recipientes conteniendo la muestra deben estar
acompaados de una solicitud de anlisis con la informacin completa cuando llegan a la
recepcin del laboratorio. Se recomienda recolectar una muestra por da hasta un total de tres
muestras en tres das consecutivos en pacientes asintomticos.
La recoleccin por puncin suprapbica es una tcnica que puede ser realizada nicamente
por personal mdico. Para la recoleccin por puncin suprapbica se debe inicialmente
descontaminar y anestesiar la zona de la piel, para luego introducir una aguja (22) en la vejiga
106
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
La muestra de escogencia es la orina recolectada del tubo del catter a travs del puerto de
recoleccin. Para la recoleccin, se debe limpiar el puerto de recoleccin con un algodn
impregnado con etanol al 70%, insertar posteriormente una aguja (21) en el puerto y recolectar
la orina con la jeringa. La muestra se transfiere luego a un recipiente estril apropiado. La orina
recolectada de las bolsas as como las puntas de catter Foley son inapropiadas para el cultivo
microbiolgico. Durante la recoleccin de la muestra no se debe desconectar el tubo del catter
de la bolsa de recoleccin de orina.
6. Pruebas de tamizaje.
107
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Algunos de los mtodos de tamizaje, especialmente las tiras con enzimas, tienen baja
sensibilidad y se recomienda su utilizacin conjuntamente con otros mtodos de tamizaje. Se
pueden presentar resultados falsos positivos por sustancias interferentes presentes en la orina,
orina diluida, pH bajo, interpretacin subjetiva y por dejar las muestras de orina a 4C.
7. Mtodos microscpicos
Se han descrito varios mtodos microscpicos que pueden ser tiles en el diagnstico de
las infecciones del tracto urinario, particularmente cuando existe la presencia de bacteriuria
superior a i05 UFC/ml.
Deteccin de bacteriuria.
a. Tincin de Gram.
1. Colocar 10 l de la muestra de orina, bien mezclada pero sin centrifugar, sobre un
portaobjetos.
2. Permitir secar al aire sin esparcir sobre la superficie del portaobjetos.
3. Fijar la lmina al calor.
4. Teir por Gram.
5. Determinar y reportar el nmero de microorganismos por campo de inmersin.
6. La presencia de uno o ms microorganismos por campo de inmersin correlaciona con un
recuento de colonias de 105 UFC/ml.
7. La presencia de abundantes clulas escamosas y diferentes morfotipos microbianos son
indicativos de que la muestra ha sido probablemente contaminada durante la recoleccin.
En este caso, se debe solicitar una segunda muestra.
108
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Deteccin de piuria.
Como se indic anteriormente, cuando las muestras de orina son recolectadas por miccin
puede ocurrir la contaminacin de la muestra con bacterias habitantes de la uretra o de la
regin periuretral. Para descartar el aislamiento y la identificacin de una bacteria contaminante
como agente causal de una infeccin urinaria, se recomienda realizar un recuento del nmero
de UFC/ml de muestra de orina recolectada por miccin. Este criterio puede ser aplicado
tambin a las muestras de orina recolectadas por cateterizacin pero, sin embargo, no se
aplica cuando la muestra ha sido recolectada por puncin suprapbica, por cuanto se evita la
contaminacin uretral o periuretral.
Durante mucho tiempo se ha aceptado el criterio que si una persona sufre de una infeccin
urinaria o una bacteriuria asintomtica tendr un recuento de 105 UFC/ml de un solo
morfotipo colonial, dado que la mayora de las infecciones urinarias son causadas por un solo
tipo de microorganismo, mientras que una persona sin infeccin urinaria tendr un recuento de
<102 UFC/ml de dos o ms morfotipos bacterianos. Sin embargo, como se discute ms
adelante, si una persona con sintomatologa urinaria tiene un recuento de <105 UFC/ml, el
microorganismo aislado puede tener importancia clnica y no puede ser simplemente
descartado por haber resultado de un recuento ms bajo.
Procedimiento.
109
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
110
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
Tipo de Recuento
Sintomatologa Agentes
infeccin significativo
Fiebre, dolor en flancos,
Bacilos Gram-negativos
Pielonefritis escalofros, nuseas, cilindros 105
Staphylococcus aureus
leucocitarios
Asintomtica o disuria y Escherichia coli y otros
Cistitis 105
frecuencia bacilos Gram-negativos
Prostatitis Dolor dorsal, fiebre, escalofros Bacilos Gram-negativos 105
Escherichia coli
Uretritis Disuria y frecuencia Staphylococcus 105
saprophyticus
Condicin/Tipo de
Recuento Organismos Procedimiento a seguir
muestra
Dos morfotipos
Identificacin y PSA
105 coloniales
Orina por miccin
Posible contaminacin.
