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Tema 12
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CROMATOGRAFIA LIQUIDA
eluyente
capa protectora
(arena, papel de filtro)
relleno
vaco
a) b)
Tanto en las columnas alimentadas por gravedad, como en las que el proceso se
facilita mediante vaco (tambin por bombeo del lquido) el mecanismo de la separacin
puede ser de adsorcin, reparto, intercambio inico, en funcin del tamao
molecular o dependiendo de la afinidad entre los diferentes solutos y la fase
estacionaria, originndose distintos tipos de cromatografa que se considerarn en
este captulo.
Las especies qumicas (tomos, molculas, iones) que estn en la capa superficial
de un slido no tienen todas sus cargas elctricas compensadas y como consecuencia
de ello, presentan fuerzas residuales, o sitios activos, que pueden actuar sobre los
componentes del fluido que baa su superficie, originando fenmenos de adsorcin.
Las fuerzas responsables de la adsorcin dependen de la naturaleza de la superficie y
de la estructura de las especies adsorbidas, ocurriendo la separacin como se indica
en el tema 10 ("Mecanismo de las separaciones cromatogrficas").
SiOH H2 O Si
O
SiOH Si
La almina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interaccin con los solutos,
ya que, por una parte, tiene sitios activos cidos en las zonas prximas al Al3+, y
centros bsicos en las zonas prximas al O2. La proporcin relativa de centros cidos
* En ocasiones se utiliza un adaptador de flujo ajustable que se comprime estrechamente contra la parte
superior de la fase estacionaria, de modo que no quede espacio para que la muestra y el disolvente se
mezclen sobre la columna.
Claudio Gonzlez Prez 5
Disolventes. En CLS el disolvente compite con los solutos por los centros activos
de la fase estacionaria, por lo que la elucin puede describirse como un
desplazamiento del soluto por el disolvente. As, cuanto ms intensa sea la interaccin
disolvente-fase estacionaria, ms tiempo pasar el soluto en la fase mvil y, en
consecuencia, ms rpidamente ser eluido. De hecho, la capacidad relativa de los
distintos disolventes para eluir un soluto dado de una columna, es casi independiente
de la naturaleza del soluto. Por ello, en la prctica, la variable a controlar en
cromatografa de adsorcin, es el disolvente.
agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno >
tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano
* La presencia de impurezas (por ejemplo, metanol en benceno) puede alterar de forma sustancial el poder
eluyente de una determinada sustancia. Por ello, es necesario utilizar disolventes lo suficientemente puros.
Cromatografa lquida 6
sea total, siempre, al cabo de cierto tiempo, la fase estacionaria va siendo arrastrada
por la fase mvil fuera de la columna. Este problema puede evitarse, o al menos
paliarse, mediante una pre-saturacin del eluyente con la fase estacionaria.
CH=CH2
Estireno Divinilbenceno
proporcin de divinilbenceno, que oscila entre 1 y 16 %*. Por otra parte, los anillos
bencnicos pueden modificarse para producir una resina de intercambio catinico, con
grupos SO3H o COOH, o una resina aninica, con grupos CH2N+R3 o CH2NR2
CH CH2 CH CH 2 CH CH2
SO3 H+ SO3H+
CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH
2 2 2 2 2
SO3 H+ SO3 H+
+ +
CH2 N(CH3 )3 Cl CH2 N(CH3 )3 Cl
+ +
CH2 N(CH3 )3 Cl CH2 N(CH3 )3 Cl
* El grado de formacin de enlaces cruzados se indica con la notacin "XN" despus del nombre de la
resina. As, una resina Dowex 1X4 contiene 4 % de divinilbenceno.
Cromatografa lquida 8
entrecruzamiento es alto, ello significa tamaos pequeos para los poros, con lo que la
resina se hace ms selectiva para los iones pequeos. En este caso, la resina presenta
mayor capacidad de intercambio y selectividad, pero tiempos de equilibrio ms
elevados.
R H+ + M+ <> R M+ + H+
* Cuando las disoluciones se apartan del comportamiento ideal las concentraciones debern reemplazarse
por las correspondientes actividades.
Claudio Gonzlez Prez 9
En solucin acuosa diluida, la afinidad de los cationes para la resina aumenta con
la carga, y, a igualdad de carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del
in hidratado, de forma que puede escribirse la siguiente secuencia:
Las molculas de soluto que tienen dimetros significativamente menores que los
poros pueden penetrar en ellos y, de esta manera, ser retenidos durante un cierto
tiempo, mientras que las molculas que son ms grandes que el tamao medio de los
poros del relleno son excluidas, y, de esta forma, no se retienen, siendo eluidas en
primer lugar (figura 12.2.). Entre estos dos extremos existirn molculas de tamao
intermedio, cuya penetracin media en los poros depende de su tamao y cuyo avance
a lo largo de la columna ser algo retardado.
