Lectura Prctica - Inmunoensayos 1 PDF

Introduccin a los Inmunoensayos
GDS_0418723_McClelland_v4 1
Objetivos del Entrenamiento
Una vez finalizado este captulo, usted podr:

Definir inmunoensayo
Describir la estructura y preparacin de los anticuerpos
Definir cuatro categoras de metodologas de inmunoensayos
(competitiva y no competitiva, y homognea y heterognea).
Introduccin
Inmunoensayo es una prueba que usa complejos de anticuerpo y
antgeno como medio para generar un resultado perceptible. Un complejo
anticuerpo:antgeno tambin es conocido como inmuno-complejo.
Inmuno se refiere a una respuesta inmunolgica que hace que el cuerpo
genere anticuerpos, y ensayo se refiere a una prueba. Entonces, un
inmunoensayo es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando se
unen los anticuerpos y los antgenos.
Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de
laboratorio, como las pruebas colorimtricas, ya que usan complejos
anticuerpo:antgeno para generar una seal que pueda medirse. En
oposicin, la mayora de las pruebas de rutina de qumica clnica utilizan
reacciones qumicas entre el reactivo (solucin de sustancias qumicas u
otros agentes) y la muestra del paciente para generar un resultado de la
prueba.
Inmunoensayo: Anticuerpos, Antgenos y Analitos
Anticuerpo es una protena producida por el cuerpo en respuesta a una
sustancia invasora (extraa)1. Los anticuerpos se producen como parte
de la respuesta inmunolgica del cuerpo para protegerse. Es tambin el
caso, por ejemplo, de algunos test de inmunoensayos para determinar la
presencia de anticuerpos contra las molculas de cncer. As, si los
anticuerpos estn presentes, significa que las clulas invasoras de
cncer tambin lo estn.
Antgeno es la sustancia que el cuerpo est tratando de combatir
(eliminar o reducir) preparando una respuesta inmunolgica. Algunos test
de inmunoensayos determinan la presencia de antgenos directamente,
en vez de buscar anticuerpos. En un anlisis para medir la concentracin
de una droga teraputica, por ejemplo, la droga es el antgeno que se une
al anticuerpo.
1 Una excepcin es el caso de las enfermedades autoinmunes, donde el cuerpo produce

anticuerpos para protenas que existen naturalmente en vez de sustancias extraas.
Inmunoensayo: Anticuerpos, Antgenos y Analitos
Analito es todo lo que se mide en una prueba de laboratorio.
En el inmunoensayo, el analito puede ser tanto un anticuerpo como
un antgeno.
Resumen de Tcnicas del Inmunoensayo
Los inmunoensayos utilizan un anticuerpo selecto o ms para

detectar analitos de inters. Los analitos que se miden pueden ser
aquellos que estn presentes en el cuerpo naturalmente (como por
ejemplo una hormona tiroidea), aquellos que el cuerpo produce
pero no estn tpicamente presentes (como por ejemplo un
antgeno de cncer), o aquellos que naturalmente no existen en el
cuerpo (como por ejemplo una droga de abuso).
Los anticuerpos poseen una alta especificidad y afinidad para un
antgeno especfico. Es la unin especfica de un anticuerpo a un
antgeno lo que permite la deteccin de analitos por medio de una
variedad de tcnicas de inmunoensayo.
Estructura de los Anticuerpos
Los anticuerpos (Ab) son un tipo de protenas

denominado inmunoglobulinas. La ms
comn es la inmunoglobulina G (IgG).
IgG es una protena compuesta por dos
regiones principales, estructural y funcional:
Regin Fab:
Contiene el punto de unin del
antgeno (Ag) que vara entre
diferentes anticuerpos.
Regin Fc:
Regin de estructura constante
dentro de una clase de anticuerpo.
Figura 1-1 Estructura del anticuerpo
y puntos funcionales
Preparacin de
Anticuerpos Policlonales y Monoclonales
Los reactivos para anticuerpo se desarrollan a partir de anticuerpos

policlonales como monoclonales. El antisuero policlonal (suero
sanguneo que contiene los anticuerpos deseados) se genera en
animales, siendo los ms comunes ovejas, conejos, o cabras.
Los animales producen el antisuero igual que un ser humano
como mecanismo de defensa al ser expuestos a un antgeno. El
antisuero contiene una mezcla de anticuerpos, cada uno de los
cuales puede unirse a diferentes puntos de unin del antgeno o
eptope.
Preparacin de
El proceso de preparacin de un anticuerpo comienza cuando le se

inyecta a un animal una solucin que contenga el antgeno de
inters. A este antgeno de inters a veces se lo denomina
sustancia inmungena, debido a que puede estimular una
respuesta inmunolgica. Transcurrido un tiempo, y en algunos
casos con mltiples inyecciones, el sistema inmunolgico del
animal produce anticuerpos para el antgeno que fue inyectado. Se
toma sangre del animal, y se separa el suero. Este suero
generalmente es rico en anticuerpos que reconocen el antgeno y
se lo denomina antisuero.
Preparacin de
El antisuero por lo general contiene una mezcla de anticuerpos que
reconocen y se unen al mismo antgeno, pero pueden combinarse
con diferentes eptopes (ver Figura 1-2). Un antgeno que contenga
mltiples puntos de unin para los anticuerpos se denomina
antgeno multivalente. Estos tipos de anticuerpos, presentes como
una mezcla diversa, se denominan anticuerpos policlonales.
Figura 1-2 Especificidades del antgeno mltiple de anticuerpos policlonales