Sintomatologa positiva
Ms de dos Reportar posible
morfotipos coloniales contaminacin y solicitar
nueva muestra
Dos morfotipos
Identificacin y PSA
coloniales
Orina por
104 cateterizacin Posible contaminacin.
Sintomatologa positiva Ms de dos Reportar posible
morfotipos coloniales contaminacin y solicitar
nueva muestra
Orina por
Cultivo puro Identificacin y PSA
10 cateterizacin
Hombre sintomtico Cultivo puro Identificacin y PSA
Cualquier nmero de
Puncin suprapbica Identificacin y PSA
morfotipos
10
Cultivo puro de bacilo
Mujer sintomtica Identificacin y PSA
Gram-negativo
111
Bacteriologa Diagnstica Urocultivos
9. Cronograma de actividades
Da 1
Entrega de muestras de orina para urocultivo.
Realizar tincin de Gram.
Realizar dilucin 1:1000 de la muestra de orina como se describe anteriormente.
Sembrar en agar sangre y MacConkey.
Incubar a 35 C por 24 horas.
Da 2
Observar morfologa colonial.
Realizar la tincin de Gram de colonias.
Subcultivar en ATS y agar sangre.
Realizar caracterizacin bioqumica segn corresponda al grupo bacteriano.
Da 3
Continuar pruebas bioqumicas.
Leer los resultados.
Mantener en ATS para realizar PSA.
10. Referencias
Kass, E. H. 1956. Asymptomatic infections of the urinary tract. Trans. Assoc. Am. Phys. 69:56-
63.
Pezzlo, M. 1995. Urine culture procedure, section 1.17 In H. D. Isenberg (editor), Clinical
Microbiology Procedures handbook, Vol. 1. American Society for Mcrobiology
Press.Washington.
112
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
XIV
PROCESAMIENTO DE COPROCULTIVOS
1. Consideraciones generales
El tracto gastrointestinal contiene una flora normal bacteriana muy amplia y diversa. Aun
cuando la acidez del estmago previene la colonizacin, muchas especies pueden sobrevivir al
pasaje por el estmago y se convierten en flora residente del tracto gastrointestinal bajo.
Normalmente el intestino delgado contiene una flora escasa (estreptococos, lactobacilos y
levaduras, de 101 a 103 /ml), pero conforme se alcanza el leon distal, los recuentos se
aproximan a 106 - 107 /ml, y se encuentran enterobacterias y Bacteroides spp.
Los bebs son colonizados en las primeras horas de nacido por bacterias de la flora normal
epitelial, particularmente estafilococos, corinebacterias, bifidobacterias, clostridios, lactobacilos
y estreptococos. Con el tiempo, el contenido de la flora intestinal cambia. La flora normal del
intestino grueso del adulto comprende principalmente especies anaerobias, como Bacteroides,
Clostridium, Bifidobacterium, Eubacterium y Peptostreptococcus. La razn de especies
anaerobias a aerobias, que incluyen enterobacterias, enterococos y otros estreptococos, es de
1000:1. El 80% del peso seco de heces de un adulto normal consiste en bacterias, las cuales
son principalmente anaerobias (10 11-12/g) y aerobias (E. coli, 108/g, Proteus, Klebsiella,
enterococos y otras especies, 105-7/g).
Despus de una terapia antimicrobiana, el intestino grueso puede ser colonizado por
patgenos nosocomales, tales como Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Candida albicans, y bacilos Gram-negativos resistentes, lo cual influencia la flora de cualquier
infeccin intraabdominal subsecuente.
Las neurotoxinas usualmente se ingieren como toxinas preformadas que actan sobre el
sistema nervioso autnomo (enterotoxina b, toxina emtica) o en las uniones
neuromusculares (toxina botulnica). Las enterotoxinas, por su parte, poseen un efecto
directo sobre la mucosa intestinal que estimula en forma potente la secrecin de fluidos.
Estas actan principalmente sobre el yeyuno y el leon proximal, donde se lleva a cabo la
mayor parte del transporte de fluidos. Finalmente, las citotoxinas actan destruyendo la
estructura de las clulas intestinales individuales. Cuando estas clulas son destruidas, se
desprenden de la superficie de la mucosa, dejndola desprotegida y con las funciones de
absorcin o secrecin daadas. Adems, la destruccin epitelial despierta una fuerte
respuesta inflamatoria que acenta el dao tisular (disentera).