.
.
VR = VM + K VS
donde VR es el volumen de retencin, VM el volumen muerto, VS el volumen de fase
estacionaria y K la constante de distribucin. En cromatografa de exclusin
molecular, VM se denomina generalmente volumen intersticial, Vo, y representa el
volumen de fase mvil que est en el exterior de la matriz porosa, mientras que VS es
el volumen de fluido contenido en los poros de la matriz, y suele representarse por Vi.
Reagrupando la ecuacin anterior, se obtiene*,
VR VM VR Vo
K= =
VS Vi
Las molculas cuyos tamaos sean mayores que el lmite de exclusin no son
retenidas por la columna y se eluyen todas juntas, igual que aquellas cuyos tamaos
sean inferiores al lmite de permeabilidad.
* Debido a que el peso molecular no est directamente relacionado con el tamao y la forma de las
molculas, es necesario indicar, junto con los mrgenes de fraccionamiento, el tipo de molculas que se ha
utilizado para las determinaciones.
Cromatografa lquida 12
10 7
10 6 IV
Mr III
10 5
II
10 4
I
10 3
VR
Figura 12.4. Curvas de calibrado para determinados geles.
HO
HO O O
CH 2 O
HO H 2C
O
HO CH 2 OH OH O
HO CH 2
O O O
HO O HO
HO HO
H O HO O
CH 2 O
HO
HO HO
O
=
2 (CH 2 =CHCNH) 2 CH 2
Acrilamida NN'-metilenbisacrilamida
CONH 2 .
CONH
CH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 C H
CONH
CONH
CH 2
CH 2
CONH CONH 2 CONH
CONH 2
CH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CH
CONH
CH 2
CONH 2 CONH CONH 2
CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CH
CONH CONH
a) b)
lavado
elucin
c)
Figura 12.5. Representacin esquemtica de la cromatografa de afinidad.
La matriz deber estar constituida por partculas de tamao uniforme, porosas,
inertes y estables. Con esta finalidad, en muchas ocasiones, se utilizan geles de
dextrano, geles de poliacrilamida, celulosa, vidrio poroso y, muy frecuentemente, las
Sepharosas, que es el nombre comercial de la agarosa con enlaces cruzados*. La unin
entre el ligando y la matriz normalmente se hace a travs de los grupos OH de sta,
y debe poder realizarse en condiciones suaves, por lo que se hace necesario activar la
matriz.
OH O
+ CNBr C=NH + HBr
OH O
imidocarbonato
En una etapa posterior, el ligando reacciona con la matriz activada para originar
el material con que se llenar la columna cromatogrfica.
NH
=
O OCNHproteina
C=NH + H2 Nproteina
O OH
a) b)
Figura 12.6. "Brazo de extensin" en cromatografa de afinidad.
PRINCIPIOS BASICOS
B
H=A+ +Cu
u
* Ya se indic en el captulo 10 que las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominacin inglesa
High Performance Liquid Chromatography, si bien, en algunos artculos las mencionadas siglas significa "alta
presin", High Pressure.
Claudio Gonzlez Prez 17
ecuacin de van Deemter, ya que las trayectorias seguidas por la fase mvil son ms
uniformes en el caso de partculas de menor tamao.
150 m 50 m
5 m
1-2 m
al detector
al detector
al detector
Figura 12.7. Columnas y fases estacionarias en CL. a) CL convencional. b) HPLC con partculas
peliculares. c) HPLC con partculas microporosas.
Cromatografa lquida 18
INSTRUMENTACION
Como algunas fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas,
como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema
estn fabricados con materiales resistentes a esos posibles ataques. La mayora de las
partes del cromatgrafo en contacto con la fase mvil suelen estar fabricadas con
acero inoxidable, previamente pasivado con cido ntrico 6 M, de forma que en esas
condiciones, su superficie es resistente al ataque de la mayora de los disolventes, con
excepcin del cido clorhdrico. Las mayores ventajas del acero residen en su coste
relativamente bajo, la facilidad para construir con l los distintos componentes y la
resistencia mecnica, lo que permite operar a presiones muy elevadas.
He
Introduccin de la muestra
Columna
Registro
Disolvente
Bomba .
Detector
Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil (y las tuberas que la
conduzcan) tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deber extraer especie
alguna del material con que estn construidos. Generalmente se usan botellas de vidrio
y tubos de tefln, provistos stos ltimos de un sistema de filtros para eliminar
cualquier partcula que pueda contener la fase mvil.
SISTEMAS DE BOMBEO
Vlvula de salida
Pistn
Vlvula de entrada
Eluyente
* Las presiones que se generan en HPLC, a pesar de ser muy elevadas, no constituyen peligro de explosin,
debido a la incompresibilidad de los lquidos. Unicamente, si el disolvente es inflamable, existir riesgo de
incendio como consecuencia de la rotura de algn componente.