Preparacin de
Los anticuerpos monoclonales se diferencian de los anticuerpos

policlonales en que son muy especficos para un eptope simple en
un antgeno multivalente (ver Figura 1-3). Se producen a partir de
una lnea celular simple usando tecnologa para hibridomas y
lneas celulares de mieloma de ratn. Las hibridomas son clulas
tumorales productoras de anticuerpos que producen varias copias
del mismo anticuerpo y se desarrollan fcilmente en poblaciones
celulares de laboratorio.
Preparacin de
Una ventaja de los anticuerpos monoclonales es que la lnea
celular hibridoma que los produce es potencialmente inmortal y
que puede producir los mismos anticuerpos en forma constante e
indefinida. Un antisuero policlonal producido por inmunizacin de
animales puede variar de un animal a otro, y un antisuero til
puede ya no estar ms disponible si el nico animal que lo produce
muere.
Figura 1-3 Especificidades uniformes de anticuerpos monoclonales

Preparacin de
Las hibridomas se producen en mltiples etapas

(ver Figura 1-4) :
Inyectando un antgeno especfico en un animal
husped (tpicamente un ratn)
Aislando clulas productoras de anticuerpos (clulas B)
del bazo del ratn
Fusionando estas clulas B con un tipo especfico de clula tumoral
que se desarrolla fcilmente en poblaciones y produce anticuerpos
Aislando hibridomas logrados (clulas fusionadas) que produzcan
anticuerpos especficos para el antgeno de inters
Preparacin de
En los inmunoensayos, ambos anticuerpos monoclonales y

policlonales se usan para detectar antgenos, cada uno con
fortalezas especficas para aplicaciones particulares. Es probable
que los inmunoensayos que detectan anticuerpos en sueros de
pacientes supongan la deteccin de anticuerpos policlonales
generados por el sistema inmunolgico del paciente.
Clulas plasmticas
productoras de
anticuerpos
Fusin de clulas para

realizar hibridomas
Las clulas hibridomas se

desarrollan en poblaciones
Se clonan las clulas

hibridomas individuales
Los tumores de
hibridomas se
mantienen vivos
en el ratn
Figura 1-4
Procedimiento para
generar anticuerpos
monoclonales
Categoras de las Tcnicas de Inmunoensayo
En este captulo, se tratarn cuatro categoras de tcnicas de

inmunoensayo. Ellas son: inmunoensayos no competitivos y
competitivos, e inmunoensayos homogneos y heterogneos.
Categoras de las Tcnicas de Inmunoensayo
Todos los inmunoensayos requieren el uso de material marcado

para medir la concentracin de antgeno o anticuerpo presente.
Una marca es una molcula que reacciona como parte del ensayo,
por lo tanto un cambio en la seal puede medirse en la sangre-
reactivo.
Los ejemplos de marcas incluyen un compuesto radioactivo, una
enzima que hace que cambie el color de una solucin, o una
sustancia que produzca luz. La marca puede aplicarse durante la
fabricacin del reactivo tanto al anticuerpo (Ab*, ver Figura 1-5)
como al antgeno (Ag*, ver Figura 1-6). Las tecnologas de
inmunoensayo utilizan diferentes formatos para distinguir el
complejo antgeno-anticuerpo de la marca libre no unida.
Figura 1-5 Los anticuerpos marcados permiten la deteccin de complejos antgeno/anticuerpo en los inmunoensayos
Figura 1-6 El antgeno marcado tambin permite la deteccin de complejos antgeno/anticuerpo en los inmunoensayos
Inmunoensayos Competitivos y no Competitivos
La medicin del analito en un inmunoensayo se logra usando tanto

un formato competitivo como uno no competitivo
En los formatos competitivos, el analito sin marcar (generalmente
antgeno) en la muestra se mide por su capacidad para competir
con un antgeno marcado en el inmunoensayo. El antgeno sin
marcar bloquea la capacidad del antgeno marcado de unirse
puesto que ese punto de unin en el anticuerpo ya se encuentra
ocupado.
Formato Competitivo
As, en un inmunoensayo competitivo, el hecho de que se mida

menos marca en el ensayo significa que hay ms antgeno
marcado (muestra) presente. La concentracin de antgeno en la
muestra est inversamente
relacionada a la
concentracin de marca
que se mide en el formato
competitivo
(Figura 1-7).
Figura 1-7 La concentracin de antgeno est

inversamente relacionada a la concentracin
de marca (seal) en formatos competitivos
Formato Competitivo
En el formato competitivo de un solo paso (ver Figura 1-8), tanto el

reactivo del antgeno marcado (Ag*) como la muestra sin marcar (o
analito de la muestra) compiten por una cantidad limitada de
anticuerpo.
Figura 1-8 Inmunoensayo competitivo de un solo paso

Formato Competitivo
En el formato competitivo de dos pasos, la concentracin de

anticuerpo del reactivo se encuentra presente en exceso
comparada con la concentracin de antgeno. El reactivo del
anticuerpo primero se incuba con una muestra que contenga
antgenos de inters, luego en el segundo paso, se agrega el
antgeno marcado.
Formato Competitivo
Recuerde que en el formato competitivo, menor concentracin de

antgeno marcado unido indica mayor concentracin de antgeno
presente en la muestra.
Los formatos de ensayos competitivos de dos pasos proporcionan
una sensibilidad mejorada, comparados con los formatos de
ensayos de un solo paso.
Figura 1-9 Inmunoensayo competitivo de dos pasos
Tcnica No Competitiva (sndwich)
Los formatos de ensayo no competitivos generalmente

proporcionan el nivel ms alto de sensibilidad y especificidad del
ensayo (ver Glosario para la definicin de estos trminos) y se
aplican a la medicin de analitos crticos como pueden ser los
marcadores cardacos y de hepatitis (ver Captulo 3). A este
formato se lo conoce como
ensayo sandwich ya que
el analito est unido
(como un sandwich)
entre dos reactivos de
anticuerpo muy especficos
(Figura 1-10).
Figura 1-10 Tcnica sndwich no competitiva de inmunoensayo