113
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
Citotoxinas
Escherichia coli EH (SLTI y Destruccin
Carne
SLTII) celular
Clostridium diffcile (A y B) Carne Inflamacin
114
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
histolytica y Balantidium coli invaden el epitelio del colon y causan disentera. Otros
parsitos adquiridos por ingestin, como Trichinella y Schistosoma, pueden causar diarrea
sanguinolenta transitoria por su paso por la mucosa hacia otros sitios del organismo.
Las bacterias que invaden las clulas epiteliales tambin producen sntomas
disenteriformes. Los agentes ms comunes son Shigella y E. coli enteroinvasiva. Las
bacterias penetran la capa superficial de la mucosa, y rara vez alcanzan el torrente
circulatorio. Otras bacterias no solo invaden la mucosa sino que penetran los vasos
sanguneos de la submucosa y se diseminan sistmicamente. Salmonella typhi y S.
cholerasuis son agentes etiolgicos de fiebre entrica, cuadros sistmicos caracterizados
por fiebre, cefalea, vmitos y constipacin. La invasividad contribuye a la patognesis de la
enfermedad causada por otros serotipos de Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio
parahemolyticus, Campylobacter jejuni, C. fetus, Plesiomonas shigelloides, Edwardsiella
tarda y, posiblemente, Clostridium difficile.
IV. Adhesin a mucosa intestinal, alterando las funciones normales de absorcin y secrecin.
La capacidad adherente de Vibrio cholerae as como de varias cepas de E. coli ha sido
extensamente estudiada, y se han descrito factores de colonizacin antignicos (CFA),
expresados en adhesinas tipo fimbrias o fibrillas. La adhesin le permite a las bacterias
colonizar y secretar sus toxinas cerca de las clulas epiteliales. Por otra parte, los cuadros
diarreicos producidos por Giardia, Cryptosporidium, Isospora y Microsporidium se asocian
en parte a su capacidad de adherirse al epitelio intestinal.
Las enfermedades diarreicas son una causa mucho mayor de morbilidad y mortalidad que
las enfermedades ms comunes de la sociedad industrializada (cardiopatas, cncer y
accidentes cerebrovasculares), siendo los lactantes y nios pequeos los ms afectados, en
especial con malas medidas sanitarias y una alimentacin deficiente. La diarrea infecciosa
aguda es causada por un nmero de agentes diferentes: bacterias, virus y protozoarios. El
laboratorio clnico rutinariamente busca las bacterias que ms comnmente causan diarreas,
sin embargo, se requiere la colaboracin del mdico para asegurar la bsqueda precisa de un
agente particular. Por consiguiente, se debe obtener una historia clnica completa, que incluya
los sntomas del paciente, hora de iniciacin, edad, historia de viajes, consumo de alimentos y
tratamiento con antimicrobianos. Cada microorganismo posee mecanismos patognicos nicos
que causan una serie de sntomas, los cuales pueden ser clasificados inicialmente (Cuadro 2).
Sin embargo, debe tenerse siempre presente que los microorganismos no se adhieren
estrictamente a estas categoras.
115
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
Muestras aceptables.
Muestras inaceptables.
Las muestras que no deben aceptarse, se rigen por los siguientes criterios:
Recoleccin de la muestra.
Para la recoleccin de las muestras se deben de seguir las siguientes recomendaciones:
Preservacin y transporte.
Las muestras fecales que no se pueden inocular directamente en los medios de cultivo se
pueden preservar a 4 6C en:
Buffer salino de glicerol (partes iguales de buffer salino de fosfatos 0.033 M pH 7.0 y
glicerol) recomendado para Salmonella sp. y Shigella sp., pero no para Campylobacter sp. y
Vibrio sp., a menos que sea enriquecido con CaC12 (100 mg/l).
116
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
Medio de transporte Cary-Blair, apropiado para Vibrio spp. y Campylobacter spp, pero no es
tan efectivo para recuperar Shigella sp. y es inapropiado para Clostridium difficile. Algunos
autores recomiendan reducir el contenido de agar de 0.5% a 0.16% para el mantenimiento
de Campylobacter spp.
Muestras para estudio por C. difficile se deben congelar a -200C hasta su procesamiento.
Hisopados rectales pueden transportarse alternativamente en un caldo Gram negativo
(GN).
Contenidos de duodeno, colostomas o ileostomas se transportan en viales.
Biopsias rectales se transportan en contenedores estriles con agua destilada, no sumergir
en formalina.
Medios de enriquecimiento.
Caldo Gram-negativo (GN): contiene desoxicolato de sodio, citrato, manitol. Medio poco
selectivo, apropiado para Shigella spp. y Salmonella spp.