Cromatografa lquida 22
Vlvula Vlvula
de entrada de salida
Eluyente Columna
Cmara conteniendo
eluyente
INTRODUCCION DE LA MUESTRA
Jeringa .
Entrada de
muestra
Bucle
a) b)
Cromatografa de adsorcin
Si OH Si
O
Si OH Si
H2O
a) Poros anchos
OH Si O Si
Si Si
HO
b) Poros estrechos
Cromatografa de reparto
hasta que se equilibren, si bien, suele ser preferible utilizar una pre-columna situada
antes del sistema de introduccin de las muestras. La pre-columna deber contener un
relleno de gran rea superficial, tal como gel de slice, recubierto con una cantidad
relativamente grande (30-40%) de la sustancia usada como fase estacionaria. Sin
embargo, cuando la fuerza del disolvente es lo bastante elevada para disolver
cantidades apreciables de fase estacionaria, la pre-saturacin se hace difcil. Por otra
parte, evidentemente, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide
utilizar la tcnica de la elucin con gradiente.
La principal limitacin de estas fases enlazadas con base silcea reside en que el
pH del eluyente debe estar comprendido entre 2 y 8, para evitar la hidrlisis de la
fase estacionaria. El mecanismo de retencin por las fases enlazadas no est
suficientemente claro. Para algunos, el proceso es anlogo al que tiene lugar en la
cromatografa convencional lquido-lquido, si bien, parece que simultneamente puede
participar tambin un mecanismo de adsorcin.
Tabla 12.1.
Guia simplificada para la eleccin del tipo de HPLC.
inico
CCI
agua < 30 nm C F E inversa
Peso molecular no inico
>2000 30-400 nm CEM
< 30 nm C F E inversa
disolventes
orgnicos 30-400 nm CEM
Cromatografa lquida 28
DETECTORES
Absorbancia ultravioleta
Propiedad del soluto Fluorescencia
Electroqumicos
Indice de refraccin
Propiedad de la disolucin
Conductividad
Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a una propiedad
fsica o fsico-qumica del soluto, y que generalmente no la presenta la fase mvil.
Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por su parte, los
detectores basados en una propiedad de la disolucin comparan el cambio global de
alguna propiedad fsica de la fase mvil con y sin soluto eluido. Estos detectores
responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.
* Sensibilidad elevada.
* Buena estabilidad y reproducibilidad.
* Amplio margen de respuesta lineal.
* Pequeo tiempo de respuesta, independiente de la velocidad de flujo.
* Muchas de las caractersticas coinciden con las indicadas para los detectores relacionados con la
cromatografa de gases.
Claudio Gonzlez Prez 29
h Detector
Desecho
Figura 12.13. Clula de flujo para HPLC.
Lmpara de deuterio
Clula de flujo
Red halogrfica
Figura 12.14. Dispositivo de fotodiodos.
A
po
m
tie
, nm
Figura 12.15. Espectros de una separacin por HPLC con dispositivo de fotodiodos.
Claudio Gonzlez Prez 31
Detectores de fluorescencia
Detector (fotomultiplicador)
Columna Bucle
Detector
.
Bao de agua
Bomba
Reactivo
.
Figura 12.17. Derivatizacin poscolumna.
Detectores electroqumicos
Electrodo
de referencia
Electrodo
de trabajo
Electrodo
auxiliar
Detectores de conductividad
Los detectores de conductividad son los ms utilizados cuando los solutos eluidos
son inicos, como, por ejemplo, cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos
despus de su separacin por cromatografa de cambio inico.
R1 Rs
.
C.A.
R2
Clula de conductividad
APLICACIONES
* Para la separacin de cationes, cuando se usa HCl como eluyente, la columna supresora es una resina
aninica en forma de hidrxido, con lo que el Cl queda retenido por la resina y los H+, con los OH forman
H2O,
H+ + Cl + ROH(s) > RCl(s) + H2O
En la separacin de aniones, muchas veces se utiliza carbonato o bicarbonato sdico como eluyente. En este
caso, la columna supresora contiene la forma cida de una resina catnica, con lo que se forma H2CO3 muy
poco disociado,
Na+ + HCO3 + RH+(s) > RNa+ + H2CO3
Cromatografa lquida 36
CROMATOGRAFIA PLANA
La cromatografa plana es un tipo de cromatografa lquida en la que la fase
estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna.
Existen dos tcnicas de cromatografa plana: cromatografa en papel (CP) y
cromatografa de capa fina (CCF). Aunque la CP precede en 1015 aos a la CCF, ha
sido ampliamente superada por sta, debido a su mayor rapidez, versatilidad y
reproducibilidad.
dw
Lmina plana
dM
Componente B
Compuesto
Muestra Eluyente dR de referencia
Componente C dP
Aplicacin
de la muestra
a) b)
Figura 12.20. Cromatografa plana. a) Cmara cromatogrfica. b) Cromatograma.