Tcnica No Competitiva (sandwich)
Los formatos de ensayo no competitivo tambin pueden utilizar las

tcnicas de un paso o de dos pasos, como en el ensayo
competitivo. El formato del ensayo de dos pasos emplea etapas de
lavado en el que se asla y se lava el complejo sndwich para
quitar el exceso del reactivo marcado no unido y cualquier otra
sustancia que interfiera.
El formato no competitivo de dos pasos generalmente ofrece la
mayor especificidad y sensibilidad de todos los formatos de
ensayo que se tratan en la presente gua.
Tcnica No Competitiva (sandwich)
En los ensayos no competitivos, la medicin del analito marcado,

generalmente un anticuerpo, es directamente proporcional a la
concentracin de antgeno presente en la muestra. Esto puede
representarse por medio de una curva de respuesta a la concentracin.
(Figura 1-11).
El eje X traza la concentracin
de un antgeno. El eje Y traza
la respuesta, que en este caso
se trata de la seal. As, cuanto
mayor sea la cantidad de
antgeno presente, ms
anticuerpos marcados se unirn.
Esta proporcin directa contrasta
con la indirecta de los
inmunoensayos competitivos Figura 1-11 La concentracin de antgeno es
tratados anteriormente. directamente proporcional a la
concentracin de marca
(seal) en los formatos no competitivos
Tcnicas de Inmunoensayo
Homogneas y Heterogneas
A las tcnicas de inmunoensayo que requieren la separacin del

complejo unido Ab-Ag* se las conoce como inmunoensayos
heterogneos. Aquellas que no requieren separacin se
denominan inmunoensayos homogneos.
Tcnicas de Inmunoensayo
Homogneas y Heterogneas
Las tcnicas homogneas generalmente se han aplicado a la
medicin de pequeos analitos como por ejemplo las drogas de
abuso y teraputicas. Debido a que las tcnicas homogneas no
requieren la separacin de la unin Ab-Ag* del Ag* libre,
generalmente son ms fciles y ms rpidas de realizar.
Tubo de
Reaccin
Reactivo de Tcnica
Anticuerpo de Fase Homognea
Se mide el complejo
Slida (]-Ab) Ab-Ag
Muestra (Ag) Tcnica

Heterognea Aislar y Lavar el
Complejo ]-Ab- Ag- Ab*
Reactivo de
Anticuerpo
Marcado (Ab*) Figura 1-12
Inmunoensayos homogneos y
heterogneos
Resumen
Inmunoensayos son pruebas que usan complejos de anticuerpo y

antgeno (tambin denominados inmunocomplejos) para medir la
presencia de un analito especfico en una muestra.
Anticuerpos son protenas que normalmente produce el sistema
inmunolgico en respuesta a una sustancia extraa.
Antgenos son las molculas a las que se unen los anticuerpos,
que en el cuerpo podran ser un un agente patgeno invasor, o las
molculas extraas inyectadas a un animal con el fin de provocar
la respuesta inmunolgica.
Anticuerpos se componen de dos regiones principales, la regin
Fab (antgeno especfico) y la regin Fc.
Resumen
Las preparaciones de anticuerpo son antisueros policlonales,

que reconocen mltiples puntos en los antgenos, o anticuerpos
monoclonales, que reconocen puntos simples en los antgenos.
En los inmunoensayos, se marca el anticuerpo o antgeno con el
fin de obtener una seal perceptible que corresponda a la
concentracin del analito.
Los inmunoensayos pueden ser competitivos o no competitivos. En
los inmunoensayos competitivos, la concentracin de antgeno
es inversamente proporcional a la concentracin de la seal. En
los inmunoensayos no competitivos, la concentracin de
antgeno es directamente proporcional a la concentracin de la
seal.
Resumen
Inmunoensayos homogneos no requieren la separacin de los

complejos no unidos de los complejos unidos y de ah que sean
ms rpidos y ms fciles de llevar a cabo que los inmunoensayos
heterogneos.
Inmunoensayos heterogneos requieren la separacin de los
complejos no unidos, a menudo utilizando un reactivo de fase
slida como una partcula magntica o una esfera plstica.
Revisin
Los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos policlonales:

A. Pueden proveer especificidad y sensibilidad
para medir los analitos
B. Son inmunoglobulinas
C. Se unen al antgeno a travs de la regin de unin Fab
D. Todas las opciones anteriores
Revisin
Los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos policlonales:

A. Pueden proveer especificidad y sensibilidad
para medir los analitos
B. Son inmunoglobulinas
C. Se unen al antgeno a travs de la regin de unin Fab
Revisin
Enumere tres clases de marcas usados en las tcnicas de

inmunoensayo:
1. ________________________________________
2. ________________________________________
3. ________________________________________
Revisin
Enumere tres clases de marcas usados en las tcnicas de

inmunoensayo :
Enzimas
1. ________________________________________
Compuesto radioactivo
2. ________________________________________
Compuestos generadores de luz
3. ________________________________________
Revisin
Un anticuerpo monoclonal individual se une a varios puntos

diferentes (eptopes) en un analito.
Verdadero
Falso
Revisin
Un anticuerpo monoclonal individual se une a varios puntos

diferentes (eptopes) en un analito.
Verdadero
Falso
Revisin
En los formatos de inmunoensayos no competitivos, la seal

medida es tpicamente _____________
a la concentracin de analito de la muestra.
A. Proporcional
B. Inversamente proporcional
Revisin
En los formatos de inmunoensayos no competitivos, la seal

medida es tpicamente _____________
a la concentracin de analito de la muestra.
A. Proporcional
B. Inversamente proporcional
Revisin
Qu tcnica de inmunoensayo se prefiere para proporcionar la

mayor sensibilidad y la mayor especificidad?
A. Competitiva de un paso
B. No competitiva de dos pasos
C. Competitiva de dos pasos
D. No competitiva de un paso
Revisin
Qu tcnica de inmunoensayo se prefiere para proporcionar la

mayor sensibilidad y la mayor especificidad?
A. Competitiva de un paso
B. No competitiva de dos pasos
C. Competitiva de dos pasos
D. No competitiva de un paso
Tecnologas de Deteccin del Inmunoensayo
Una vez finalizado este captulo, usted podr :