Caldo selenito F: contiene selenito de sodio. Medio altamente selectivo para Salmonella
spp.
Caldo tetrationato: contiene tiosulfato de sodio, sales biliares y carbonato de calcio. Debe
agregarse 0.1 ml/tubo de solucin yodo-yoduro antes de inocular la muestra. Medio
altamente selectivo para Salmonella spp.
Agua peptonada alcalina (pH 8.6): apropiado para Vibrio cholerae.
117
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
4. Procedimientos.
Examen directo.
Un examen al fresco de una muestra de heces sin teir es til para detectar parsitos y, con
experiencia, las formas curvas y con movilidad en dardo de Campylobacter y Vibrio cholerae a
partir de heces frescas. Estos ltimos se pueden observar mejor en microscopios de campo
oscuro o contraste de fases.
2. Tincin de Gram.
Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar una tincin de Gram. Observar
predominio de polimorfonucleares, levaduras, cocos Gram-positivos o bacilos Gram-
118
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
negativos, lo cual puede sugerir una infeccin por Candida, S. aureus o Pseudomonas,
respectivamente. El predominio de bacilos Gram-positivos largos, rectos y con paredes
paralelas puede sugerir sobrecrecimiento de Clostridium difficile, aun cuando no es una
prueba totalmente confiable de la infeccin. La tincin de Gram modificada con fucsina
bsica al 0.1% permite la observacin de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de
coma, ese (S) o en alas de gaviota, sugestivo de infeccin por Campylobacter spp.
Adems, puede usarse una tincin de Giemsa para buscar protozoarios relacionados con
cuadros diarreicos.
Con el fin de aumentar la probabilidad de aislar alguno de estos agentes se pueden utilizar
los siguientes caldos:
Caldo GN: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35C estrictamente por 4 a 6
horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos.
Caldo Selenito F y caldo tetrationato: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a
35C por 12 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos.
Las placas se inoculan directamente con una asada de la muestra de heces, con el hisopo
rectal o del medio de transporte, o a partir de los caldos de enriquecimiento, se rayan con asa y
se incuban a 35C por 18-24 h. Las colonias que se deben buscan son lactosa negativa con o
sin H2S, las cuales se inoculan por picadura y/o rayado a TSI y urea (puede inocularse adems
otros medios similares, como LIA y SIM). De acuerdo con la reaccin bioqumica, que se
muestra en el cuadro 4, se procede a la identificacin bioqumica completa y serolgica.
119
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
120
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
La identificacin presuntiva de las colonias incluye una tincin de Gram modificado con
fucsina bsica al 0.1% y la observacin de las formas de S o en alas de gaviota. La prueba de
oxidasa debe ser positiva y se puede observar la movilidad en dardo resuspendiendo el
microorganismo en un caldo Mueller-Hinton y observando a 40X entre porta y cubreobjetos.
Las principales pruebas bioqumicas de diferenciacin se muestran en el cuadro 6.
121
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
Las placas se incuban a 35C por 24 horas en aerobiosis. Investigar las placas por colonias
con o sin hemlisis beta que no sean Pseudomonas y realizar prueba de oxidasa, la cual debe
ser positiva. En el medio MAC o EMB se obtienen colonias lactosa negativa.
122
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
Por consiguiente, el clnico debe basarse en los sntomas y la historia clnica para solicitar
un estudio por un serotipo especfico de E. coli, y someter toda muestra de heces con sangre a
anlisis por ECEH.
123
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
5. Reporte de resultados
Cultivos negativos.
Reportar No se aisl Salmonella, Shigella, Campylobacter, etc., mencionando
todos los microorganismos utilizados en el tamizaje.
No reportar No patgenos entricos, porque es muy ambiguo y puede conducir a
equivocaciones.
Cultivos Positivos.
Si hay sobrecrecimiento de S. aureus, P. aeruginosa o Candida spp., reportar
predominancia o cultivo puro de (gnero y especie si es posible)
Reportes presuntivos de Salmonella y Shigella: de acuerdo con el resultado de las
pruebas bioqumicas preliminares y la reaccin serolgica (por ej., aglutinacin positiva
en un serogrupo), puede reportarse de la siguiente manera:
Resultado Reportar
Salmonella sp. que aglutina en un grupo Salmonella grupo X. Confirmacin pendiente.
especfico
Salmonella typhi Salmonella typhi. Confirmacin pendiente.
Salmonella sp. que no aglutina en ningn Organismo identificado bioqumicamente como
grupo Salmonella. Confirmacin pendiente.
