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Tierra Tropical (2010) 6 (2): 191-199

ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA


MULTIPLICACIN in vitro DE BAMB (Guadua angustifolia): FASE 1
M.R. Mendoza, A.C. Tamayo,1 A. Pacheco
Universidad EARTH
Las Mercedes de Gucimo, Limn, Costa Rica
Recibido 28 de noviembre 2009. Aceptado 15 de julio 2010.

RESUMEN
A nivel mundial existe una diversidad de especies de bambes a las que se atribuyen mltiples
atributos. En este proyecto se investig sobre Guadua angustifolia con el objetivo de establecer
un protocolo de propagacin in vitro fase I que facilite la obtencin de plantas sin
contaminacin. Se utilizaron metodologas de desinfeccin ya establecidas, haciendo
modificaciones para favorecer la obtencin de plantas sanas. El material vegetativo utilizado fue
proveniente de yemas apicales con carcter embriognico, con distancias de 1 cm entre el nudo y
el corte. Durante el proceso se realizaron 17 tratamientos que en su mayora generaron resultados
con contaminacin alta. Se obtuvo un tratamiento positivo donde los explantes se sometieron a
un producto agroqumico a base de benomilo 2 g/L y estreptomicina 2 g/L por 30 min,
hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min, 24 h en agua destilada estril y otra desinfeccin con
hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min. Adems, se evaluaron cuatro diferentes medios de
cultivo donde se suplement con N-benzylaminopurina (BAP) con concentraciones de 0 mg/L,
1 mg/L, 3 mg/L y 5 mg/L, de los cuales no generaron brotacin en los explantes de bamb sino
que la concentracin inductora fue de 6 mg/L de BAP. El protocolo generado se puede utilizar
como una alternativa para mejorar la propagacin in vitro de G. angustifolia.
Palabras clave: desinfeccin, fase I, Guadua angustifolia, multiplicacin in vitro.

ABSTRACT
There is a vast diversity of bamboo species throughout the world. In this project, phase I in vitro
multiplication of Guadua angustifolia was investigated, applying modifications to already
existing disinfection protocols to find the most suitable conditions to obtain of contaminant-free
plants. Vegetative material was harvested from embryogenic, apical buds of mature plants and
cut approximately 1 cm from each node. During the process, 17 different modifications on
disinfection protocols were tested, most of which resulted in high levels of contamination.
However, the solution with 2 g/L of benomyl and 2 g/L of streptomycin for 30 min, 2 % sodium
hypochlorite for 30 min, 24 h incubation in sterile, distilled water followed by final 30 min
disinfection in 2% sodium hypochlorite showed promising results. Different media supplemented
with N-benzylaminopurine (BAP) were also evaluated at 0 mg/L, 1 mg/L, 3 mg/L and 5 mg/L,
none of which induced budding in the explants. At 6 mg/L de BAP, however, budding was
induced. The protocol generated in this study can be used as an alternative for in vitro
multiplication of G. angustifolia.
Key words: disinfection, phase I, Guadua angustifolia, in vitro multiplication.

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Contacto: Ana Cristina Tamayo (atamayo@earth.ac.cr)