Describir las tcnicas de
RIA, EIA, FPIA, MEIA y CMIA
Identificar ensayos que utilizan tcnicas
Primeras Tcnicas de Inmunoensayo: RIA y EIA
El desarrollo de los inmunoensayos prcticos comenz en los aos 60
con la aplicacin de radioinmunoensayos (RIA). RIA utilizan istopos
radioactivos como marca (Figura 2-1), y la concentracin de
radioactividad medida indica la concentracin de analito presente.
Recuerde que en el formato sndwich no competitivo, a la izquierda en la
Figura 2-1, la concentracin de marca tiene relacin directa con la
concentracin de antgeno presente; mientras que en el formato
competitivo, a la derecha en la Figura 2-1, la concentracin de
antgeno tiene
relacin inversa con
la concentracin
de antgeno.
Figura 2-1 Los radioinmunoensayos (RIA) utilizan una marca de istopo radioactivo
RIA: an se usan en la actualidad, particularmente para la deteccin de

cantidades muy bajas de analitos. Sin embargo, debido a las
complicaciones inherentes al manipuleo y desecho de los materiales
radioactivos en el laboratorio clnico, RIA se usa con menos frecuencia
que otro tipo diferente de inmunoensayo, denominado inmunoensayo
enzimtico (EIA).
En EIA, las marcas de las enzimas se usan en lugar de las marcas
radioactivas. Las marcas tpicas de enzimas son la fosfatasa alcalina,
peroxidasa de rbano picante, y la galactosidasa B. Mientras que RIA usa
radioactividad para medir la concentracin de analito, EIA tpicamente
usa un cambio de color, emisin de luz, u otra seal. Se requiere un
equipo especfico para obtener la concentracin de enzimas presentes
midiendo el cambio especfico que ocurri.
ELISA, o Enzimo-inmunoensayo, representa una aplicacin

popular del inmunoensayo sndwich heterogneo de fase slida
que combina un reactivo marcado enzima-anticuerpo con un
anticuerpo unido a una fase slida. Un ensayo ELISA es un tipo de
EIA. Inicialmente, se utilizaban como material de base slida tanto
las placas de microttulo como las esferas de 1/4 de pulgada. Una
placa de microttulo es simplemente una placa plstica cuadrada
con pocillos de poca profundidad recubiertos con un analito.
Hacia fines de la dcada del 70 y durante los aos 80 y 90, se

lograron importantes avances en lo que se refiere a la
automatizacin y sensibilidad de los inmunoensayos, y EIA en
particular. Las tecnologas de inmunoensayos por polarizacin de
fluorescencia (FPIA) e inmunoensayo por micropartcula (MEIA)
representaron a las tecnologas predominantes durante algunos
aos. Ms recientemente, la tecnologa del inmunoensayo
magntico quimioluminiscente (CMIA) se ha aplicado como rutina
debido al significativo aumento de sensibilidad. Cada una de estas
tcnicas ser tratada ms detalladamente.
Inmunoensayo por Polarizacin de
Fluorescencia FPIA
Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia (FPIA) es un tipo
de inmunoensayo homogneo competitivo por fluorescencia. Con
la unin competitiva, el antgeno de una muestra y el reactivo
marcado antgeno-fluorescena (AgF) compiten por los puntos de
unin en el anticuerpo. Como inmunoensayo homogneo, la
reaccin se lleva a cabo en una solucin de reaccin simple, y el
complejo Ab-AgF no requiere un paso de lavado para separarlo de
la marca AgF libre.
Figura 2-2 Inmunoensayo competitivo por polarizacin de fluorescencia (FPIA)

Fluorescencia FPIA
FPIA se utiliza para proporcionar una medicin exacta y sensible
de pequeos analitos de toxicologa como pueden ser las drogas
teraputicas, y las drogas de abuso, toxicologa y algunas
hormonas. La aplicacin de FPIA al sistema TDx de Abbott
automatiz en gran medida los inmunoensayos manuales de otros
tiempos que requeran mucha mano de obra.
El reactivo FPIA incluye:
S: Reactivo para anticuerpo: Antisuero para analito
T: Indicador radioactivo (Tracer): analito marcado fluorescena
P: Detergente para pretratamiento:
facilita la liberacin de la droga de las protenas del suero
Fluorescencia FPIA
FPIA utiliza tres conceptos claves para medir analitos especficos
en un formato homogneo: fluorescencia, rotacin de molculas en
la solucin y luz polarizada.
Fluorescencia: La fluorescena es una marca fluorescente. Absorbe
la energa de la luz a 490nm y libera esta energa a una longitud de
onda superior (520nm) como luz fluorescente (Figura 2-3).
Figura 2-3
Deteccin de
fluorescencia en
complejos de conjugado
de fluorescena
Fluorescencia FPIA
Rotacin de Molculas en la Solucin: Las molculas ms grandes
rotan ms lentamente en la solucin que las molculas ms
pequeas. Este principio puede utilizarse para distinguir entre la
molcula ms pequea antgeno-fluorescena: AgF, que rota
rpidamente, y los complejos Ab-AgF ms grandes , que rotan
lentamente en la solucin.
Fluorescencia FPIA
Luz Polarizada: La tecnologa de polarizacin por fluorescencia
distingue la marca antgeno-fluorescena (AgF) del antgeno-
fluorescena (Ab-AgF) unido al anticuerpo por sus diferentes
propiedades de polarizacin por fluorescencia cuando son
expuestos a la luz polarizada (Figura 2-4).
Figura 2-4 Medicin de grandes complejos usando fluorescencia, rotacin,