Shigella, grupo A Shigella dysenteriae. Confirmacin pendiente.
Shigella, grupo B Shigella flexneri. Confirmacin pendiente.
Shigella, grupo C Shigella boydii. Confirmacin pendiente.
Shigella, grupo D Shigella sonnei
124
Bacteriologa Diagnstica Coprocultivos
6. Cronograma de actividades.
Da 1.
Se reciben las muestras de heces para su procesamiento.
Se observa su consistencia y se anota
Se siembran las siguientes placas de medios slidos:
o MacConkey
o SS
o TCBS
o EMB-Levine
o Hektoen
Da 2
Realizar tincin de Gram
Sembrar TSI
Realizar las pruebas bioqumicas segn cepa.
Da 3
Leer pruebas e identificar la bacteria.
Mantener en ATS.
7. Referencias.
1. Baron, E. J., L. R. Peterson, and S. M. Finegold. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology,
Ninth Edition. 1994. Mosby: St Louis. MO.
2. Grasmick, A. Processing and Interpretation of Bacterial Fecal Cultures, Section 1.10. En:
Isenberg, H. D. Clinical Microbiology Procedures Handbook.Vol. 1. 1992. American Society
for Microbiology: Washington, D.C.
4. Murray, P. R. (Ed.). Manual of Clinical Microbiology, Sixth Edition. 1995. American Society
for Microbiology: Washington,D.
125
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
XV
PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS
1. Consideraciones generales
126
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
127
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
La porcin lipdica del LPS, o lpido A, es capaz de mediar una serie de reacciones
sistmicas en las que participan componentes celulares del sistema inmune, tales como
monolitos-macrfagos y neutrfilos, productores de citoquinas de accin inflamatoria, como
factor de necrosis tumoral o interleucina-1, y componentes humorales, como el sistema de
complemento y algunos factores de la coagulacin. De la misma manera, las bacterias Gram-
positivas, carentes de LPS, son capaces de iniciar sndromes similares, mediante la accin de
toxinas de diverso origen y mecanismo de accin, as como por la liberacin de componentes
de pared celular, entre los que se encuentran el peptidoglican y los cidos lipoteicoicos. La
gravedad del sndrome asociado a las bacteremias, indicado por su alta tasa de mortalidad,
depende de las condiciones concomitantes. La sepsis continua siendo una emergencia mdica
de difcil manejo clnico, el cual se esquematiza en el cuadro 3.
128
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
Los causantes primarios de endocarditis infecciosa son los estreptococos viridans, que
incluyen varias especies. Estos organismos son habitantes normales de la cavidad oral o del
tracto gastrointestinal, y a menudo ganan acceso al torrente circulatorio a travs de gingivitis,
periodontitis, o manipulaciones dentales. Las vlvulas cardiacas, especialmente aquellas que
han sido previamente daadas, presentan superficies apropiadas para la adhesin de estas
bacterias. Las vegetaciones resultantes provocan la diseminacin hematgena de bacterias a
una tasa lenta pero constante. La identificacin bioqumica de los estreptococos podra tener
utilidad, ya que ciertas especies, como Streptococccus anginosus, se han asociado con una
mayor frecuencia a la formacin de abscesos metastsicos. S. sanguis y S. mutans son los
agentes ms frecuentes de endocarditis estreptocccica. Otros microorganismos causantes de
endocarditis con bacteremia asociada estn incluidos en el cuadro 4.
129
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
130
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
2. Recoleccin de la muestra.
Las precauciones universales requieren que los flebotomistas usen guantes durante el
procedimiento.
Venipuncin.
a) Limpiar el rea de puncin con alcohol 70% (isoproplico o etlico).
b) Empezando en el centro del sitio, limpiar concntricamente con tintura de yodo 1 a 2%
por 30 seg.
c) Dejar secar. No tocar el rea antes de sangrar.
d) Desinfectar la tapa de las botellas con alcohol o yodo y dejar secar.
e) Insertar la aguja en la vena una sola vez y obtener la sangre. No cambiar la aguja antes de
inyectar la sangre en la botella. Utilizar una nueva aguja si se falla la vena.
f) Inocular el medio de cultivo con anticoagulante.
g) Agregar suficiente volumen de sangre para obtener una razn de 1:10 de sangre a medio
de cultivo.
h) Mezclar bien la sangre para evitar coagulacin.
i) Despus de sangrar limpiar el rea con alcohol de 70% para remover el exceso de yodo lo
que podra causar irritacin en algunos pacientes.
Volumen de muestra.