Cromatografa lquida 38
PRINCIPIOS BASICOS
Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen,
hasta valores prximos a cero. Estos valores pueden ayudar a la identificacin de una
determinada especie, si bien, la coincidencia en los RF no deber tomarse como prueba
inequvoca de identificacin, debido al gran nmero de variables que pueden influir,
como pequeas diferencias en la composicin de la fase mvil, temperatura, tamao de
la cmara, naturaleza de la mezcla, etc.
Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF debidas a los
factores mencionados, se ha propuesto utilizar el parmetro Rx, definido por,
t' R
k' =
tM
tM = cte. dR
por lo que,
' cte. d M d R 1 R F
k = =
cte. d R RF
Fases estacionarias
Tradicionalmente, los materiales ms usados como fase estacionaria han sido gel
de slice, almina, celita, poliamida y celulosa, si bien, en poca relativamente reciente,
el tipo de materiales usados con esta finalidad se ha extendido considerablemente,
tanto para operar en fase normal, como en fase inversa o enlazada, anlogamente a lo
que sucede en HPLC.
Fase estacionaria
(suspensin)
.
Placas sin recubrir
Placas recubiertas
con la fase estacionaria
El espesor de las pelculas usadas para trabajos analticos suele ser de 0.2 a 0.3
mm, mientras que en cromatografa preparativa el espesor puede variar entre 2 y 10
mm. Una vez extendida la fase estacionaria, la placa se seca al aire y se activa por
calefaccin a 110 C.
Fases mviles
* Pureza elevada.
* Adecuada viscosidad y tensin superficial.
* Punto de ebullicin bajo, para facilitar el secado de las placas.
* Barato, de baja inflamabilidad y toxicidad.
Una vez preparada la placa y aplicadas las muestras, se coloca en una cmara
cerrada (para operar en atmsfera saturada de vapor del disolvente) como se indica
en la figura 12.20.a. y se espera a que el disolvente haya pasado a travs de la mitad o
de las dos terceras partes de la placa. Adems de la modalidad ascendente,
representada en la mencionada figura, pueden tambin utilizarse las modalidades
descendente (figura 12.22.a.), bidimensional (figura 12.22.b.) o radial (figura 12.22.c.).
.
Placa
Aplicacin
de la muestra
1
a) b) c)
Mtodos qumicos. Estos mtodos implican una reaccin qumica, que puede ser
especfica para algn determinado componente, o general. Dentro de estas
ltimas, se utiliza el vapor de yodo, el cual se adsorbe reversiblemente sobre
una gran cantidad de sustancias, originando puntos oscuros en las zonas donde
existe un compuesto en la placa. Otro reactivo de aplicacin bastante general es
el cido sulfrico concentrado, el cual, pulverizado sobre una placa de slice,
permite visualizar las sustancias orgnicas despus de haber calentado la placa
en una estufa. Asimismo, la fluorescena origina color amarillo-verdoso con una
gran cantidad de sustancias orgnicas, y la ninhidrina se utiliza para detectar
aminocidos.
Aplicaciones
La comparacin del rea de la mancha del patrn con la del analito permite hacer
una estimacin semicuantitativa de la cantidad presente. Otros procedimientos
cuantitativos implican la utilizacin de un densitmetro, as como proceder de forma
anloga a la indicada para fines cualitativos, extrayendo el analito y determinarlo por
algn mtodo qumico o fsico adecuado.
Zona
80 supercrtica
70
P, atms.
Punto crtico
60 (31.3C, 72.9 atms.)
Lquido
50
Slido
40
30
Gas
20
10
Punto triple (56.4 C, 5.11 atms.)
80 60 40 20 0 20 40
t, C
A lo largo de cada una de las lneas del diagrama existe un equilibrio entre las
fases adyacentes, esto es, coexisten ambas fases, mientras que en el punto triple,
coexisten en equilibrio las tres fases, slida, lquida y gaseosa. Cuando se cruza alguna
de las lneas resulta un cambio de fase, como consecuencia de lo cual se produce un
cambio brusco en las propiedades fsicas (densidad, viscosidad, difusividad, etc.). Sin
embargo, por encima del punto crtico (caracterizado por una presin y un
temperatura definidas) solo existe una fase, cualquiera que sea la presin. Esa fase se
llama fluido supercrtico. Las propiedades fsicas del fluido en esas condiciones son
intermedias entre las del gas y el lquido, y varan gradualmente (no bruscamente) al
desplazarse dentro de esa zona.
Cromatografa lquida 48
Las columnas empaquetadas en CFS son similares a las usadas en HPLC, con
partculas porosas de 10, 5 y 3 m, y fases estacionarias enlazadas sobre una base de
gel de slice.