y luz polarizada en FPIA
Fluorescencia FPIA
La luz polarizada describe ondas de luz que solamente estn
presentes en un plano simple del espacio. Cuando la luz
polarizada es absorbida por la molcula ms pequea AgF, la AgF
tiene la capacidad de rotar su posicin en la solucin rpidamente
antes de que la luz sea emitida como fluorescencia.
Figura 2-5 Los complejos ms pequeos en FPIA dan como resultado una seal de fluorescencia ms baja
Fluorescencia FPIA
La luz emitida se liberar en un plano diferente del espacio de
donde fue absorbido y por consiguiente se la denomina luz no
polarizada. Con el complejo Ab-AgF de mayor tamao, la misma
luz polarizada absorbida se libera como fluorescencia polarizada
ya que cuanto ms grande sea el complejo Ab-AgF no rota tan
rpidamente en la solucin. La luz es liberada en el mismo plano
del espacio como energa de la luz absorbida, y el detector puede
medirla.
Fluorescencia FPIA
Los resultados de FPIA se
muestran como una curva
inversa por cuanto a valores
bajos de analito del paciente
producen una seal ms alta (en
este caso, la seal es luz
polarizada).
Una seal alta a niveles bajos de
analitos del paciente dan como
resultado un ensayo muy
sensible (Figura 2-6).
Figura 2-6 FPIA da como resultado una relacin inversa

inferior entre la seal y la concentracin de
analito
Inmunoensayo por Micropartcula MEIA
El Inmunoensayo por micropartcula (MEIA) es una tcnica de

inmunoensayo que utiliza el aislamiento de complejos
anticuerpo/antgeno en una superficie de fase slida de pequeas
esferas denominadas micropartculas.
MEIA se ha adaptado ampliamente para automatizar la medicin
de molculas grandes como por ejemplo marcadores asociados al
anlisis cardaco, de fertilidad, de cncer, metablico, de hepatitis,
y de tiroides.
Los componentes de MEIA incluyen ,en suspensin en un buffer

especfico optimizado para el ensayo, lo siguiente: (Figura 2-7):
Fase Slida Micropartcula-Anticuerpo : Micropartculas de ltex que estn
recubiertas con un anticuerpo para unirse al analito especfico que est
siendo medido
Conjugado Anticuerpo-Enzima: Enzima Fosfatasa Alcalina unida al
anticuerpo
Sustrato de Enzima: Fosfatasa 4-Metil Umbelliferona Fluorescente (MUP)
en solucin, la que est disponible para una reaccin con la enzima en el
anticuerpo.
Figura 2-7
Componentes
de MEIA
En la figura 2-8 se puede ver un resumen de la forma en que los

componentes trabajan en combinacin con la muestra para
producir una seal y el correspondiente resultado de la prueba.
Observe cmo la matriz de fibra de vidrio sirve para fijar los
complejos. Tambin note que esta tcnica usa un formato no
competitivo, de modo que la concentracin de analito es
directamente proporcional a la concentracin de seal.
Las micropartculas recubiertas con
anticuerpos antianalito y muestra se
incuban juntas para formar una
mezcla de reaccin.
Se transfiere una alcuota de la

mezcla de reaccin a la matriz de
figra de vidrio.
Se deja que los anticuerpos

antianalito marcados con fosfatasa
alcalina se unan al complejo de
micropartculas.
Se agrega el sustrato Fosfato 4-

Metil Umbeliferona (MUP) a la
mezcla. Se mide el producto
fluorescente, metilumbeliferona
(MU).
Figura 2-8
Proceso de la
tcnica MEIA
Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente
CMIA
Los compuestos quimioluminiscentes tambin pueden usarse para

marcar analitos. Los compuestos quimioluminiscentes son distintos
de los marcados radioactivos, fluorescentes, y enzimticos.
Una marca quimioluminiscente produce luz cuando se lo combina
con un reactivo trigger. Aunque muchos instrumentos en el
laboratorio clnico se basan en la tecnologa quimioluminiscente, el
tipo especfico de marca vara y a menudo est patentado, y por
ello puede variar la performance.
CMIA
En el caso de Abbott ARCHITECT (de Abbott Laboratories, Chicago,
Illinois, Estados Unidos), por ejemplo, la marca es un derivado de
acridina patentado. Esta marca produce una alta emisin de luz, y por
consiguiente alta sensibilidad (es ms fcil medir una gran
concentracin de luz). El principio qumico se ilustra en la Figura 2-9.
Figura 2-9
marca de
quimioluminiscencia
para CMIA de
Abbott ARCHITECT
CMIA
Los pasos de la reaccin para ChemiFlex (marca comercial de la
versin de CMIA de Abbott) son muy similares a los de MEIA
descriptos anteriormente, y se los compara en la Figura 2-10.
Ambos utilizan la tecnologa de ensayo sndwich no competitiva
para medir analitos. Recuerde que en
estos dos inmunoensayos
no competitivos, la
concentracin de seal
medida es directamente
proporcional a la
concentracin de analito
presente en la muestra.
Figura 2-10 Comparacin de las tcnica MEIA y CHEMIFLEX

CMIA
Las tcnicas de MEIA y CMIA usan micropartculas para fijar

anticuerpos, pero existen otras similitudes y diferencias tambin
(Tabla 2-11). La marca, la etapa de separacin y la tecnologa de
medicin difieren entre estas dos tcnicas.
Etapa de
Tecnologa Fase Slida Separacin Marca Tecnologa de Deteccin
MEIA Micropartcula Matriz de Fibra Enzima Fosfatasa Detector de

de Ltex de Vidrio Alcalina Fluorescencia
CMIA Micropartcula Imn Compuesto Tubo Fotomultiplicador