Volumen recomendado
a. Nios: 1 a 5 ml de sangre por venipuncin
b. Adultos: 10 a 30 ml de sangre por venipuncin
131
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
En el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, artritis, neumona aguda sin tratamiento o
pielonefritis.:
Obtener 2 muestras de sangre de dos sitios diferentes antes de empezar el tratamiento.
Materiales
Anticoagulante.
132
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
Sistemas automatizados
La introduccin al mercado de sistemas de hemocultivos de lectura continua,
automatizados y computarizados representa uno de los ms significativos avances en la
microbiologa clnica de los ltimos 5 a 10 aos. Los sistemas BacT/Alert (BioMerieux),
BACTEC 9240/9 120 y ESP (VersaTrek), han sido aprobados por FDA para su uso en
laboratorios clnicos en Estados Unidos. Los principios del funcionamiento de estos sistemas, y
sus ventajas y/o desventajas comparativas con otros sistemas comerciales se resumen en el
cuadro 5.
133
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
3. Procedimientos.
Consideraciones generales
Sistemas manuales.
l. Medios convencionales.
a) Colectar sangre e inocular en medio lquido con anticoagulante.
b) Aadir sangre de manera que la dilucin quede 1:10 de sangre por medio.
c) Incubar a 35C por 7 das.
d) Optativamente, puede agitarse la botella en forma continua durante las primeras 24 horas.
e) Inspeccionar las botellas visualmente por lo menos una vez al da. En el cuadro 6 se
indican algunos signos de crecimiento microbiano en botellas de hemocultivo.
f) Hacer tincin de Gram y subcultivos de las botellas a las 6, 18 horas y a las 48 horas y un
ltimo reporte a los 6 das, para confirmar un cultivo negativo.
134
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
positivos. Por lo tanto, se deben inocular por rayado las placas para obtener colonias
aisladas.
d) Incubar las placas de agar chocolate en 5 a 10% de CO2 a 35C por 48 h.
Reporte verbal.
Reporte escrito.
a) Proveer una copia de todos los resultados preliminares (no crecimiento o positivos por
Gram).
b) Proveer una copia de los resultados finales.
c) Indicar la duracin de la incubacin en los reportes negativos: No crecimiento a los 7
das
d) Reportar identificacin y antibiograma de los cultivos positivos.
Brucelosis.
Brucella spp. son patgenos de clase III, por lo tanto las muestras deben manejarse en una
cmara de bioseguridad. En algunos casos, solamente los cultivos de mdula sea resultan
positivos.
a) Preferiblemente utilizar medios bifsicos o Isolator. Para medios lquidos, inocular caldo
tripticasa- soya o Brucella con 5 a 10% de CO2. Incubar a 37C.
b) Si se utilizan medios bifsicos, ventilar las botellas como se describi anteriormente.
c) Inspeccionar botellas cada 48 a 96 horas. Subcultivar botellas visualmente negativas y
hacer subcultivos cada semana por 4 semanas.
d) Los subcultivos deben hacerse a placas de agar sangre con base de caldo Brucella o
infusin cerebro-corazn, e incubar con 10% de CO2 a 37C por un mnimo de 3
semanas.
Leptospirosis.
La leptospirosis puede diagnosticarse mediante el aislamiento de la espiroqueta de la
sangre durante los primeros 4 a 7 das de enfermedad. Los medios recomendados son el
medio Fletcher, Tween 80-albmina (TA-80), o el medio semislido Ellinghausen, McCullogh,
Jonson, Harris (EMHJ), a los cuales se agrega hasta 14% (vol/vol) de suero de conejo.
a) Colocar 5 ml del medio de Fletcher y/o medio TA-80 en cada uno de 6 tubos.
b) A 2 tubos de cada medio, aadir una gota de sangre.
c) A 2 tubos de cada medio, aadir 2 gotas de sangre.
d) A 2 tubos de cada medio, aadir 1 gota de sangre que ha sido diluida 1:10 en una
135
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
a) Medios especiales:
Caldo Middlebrook 7H9 con 0.05% SPS.
Caldo infusin cerebro-corazn con Tween 80, con o sin agar inclinado Middlebrook
7H11.
Septi-Chek bifsico.
Isolator.
b) Sistemas automatizados:
BACTEC, ESP II, BacT/Alert
El uso de mtodos manuales rpidos como Septi-Chek o Isolator, junto con los sistemas
automatizados, ha disminuido significativamente el tiempo de deteccin de cultivos positivos
por micobacterias. La sangre puede permanecer en los tubos de Isolator por periodos
prolongados sin disminuir la recuperacin de M. avium, lo que facilita su transporte y
procesamiento.