ISSN: 1659-2751
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INTRODUCCIN
El bamb es un recurso renovable que proporciona gran diversidad de productos forestales, los
cuales juegan un papel importante en la economa a nivel mundial (Mercedes, 2006). A nivel
mundial existen unas 1500 especies de bamb, distribuidas mayormente en los continentes
americano y asitico (Bystriakova et al., 2004).
Dentro de las especies que se encuentran en Amrica, la especie de mayor importancia es
Guadua angustifolia. Esta especie crece naturalmente en Colombia, Ecuador y Venezuela, pero
ha sido introducida a Centro Amrica, islas del Caribe, Hawai y Asia (Espinosa, 2003).
G. angustifolia es un bamb espinoso perteneciente a la familia Poacecae, a la sub-familia
Bambusoideae, a la tribu Bambuseae, subtribu Guaduinae y que presenta biotopos como cebolla,
macana y rayada. Morfolgicamente est compuesta por la vaina que es la parte amplia que se
adhiere al nudo y por la lmina. Tiene dos tipos de yemas, auxiliares y las nodales. Las yemas
auxiliares se localizan en la axila de las hojas de las ramas superiores e inferiores y las yemas
nodales en la parte superior del nudo. Los dos tipos de yemas son de origen embriognico y son
fisiolgicamente activas. Estas yemas por tener totipotencia y conservar caractersticas
hereditarias se pueden utilizar para la propagacin in vitro (Giraldo y Sabogal, 1999).
La propagacin in vitro tambin es llamada micropropagacin, se refiere a las tcnicas aplicadas
en propagacin de tejidos a partir de pequeas partes de la planta que crecen de forma asptica
en tubos o recipientes cerrados. El cultivo de tejidos est basado en principios, como
totipotencia, regulacin hormonal, el control y manipulacin de los procesos (Hartmann et al.,
1990).
Los mtodos convencionales de propagacin de bamb en forma sexual y asexual presentan
problemas en la multiplicacin a gran escala. La propagacin sexual se requiere de semillas y la
produccin de semillas se presenta de los 30 a 60 aos de su ciclo de vida (Mishra et al., 2008);
adems, la viabilidad de la semilla es muy baja y su tiempo de germinacin es prolongado. Por
otro lado, si la propagacin se realiza de forma asexual, existe la posibilidad de diseminar
enfermedades, el tiempo de recuperacin de la planta para su crecimiento es alto y el desarrollo
es lento, aspecto que no permite una efectiva propagacin.
La propagacin de bamb in vitro requiere de un establecimiento asptico del cultivo, que se
logra desde la obtencin del explante en campo. El explante de 2 cm resultante la poda, se
desinfecta con hipoclorito de sodio al 1,5 % y alcohol al 70 %. En casos, donde la contaminacin
inicial es severa, se realiza una pre-esterilizacin con una mezcla de Agrimycin y Benomyl a una
dosis de 2 g/L cada uno (Jimnez y Guevara, 2007).
Los resultados en los mtodos de propagacin de tejidos por medio de embriognesis somtica
en plantas adultas de bamb han generado baja respuesta de establecimiento en los cuartos de
crecimiento que implica generar estrategias que permitan reducir la mortalidad de las plantas
(Brias, 2008). Considerando la problemtica de la propagacin sexual y asexual del bamb G.
angustifolia se realiz la propagacin in vitro con la finalidad de establecer de plantas libres de
patgenos. Para multiplicar G. se necesitan de tres conceptos de propagacin in vitro propuestos
por Murashige en 1974, el establecimiento asptico del cultivo, su multiplicacin y el
enraizamiento y preparacin del inoculo para su transplante al suelo (Roca y Mroginski, 1993),
pasos conocidos como fase 1, fase 2 y fase 3. Durante el presente trabajo se pretendi desarrollar
metodologas que permitan obtener resultados satisfactorios en la fase 1 para condiciones
locales.
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MATERIALES Y MTODOS
El material vegetativo utilizado fue proveniente de una plantacin de bamb ubicada al noroeste
del jardn botnico de orquideologa de la Universidad EARTH. Las plantas seleccionadas se
obtuvieron, teniendo en consideracin caractersticas fenotpicas como longitud y grosor. El
material vegetativo utilizado fue G. angustifolia, que se clasific segn caractersticas
morfolgicas que distinguen a Guadua de otros bambes, como son las hojas caulinares
(Figura 1) y la posicin de sus brotes con respecto al culmo de bamb (Figura 2).

Figura 1. Tipos de hojas caulinares a) Hoja propiamente dicha, b) lmina caulinar, c) lgula, d)
par de aurculas (Retegui, 2009).

Figura 2. Ejemplos de diferentes tipos de ramificaciones en especies (izquierda)


a) G. angustifolia, b) Phyllostachis dulcis, c) Shi-bataea kuma-sasa, d) Aurandinaria
tecta, e) Aurandinaria simonii, f) Semiarundinaria fastuosa (Retegui, 2009); culmo
con ramificacin de la plantacin de la Universidad EARTH (derecha).

El material vegetativo colectado en campo se encontraba con lquenes y hongos, tpico de las
plantas de bamb maduras. Para reducir la contaminacin en los explantes a propagar, las algas
se removieron con cepillo y jabn lquido. Este paso se puede obviar si se trabaja con plantas
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provenientes de un invernadero se puede omitir el uso de cepillo. Cortado el bamb extraen las
ramas de la parte superior de la planta con la finalidad de cortar las yemas axilares no
diferenciadas (Figura 3). Estas yemas se cortan con una tijera de podar previamente desinfectada
con alcohol al 70 %.

Figura 3. Tipo de yema seleccionada para la propagacin in vitro de G. angustifolia.

Previa la propagacin del material, se desinfect la cmara de flujo laminar con alcohol al 95 %
para reducir la contaminacin en el momento de la propagacin y as observar el
comportamiento del material de campo en los tratamientos propuestos. El procedimiento en
laboratorio consisti en evaluar 11 diversos tratamientos (Cuadro 1). El producto QQ se hace
referencia a la aplicacin de Agrimycin 2 g/L y Benomilo 2 g/L.

Cuadro 1. Diferentes protocolos de desinfeccin de material vegetativo de G. angustifolia.