Magntica Quimioluminiscente de Quimioluminiscencia
Figura 2-11 Comparacin de los pasos en las tcnicas MEIA y CMIA
Resumen
Existen cinco tcnicas de inmunoensayo que se resumieron en

este captulo.
Radioinmunoensayo (RIA): El anticuerpo o el antgeno se marcan con
radioactividad, y se usan en un formato no competitivo o competitivo.
Inmunoensayo enzimtico (EIA): El anticuerpo o el antgeno se marcan
con una enzima que convierte un sustrato en un producto con una seal
resultante que se mide, como por ejemplo cambio de color.
Resumen (cont.)
Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia (FPIA): Tpicamente se

marca el antgeno con una marca fluorescente y compite con el antgeno sin
marcar de la muestra. La rotacin relativamente lenta de las molculas grandes,
como tambin la capacidad de las partculas de movimientos lentos de polarizar la
luz se utilizan para obtener una medicin del nmero de partculas grandes de
anticuerpo-antgeno-fluorescena en la solucin. En este formato competitivo, la
concentracin de analito presente es indirectamente proporcional a la
concentracin de seal medida.
Inmunoensayo por Micropartcula (MEIA): Se cubre una micropartcula de fase
slida con anticuerpos en contra de un antgeno de inters, y se usa para capturar
el analito. Se marca el anticuerpo para la deteccin con un enzima al igual que en
EIA. La concentracin de analito es proporcional a la cantidad de seal medida.
Un formato sndwich no competitivo produce resultados que son directamente
proporcionales a la cantidad de analito presente.
Resumen (cont.)
Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente (CMIA):

Una marca quimioluminiscente se conjuga con el anticuerpo o antgeno,
y produce luz cuando se lo combina con su sustrato. Esta tcnica es muy
similar a MEIA, aunque la reaccin quimioluminiscente ofrece alta
sensibilidad y facilidad para la medicin. Un formato sndwich no
competitivo produce resultados que son directamente proporcionales a la
cantidad de analito presente.
Revisin
Enumere cuatro tecnologas de deteccin del inmunoensayo

(5 posibles)
1. ___________________________________________
2. ___________________________________________
3. ___________________________________________
4. ___________________________________________
5. ___________________________________________
Revisin
Enumere cuatro tecnologas de deteccin del inmunoensayo

(5 posibles)
Radioinmunoensayo
1. ___________________________________________
Inmunoensayo enzimtico
2. ___________________________________________
Inmunoensayo por polarizacin de fluorescencia
3. ___________________________________________
Inmunoensayo por micropartcula
4. ___________________________________________
Inmunoensayo magntico quimioluminiscente
5. ___________________________________________
Revisin
En la tecnologa FPIA:
A. La seal medida es directamente proporcional
a la concentracin de analito
B. La molcula Ag-Fluorescena rota rpidamente
y emite luz polarizada
C. Tanto el analito marcado como el analito sin marcar de la
muestra compiten por los puntos de unin del anticuerpo
Revisin
En la tecnologa FPIA:
A. La seal medida es directamente proporcional
a la concentracin de analito
B. La molcula Ag-Fluorescena rota rpidamente
y emite luz polarizada
C. Tanto el analito marcado como el analito sin
marcar de la muestra compiten por los puntos de
unin del anticuerpo
Revisin
La tecnologa FPIA se aplica usando cul de las siguientes

opciones?:
A. Ensayo homogneo
B. Formato no competitivo
C. MEIA
D. Ensayo heterogneo
Revisin
La tecnologa FPIA se aplica usando cul de las siguientes

opciones?:
A. Ensayo homogneo
B. Formato no competitivo
C. MEIA
D. Ensayo heterogneo
Revisin
Qu tipo de fase slida utiliza MEIA?:

A. Micropartculas magnticas
B. Placas de microttulo
C. Micropartculas de ltex
D. Esferas de 1/4 pulgada
Revisin
Qu tipo de fase slida utiliza MEIA?:

A. Micropartculas magnticas
B. Placas de microttulo
C. Micropartculas de ltex
D. Esferas de 1/4 pulgada
Revisin
Cul de las siguientes opciones tpicamente representa

la marca ms sensible?
A. Quimioluminiscencia
B. Enzima
C. Fluorescencia
D. Micropartcula
Revisin
Cul de las siguientes opciones tpicamente representa

la marca ms sensible?
A. Quimioluminiscencia
B. Enzima
C. Fluorescencia
D. Micropartcula
Factores de Impacto en el Rendimiento
Analtico del Inmunoensayo
Una vez finalizado este captulo, usted podr:

Describir la exactitud y la precisin en lo que se refiere a
inmunoensayos
Discutir el uso de calibradores y controles en estos ensayos
Comprender los riesgos potenciales para las pruebas de
inmunoensayo, particularmente interferencias del efecto hook en
concentraciones elevadas y los anticuerpos humanos anti-ratn
(HAMA)
Introduccin
Los fabricantes de inmunoensayos pasan un tiempo importante
determinando qu tcnica de inmunoensayo es la ms apropiada para un
analito especfico con el fin de asegurar resultados de calidad superior.
En muchas instancias, se modifica una tcnica particular, quizs con el
agregado de un componente especial del reactivo, para combatir algunos
obstculos comunes y as obtener resultados ptimos.
A veces estos desafos se deben a sustancias que interfieren, presentes

en la sangre, problemas inherentes a la tecnologa de medicin y/o a
tcnicas de laboratorio. Este captulo tratar la forma en que se optimizan
los inmunoensayos para asegurar resultados de alta calidad que dan
como resultado un ptimo cuidado del paciente. En este captulo se trata
el impacto de la calibracin, material de control, interferencias, y los
efectos hook en concentraciones elevadas.
Los Inmunoensayos Deben Ser Exactos y Precisos
La exactitud y la precisin en los inmunoensayos son fundamentales para
la utilidad de los mismos (Figura 3-1). Exactitud significa que el ensayo le
est dando la respuesta correcta tanto al bioqumico como al mdico, y
est describiendo la cantidad de analito realmente presente. A menudo
se lo ilustra con una flecha dando en el blanco.
Exacto Preciso Sensible Especfico
Figura 3-1
Da en el Da en el Capacidad de Capacidad de Exactitud, precisin,
centro del mismo excluir falsos excluir falsos sensibilidad,
blanco blanco negativos positivos especificidad en los
inmunoensayos
Los Inmunoensayos Deben Ser Exactos y Precisos
Precisin en los inmunoensayos significa que la combinacin de
reactivos, analizador, y otros factores de influencia puede
proporcionar resultados reproductibles. Puede compararse con la
flecha dando en el mismo punto del blanco, una y otra vez, aunque
no necesariamente en el centro.
Exactitud es la capacidad de medir la concentracin correcta de
analito en una muestra. Los inmunoensayos pueden ser exactos
pero imprecisos, precisos pero inexactos, o ambas cosas, exactos
y precisos.
Tpicamente se cree que la sensibilidad y la especificidad clnicas