4. Cronograma de actividades.
Da 1
Se recolectan las muestras de sangre y se rotulan con nombre y apellidos de la persona
que tom la muestra, quien ser el o la responsable exclusivo(a) de la calidad de la misma.
Da 2
Entrega de los hemocultivos.
Realizar la observacin macroscpica del hemocultivo.
Subcultivar en:
Agar sangre
Agar chocolate
Realizar la tincin de Gram.
Da 3
Observar la morfologa colonial.
Mantener en ATS.
Realizar identificacin hasta gnero y especie.
136
Bacteriologa Diagnstica Hemocultivos
5. Referencias.
137
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
XVI
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS
1. Introduccin
Normas generales
En la mayora de las infecciones, las muestras de tejido o material aspirado con jeringa y
aguja son las ptimas para el aislamiento de organismos infecciosos.
El material aspirado con aguja y jeringa es preferible al recolectado con hisopos.
La superficie de la piel debe ser desinfectada apropiadamente antes de recolectar el
espcimen, para minimizar la contaminacin externa.
Los hisopos deben ser enviados en un medio de transporte adecuado, tal como Stuart o
Amies, en recipientes estriles. Los hisopos secos son inaceptables.
El transporte de las muestras al laboratorio debe ser inmediato.
Todas las muestras deben de estar debidamente rotuladas, con hora y fecha de
recoleccin, as como datos demogrficos del paciente.
Deben hacerse el mayor esfuerzo en recolectar especimenes de la mejor calidad posible.
Las muestras que se entregan con mucho atraso, o que contienen flora de piel
contaminante generan informacin confusa y prdida de valiosos recursos del laboratorio.
Se debe solicitar una nueva muestra cuando se presenten muestras inapropiadas, y
guardar todos los especimenes, ya que las nuevas recolecciones no siempre son posibles.
138
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
139
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
Consideraciones generales.
a) Inocular las muestras en agar sangre, medios selectivos para aerobios Gram-negativos y
Gram-positivos (por ej., MacConkey, Manitol-Sal), medios enriquecidos como agar
chocolate, y un medio lquido para recuperar organismos en muy bajo nmero.
b) Las muestras recibidas en hisopos se emulsifican en 0.5 ml de caldo (CTS, Brucella, etc.) y
se inoculan del caldo los medios primarios y lminas para tincin de Gram.
c) Las muestras recibidas en jeringa se inoculan directamente en los medios y lminas, tan
rpido como sea posible. Asimismo, se pueden inocular medios de transporte y cultivo
anaerobios.
d) Las infecciones de tejidos subcutneos, fascias y msculos a menudo estn asociadas a
sepsis, por lo que los hemocultivos son obligatorios.
Tincin de Gram.
a) Preparar frotis de las muestras y observar el nmero de neutrfilos o histiocitos-macrfagos
(indicadores de infeccin) y clulas epiteliales escamosas (contaminacin superficial), as
como las cantidades relativas de los diferentes microorganismos.
b) Reportar los resultados inmediatamente.
c) Determinar la necesidad para procedimientos adicionales, tales como cultivo por hongos o
anaerobios, y la necesidad de medios o tcnicas especiales.
d) Antes de reportar los resultados finales del cultivo, correlacionar las observaciones de la
tincin directa de Gram con el cultivo. Aislar e identificar todas las especies presentes en
cantidades significativas en las muestras recolectadas y transportadas adecuadamente.
Medios especiales.
a) La mayora de los patgenos potenciales de piel y tejidos subcutneos crecen
satisfactoriamente en los medios de rutina. Inocular las muestras en medios enriquecidos
como el agar chocolate para cultivar organismos fastidiosos por sospecha clnica.
b) Listeria monocytogenes requiere enriquecimiento en fro para favorecer el aislamiento a
partir de placenta y otros tejidos. Una porcin del espcimen debe colocarse en un
refrigerador a 40C por 4 semanas o ms, y subcultivar semanalmente en agar sangre a
35C.
c) Si existe sospecha clnica de infeccin por Nocardia o Mycobacterium spp., se deben incluir
medios apropiados, tales como Lowenstein-Jensen o Middlebrook 7H9.
Consideraciones generales.
a) Examinar los cultivos por crecimiento a las 24 y 48 h.
b) Incubar los cultivos con estudio por organismos fastidiosos por 5 das adicionales.
c) Reportar los resultados preliminares en todos los cultivos a las 24 h, y actualizar o reportar
finalmente a las 48 h.
d) Reportar resultados finales a los 7 das o bien, cuando la identificacin y el antibiograma
estn listos.
e) Mantener los medios lquidos por 7 das.