Producto Alcohol Hipoclorito de sodio
Tratamiento Vaco
QQ (70 %) 3% 2,5 % 2 % 1,5 % 1 %
T1 10 10
T2 10 15
T3 10 X 10 5
T4 10 X 10 5
T5 10 X 10 5
T6 10 X 10 5
T7 10 X 10 5
T8 10 10 10 15
T9 30 10
T10 30 20
T11 30 30
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Por otro lado, se realiz una comparacin de simple desinfeccin con doble desinfeccin (los de
doble desinfeccin se identifican DT y los de simple con ST) (Cuadro 2).

Cuadro 2. Diferentes protocolos de desinfeccin de material vegetativo de G. angustifolia y


comparacin de desinfeccin doble con desinfeccin simple.
Producto Cloro Agua destilada Cloro
Tratamiento
QQ 1% 2% esterilizada 1% 2%
DT1 30 15 24 h 15
DT2 30 15 24 h 15
DT3 30 25 24 h 25
DT4 30 30 24 h 30
ST3 30 25
ST4 30 30

El explante desinfectado se sembr en viales con 3 mL de medio de cultivo MS simple. El corte


del explante se realiz dejando por lo menos un espacio de un centmetro de distancia entre el
corte y el nudo. Las condiciones proporcionadas en las dos primeras semanas fue oscuridad al
explante en el cuarto de crecimiento, donde las temperaturas fueron entre 25 C y 30 C y
humedad relativa de 80 %. El explante se coloc en el centro del medio de cultivo con una ligera
inclinacin.
Obtenidos los explantes sin contaminacin, se realizaron tres tratamientos y cada tratamiento
cont con 15 repeticiones, dnde se evaluaron las concentraciones de N-benzylaminopurina
(BAP) a 1 mg/l, 3 mg/L y 5 mg/L para inducir la brotacin del explante. En esta fase, los
explantes sembrados se desinfectaron mediante el tratamiento con doble desinfeccin DT4, que
consiste en: lavado con jabn lquido, benomilo 2 g/L y estreptomicina 2 g/L por 30 mn,
hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min, 24 h en agua destilada y una nueva desinfeccin con
hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min. Finalizada la siembra del material vegetativo en el medio
de cultivo, se les proporcionaron dos semanas de oscuridad a todos los tratamientos para evitar la
oxidacin del bamb. Terminadas las dos semanas se trasladaron los explantes a un medio de
cultivo nuevo y se colocaron a condiciones de 16 h luz.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Los tratamiento aplicados a los explantes fueron solucin base de benomilo 2 g/L y
estreptomicina 2 g/L, tomando en cuenta la variable tiempo de exposicin de hipoclorito de
sodio. Sin embargo, los resultados no fueron exitosos y solo se presentaron dos tratamientos que
obtuvieron explantes libres de contaminacin. Estos tratamientos fueron T8, donde la
desinfeccin se realiz con estreptomicina 2 g/L y benomilo 2 g/L por 10 minutos, alcohol al
70 % por 10 min, hipoclorito de sodio al 3 % por 15 min y hipoclorito de sodio al 1 % por
10 min. El segundo tratamiento con xito fue el T11, donde se realizaron 30 min de exposicin
dentro del producto qumico de benomilo y extreptomicina y 30 min en hipoclorito de sodio al
2 % (Figura 4).
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Figura 4. Resultados de porcentaje de contaminacin luego de aplicar el tratamiento de


desinfeccin.

Los explantes contaminados que presentaron hongos o bacterias se descartaron y se dej en


crecimiento los no contaminados. La revisin de los explantes contaminados fue a las 2 semanas
despus de realizada la desinfeccin y se dio continuidad hasta las 4 semanas.
Al no obtener resultados mayores a un 50 % de explantes sin contaminacin, se recurri a
utilizar la doble desinfeccin, donde los explantes fueron sometidos en producto agroqumico a
base de benomilo 2 g/L y estreptomicina 2 g/L, hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min, 24 h en
agua destilada y una nueva desinfeccin con hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min, generaron
un 40 % de explantes sin contaminacin (Figura 5).

Figura 5. Resultados de contaminacin luego de aplicar los tratamientos de desinfeccin.


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Se tomaron tres tratamientos que presentaron menor contaminacin en los explantes,


tratamientos que corresponden al T8, T11 y DT4. Para dos repeticiones de los tres tratamientos
de desinfeccin de G. angustifolia, logr un 30 % de material no contaminado en la primera
repeticin corresponde al tratamiento DT4 y en la segunda repeticin gener un 50 % de los
explantes libres de contaminacin (Figura 6).

Figura 6. Diferentes protocolos de desinfeccin de material vegetativo de G. angustifolia,


primera repeticin (izquierda) y segunda repeticin (derecha).

El tratamiento con bajo nivel de contaminacin con material proveniente de campo fue el
tratamiento DT4. Obtenido este tratamiento se procedi a cambiarlos de medio. Se colocaron en
cuatro diferentes concentraciones de BAP pero ninguno de los medios gener brotacin en el
material de bamb. Sin embargo, al aumentar a 6 mg/L de BAP provoc que al transcurrir 5 das
el explante generara brotacin (Figura 7). Los explantes estuvieron tres semanas en el primer
medio y dos semanas en el segundo medio en sus respectivas concentraciones, para un total de
cinco semanas.