son subconjuntos de la exactitud y la precisin. Si un ensayo tiene
la capacidad de generar resultados con exactitud y en forma
reproductible que no produzcan falsos positivos, entonces se lo
considera especfico. Un falso positivo significa que un resultado
puede indicar errneamente que existe una cierta condicin de un
paciente (el resultado positivo realmente no identifica a un
paciente que es positivo).
En un anlisis de hepatitis, por ejemplo, un falso positivo significa

que el ensayo indic que un paciente es positivo para hepatitis,
cuando no lo es. Esto puede ocurrir por muchas razones, pero en
la mayora de los casos se debe a que la metodologa del ensayo
no puede distinguir entre el analito deseado que se est midiendo
y uno que se comporta igual que ese (tal vez comparten
estructuras moleculares similares, pero fisiolgicamente tienen un
efecto diferente sobre el organismo).
Se considera que un ensayo muestra sensibilidad clnica cuando

en forma exacta y reproductible puede asegurar que no ocurren
falsos negativos. Volviendo al ejemplo del anlisis de hepatitis, el
bioqumico no quiere entregarle al mdico un resultado que
errneamente indique que un paciente no tiene hepatitis cuando s
la tiene. Si el paciente es realmente positivo para hepatitis, un
ensayo con sensibilidad clnica deficiente que no pueda detectar
niveles muy bajos de hepatitis (no es lo suficientemente sensible)
puede indicar falsamente que el paciente es negativo para hepatitis
(no tiene hepatitis).
Calibracin y Controles en los Inmunoensayos
Impacto del Calibrador en los Inmunoensayos
Los calibradores son soluciones con valores conocidos que establecen la
relacin entre la cantidad de seal producida en el ensayo y la
concentracin de analito. Al correr un set de calibradores, en el software
del instrumento se produce una curva de calibracin (Figura 3-2)
(bsicamente una curva de respuesta a la concentracin como se tratara
anteriormente) y se establece
una correlacin entre ciertos
valores de la seal para las
concentraciones de analito
conocidas.
Figura 3-2 Curva de calibracin de una muestra
Al comparar con esta curva de calibracin los niveles de seal
producidos por las muestras de un paciente, se puede determinar
el valor de concentracin de analito de un paciente, o el resultado.
Es muy importante que se trate adecuadamente el material de
calibracin de acuerdo con el inserto de fabricacin, y que el
criterio de aceptacin sea el apropiado, as se puede establecer
una correcta curva de calibracin.
Si la calibracin no es correcta, los resultados del paciente
correspondiente no sern correctos. La mayora de los aspectos de
la calibracin estn automatizados en los analizadores para
inmunoensayos actuales, aunque los calibradores lquidos,
refrigerados y listos para usar aseguran menos posibles errores
por parte del operador comparados con aquellos que necesitan ser
reconstituidos o descongelados manualmente.
Tambin es importante que el fabricante elija la matriz correcta

para los calibradores. La matriz es el solvente que contiene al
analito en el calibrador (o control). Es para asegurar que la
respuesta de la seal de la curva de calibracin sea idntica a la
seal de las muestras de los pacientes. Las matrices pueden ser a
base de suero animal, acuosas, o derivadas de otros materiales.
Impacto del Control en los Inmunoensayos
Los controles son muestras que contienen concentraciones

conocidas de analito. Se utilizan para monitorear la exactitud y la
precisin del rendimiento de un ensayo y de un analizador. Si el
control se encuentra dentro del rango, se supone que el
rendimiento de los reactivos y del analizador es correcto y que el
anlisis del paciente puede comenzar. Es tpico hacer un ensayo
de los controles en cada corrida, turno o da, dependiendo del
analito y/o del analizador y del inserto de fbrica. Tpicamente se
lleva a cabo el anlisis usando una Tabla de Levey Jenning (Figura
3-3).
Impacto del Control en los Inmunoensayos
Este tipo de grfico traza los valores del control e indica si se estn
desarrollando posibles tendencias al respecto. Si los controles tienden a
subir o bajar (o por el contrario se comportan de una manera no
aceptable), probablemente indica algn problema del reactivo, la
calibracin, o el analizador que puede estar afectando los resultados de
un paciente de una manera similar.
Muchas de las mismas
consideraciones que se
discutieron anteriormente
para Calibracin tambin
son relevantes para los
controles, como asegurar
el mnimo error por parte
del operador y usar una
matriz base apropiada que
sea idntica a las muestras
de los pacientes. Figura 3-3 Tabla de Levey Jenning para anlisis y seguimiento de controles
Interferencias en los Ensayos
Los inmunoensayos de un paso pueden tener tendencia a las