140
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
Da 1 (24 h)
a) Examinar todos los medios slidos y lquidos por crecimiento.
b) Si no hay crecimiento, reportar No-crecimiento en da 1 o No-crecimiento en < 24 h.
c) Si hay crecimiento, anotar las caractersticas y cantidad de cada tipo colonial.
d) Realizar tincin de Gram en cada colonia sospechosa.
e) Realizar pruebas rpidas, y preparar suspensiones para paneles de identificacin
(manuales o automatizados), as como pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos.
f) Si hay crecimiento solo en el caldo, realizar una tincin de Gram.
g) Reportar los resultados preliminares en todos los cultivos.
h) Reincubar todos cultivos en progreso.
Da 2 (48 h).
a) Observar todos los cultivos, y evaluarlos por crecimiento.
b) Interpretar y anotar los resultados de los subcultivos, pruebas de identificacin y de
sensibilidad a antibiticos.
c) Si hay nuevo crecimiento en los medios negativos a las 24 h, realizar las pruebas
adicionales apropiadas.
d) Reportar los resultados actualizados o finales en los cultivos positivos.
e) Reincubar los caldos o los cultivos negativos por 3 a 5 das adicionales.
f) Guardar las placas positivas, selladas con cinta adhesiva, a temperatura ambiente hasta
completar todas las pruebas disponibles.
Notas adicionales.
Realizar solo aquellos procedimientos que produzcan la informacin clnicamente ms
relevante en el menor tiempo posible.
Proveer guas y procedimientos de recoleccin al personal mdico para evitar la
contaminacin de las muestras con flora indgena de la piel y zonas adyacentes a la
lesin.
Distinguir microorganismos normales o contaminantes de piel de los patgenos
potenciales con el mnimo gasto o esfuerzo posible.
Proceder a identificar los patgenos potenciales a partir de muestras recolectadas
apropiadamente.
A menos que sea solicitado especficamente por el clnico, los cultivos mixtos (ms de
tres patgenos potenciales, ninguno predominante) no deben ser procesados
exhaustivamente en forma rutinaria, ya que proveen poca informacin clnicamente til.
Los especimenes en hisopos pueden contener ms contaminantes de piel y
colonizadores no patognicos que aquellos aspirados con jeringa y aguja.
El nivel del procesamiento depende de varios factores, tales como la fuente de la
muestra, el mtodo de recoleccin y los resultados de la tincin de Gram. Consultar con
el clnico para esclarecer la necesidad de realizar una identificacin definitiva
cuestionable.
141
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
6. Cronograma de actividades.
Da 1
Entrega de muestras de secreciones.
Subcultivar en:
Agar sangre
Agar chocolate
Agar MacConkey
Realizar la tincin de Gram.
Da 2
Realizar la descripcin colonial.
Realizar la tincin de Gram de colonias.
Realizar caracterizacin bioqumica segn corresponda al grupo bacteriano.
Da 3
Mantener en ATS.
Realizar identificacin hasta gnero y especie.
7. Referencias.
1. Forbes, B. A., D. F. Sahm, and A. 5. Weissfeld. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology,
Tenth Edition. 1998. Mosby: St Louis. MO.
142
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
3. Mandell, U., R. G. Douglas, Jr., and Bennett, J. E., editors. Principles and practice of
infectious diseases, 5th edition, 1997. Churchill Livingstone, New York.
4. Murray, P. R. (Ed.). Manual of Clinical Microbiology, Sixth Edition. 1995. American Society
for Microbiology: Washington,D.C.
5. Processing of skin and subcutaneous-tissue specimens, Section 1.16. En: Isenberg, H.D.
Clinical Microbiology Procedures Handbook.Vol. 1. 1992. American Society for
Microbiology: Washington, D.C.
143
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
APENDICE A
MEDIOS DE CULTIVO
Despus de autoclaver el medio, se debe enfriar a 45-50 0C, se agrega sangre desfibrinada
de conejo, humana, ovina o bovina (para la prueba de CAMP) a concentracin final del 5-10% y
mezclar. Se pueden usar otras bases como agar tripticasa saya, agar infusin cerebro corazn,
agar Columbia (para Campylobacter y Helicobacter), agar Brucella, etc.
144
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
Despus de autoclavar el medio se debe enfriar a 45-50 0C y se agrega 500 ml de una solucin
de hemoglobina al 2% y 10 ml de una solucin de suplementos V y X (l00x).
145
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
146
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
147
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
148
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
149
Bacteriologa Diagnstica Piel y tejidos blandos
150