Figura 7. Brotacin del explante de G. angustifolia; brote a los 5 das de transferido el explante
al medio fresco (izquierda) y brote con 8 das de transferido el explante a medio fresco
(deredcha).

Durante la propagacin se presentaron problemas de oxidacin al lado izquierdo que ocasionaron


la muerte de los explantes. La oxidacin se dio a partir de los extremos hasta llegar a matar el
brote; igualmente, la mayor contaminacin en la desinfeccin del material reproducido fue
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ocasionada por hongos filamentosos y bacterias. Cruz et al. (2007) indica que la multiplicacin
in vitro de G. angustifolia presenta dos problemas principales en la fase de establecimiento que
son: la necrosis en los explantes y la presencia de microorganismos contaminantes. Adems
menciona que estos problemas son una limitante por la que no se encuentran an protocolos
eficientes para la propagacin.

CONCLUSIONES
Tratamiento de desinfeccin resultante de la fase 1 en la propagacin de G. angustifolia fue
desinfectar los explantes en una solucin de benomilo 2 g/L y estreptomicina 2 g/L por 30 min,
hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min, 24 h en agua destilada y una nueva desinfeccin con
hipoclorito de sodio al 2 % por 30 min. El medio de cultivo que indujo la brotacin del explante
fue un MS con 6 mg/L de N-benzylaminopurina.

LITERATURA CITADA
Brias, V. 2008. Tissue culture of bamboo: the experience of Oprins in Europe and its relevance
Oprins in Europe and its relevance. In Choudhary, ML. y Salam, SK. (eds.). Proceeding
International Conference on Improvement of Bamboo Productivity and Marketing for
Sustainable Livelihood, New Delhi, 15th-17th April 2008. New Delhi (IN) : Cane and
Bamboo Technology Centre. p. 16-21.
Bystriakova, N.; Kapos, V. y Lysenko, I. 2004. Bamboo biodiversity. Cambridge (UK) : UNEP
World Conservation Monitoring Centre. 88 p. UNEP-WCMC Biodiversity Serie, no. 19.
ISBN: 92-807-2383-9.
Cruz, M.; Garca, Y.; Snchez, C.; Alvarado, Y.; Acosta, M.; Roque, B.; Leiva, M. y Freire, M.
2007. Identificacin y control de Bacillus sp., contaminante del establecimiento in vitro de
Guadua angustifolia Kunth. Biotecnologa Vegetal, vol. 7, no. 1, p. 9-13.
Espinosa, D. 2003. La cadena de la Guadua en Colombia [en lnea]. Bogot (CO) : Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural. Documento de trrabajo, no. 35. [consultado 20 junio 2009].
Disponible en el World Wide Web: <http://agrocadenas.gov.com>.
Giraldo, E. y Sabogal, A. 1999. Una alternativa sostenible: la Guadua tcnicas de cultivo y
manejo. Armenia (CO) : Corporacin Autnoma Regional del Quindio. 192 p. ISBN 958-
96754-0-9.
Hartmann, HT.; Kester, DE. y Davies, FT. 1990. Plant propagation: principles and practices.
5a ed. New Jersey (US) : Englewood Cliffs. 647 p. ISBN 0-13-681016-0.
Jimnez, VM. y Guevara, E. 2007. Micropropagartion of bamboo spacies through axillary shoot
proliferation. In Mohan, S. y H. Hggman (eds.). Protocols for micropropagation of woody
trees and fruits. Netherlands : Springer. p. 465-476. ISBN: 978-1-4020-6351-0.
Mercedes, JR. 2006. Gua tcnica: cultivo del bamb. Santo Domingo (RD) : CEDAF. 37 p.
ISBN: 99934-59-04-6.
Mishra, Y.; Patel, PK.; Yadav, S.; Shirin, F.; Ansari, SA. 2008. A micropopagation system for
cloning of Bambusa tulda Roxb. Scientia Horticulturae, vol. 115, no. 3, p. 315-318.
Mendoza y Tamayo / Tierra Tropical (2010) 6 (2): 191-199 199

Retegui E., 2009. Caracterizacin y clave de identificacin de bambes en el mbito


chanchamayo [Tesis Ing. For.]. Lima (PE) : Universidad Nacional Agraria la Molina,
Facultad de Ciencias Forestales. 150 p.
Roca, WM. y Mroginski, LA. 1993. Cultivo de tejidos en la agricultura. In Villalobos, A. y
Thorpe, T. Micropropagacin: conceptos, metodologa y resultados. Cali (CO) : CIAT.
p. 1-17.