interferencias que afectan tanto la sensibilidad como la
especificidad. En la mayora de los casos las interferencias se
deben a agentes que interfieren en la unin de anticuerpos con
antgenos por varias razones.
Interferencias en los Ensayos
En este captulo, nos ocuparemos de las interferencias que se deben
al efecto hook en concentraciones elevadas y a anticuerpos
humanos anti-ratn. En general, es ms probable que los ensayos en
secuencia (de dos pasos) proporcionen resultados exactos eliminando
la contribucin adversa de las protenas de unin, sustancias
endgenas de interferencia y efectos generales de la matriz, debido al
paso extra de lavado (Figura 3-4).
Figura 3-4
Efecto hook en concentraciones elevadas
Efecto Hook en Concentraciones Elevadas :
Exceso de Antgeno (Fenmeno Prozona)
La posibilidad de que exista un efecto hook en concentraciones
elevadas es un fenmeno inherente a los diseos de los ensayos
sndwich de un paso. Las concentraciones muy elevadas de
antgeno en la muestra del paciente se unen a todos los sitios
disponibles saturndolos, tanto en el anticuerpo- fase slida
como en el anticuerpo- conjugado marcado y as evitar la
formacin sndwich.
Bajo estas condiciones, el nivel medido de analito puede ser
significativamente ms bajo que el nivel real presente en la
muestra. El efecto hook en concentraciones elevadas se refiere al
gancho que se observa en la curva de respuesta a la
concentracin cuando la informacin se traza como una seal
versus la concentracin de analito (Figura 3-4). Este efecto hook
en concentraciones elevadas tambin se denomina efecto prozona.
Anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)
Otra forma de interferencia en los inmunoensayos es la presencia

de anticuerpos humanos anti-ratn (HAMA). Estos anticuerpos
pueden estar presentes en la sangre humana como consecuencia
de la respuesta inmunolgica del cuerpo al estar expuesto a
antgenos de ratn.
Existen varias razones para que un sistema inmunolgico humano
produzca anticuerpos para combatir antgenos invasores que
derivan de la exposicin a ratones. Por ejemplo, los anticuerpos
monoclonales del ratn se usan en algunos tratamientos para el
cncer. Un sistema inmunolgico humano tambin puede producir
una respuesta a los ratones si el paciente est en contacto con
ellos. Tambin es comn la exposicin ambiental a los ratones.
Las muestras de pacientes que contienen HAMA pueden producir

resultados falsamente elevados (falso positivo) o reprimidos (falso
negativo) en los inmunoensayos que utilizan anticuerpos
monoclonales de ratn. Los ensayos sndwich por lo general son
los ms susceptibles a la interferencia HAMA.
Para evitar los efectos prozone (efectos hook

en concentraciones elevadas), se pueden
disear los ensayos usando un formato de
ensayo de dos pasos, el cual usa pasos de
lavado para eliminar el exceso de antgeno.
Falsos Positivos Debidos a HAMA: En el caso de falsos positivos,

se forma un ensayo sndwich y as se produce la seal, aunque no
haya presente analito del paciente (Figura 3-5). HAMA se une
tanto al anticuerpo de captura
de fase slida como
al reactivo de anticuerpo
marcado. Por lo tanto
parece como si el analito
estuviese presente en la
muestra del paciente,
causando el complejo.
Figura 3-5 Cmo HAMA genera un falso positivo
Falsos Negativos Debidos a HAMA: HAMA puede provocar

resultados del ensayo falsos negativos por medio de dos
mecanismos: unindose y bloqueando al anticuerpo de captura de
fase slida, o unindose y bloqueando al reactivo de anticuerpo
marcado.
Figura 3-6
Cmo HAMA
genera un falso
negativo
Los fabricantes utilizan varias tcnicas para minimizar el impacto

de HAMA incluyendo:
Diseo real de dos pasos para eliminar las interferencias
Bloqueadores para reducir o eliminar las interferencias ocupando
los puntos de unin en los anticuerpos HAMA.
Los bloqueadores son nicos para la formulacin de

cada ensayo y algunos ejemplos pueden ser
detergentes, protenas depuradas y suero animal.
Resumen
Exactitud significa que el ensayo est dando la respuesta

correcta, midiendo la cantidad de analito realmente presente en la
muestra.
Precisin significa que el ensayo mide la cantidad de analito de
una manera reproductible cada vez.
Sensibilidad clnica y especificidad clnica se refieren a la
capacidad del ensayo de generar resultados exactos y
reproductibles que minimicen la cantidad de falsos positivos y
falsos negativos que ocurran.
Calibradores son muestras de concentracin conocida usados
para establecer los parmetros del analizador o instrumentos.
Resumen
Controles son muestras de concentracin conocida que se usan

para monitorear la exactitud y la precisin de un analizador y un
ensayo.
El efecto hook en concentraciones elevadas, tambin
denominado efecto prozona es un tipo de interferencia que puede
reducir la exactitud y la precisin de los inmunoensayos. Bajo
condiciones de exceso de antgeno, el ensayo lee una
concentracin de antgeno inferior a la que realmente se encuentra
presente.
Resumen
Otro tipo de interferencia se debe a la presencia de anticuerpos

humanos anti-ratn (HAMA) que pueden estar presentes en el
suero de pacientes que hayan sido tratados con anticuerpos de
ratn para alguna terapia, o se hayan expuesto a ratones de
alguna otra manera.
Los inmunoensayos de dos pasos pueden reducir la
interferencia de un efecto hook en concentraciones elevadas o
la presencia de anticuerpos HAMA.
Revisin
La capacidad de un ensayo de dar en forma reproductible con una

concentracin fijada se denomina:
A. Especificidad
B. Sensibilidad
C. Precisin
D. Exactitud
Revisin
La capacidad de un ensayo de dar en forma reproductible con una

concentracin fijada se denomina:
A. Especificidad
B. Sensibilidad
C. Precisin
D. Exactitud
Revisin
Con cul de las siguientes opciones puede eliminarse

la interferencia de efecto hook por exceso de antgeno?:
A. Metodologa de inmunoensayo de dos pasos
B. Metodologa de inmunoensayo de un paso
C. Disminucin del reactivo de anticuerpo
D. Disminucin del reactivo de soporte slido
Revisin
Con cul de las siguientes opciones puede eliminarse

la interferencia de efecto hook por exceso de antgeno?:
A. Metodologa de inmunoensayo de dos pasos
B. Metodologa de inmunoensayo de un paso
C. Disminucin del reactivo de anticuerpo
D. Disminucin del reactivo de soporte slido
Revisin
La interferencia de HAMA puede eliminarse

metodologas de inmunoensayo de dos pasos.
Verdadero
Falso
Revisin
La interferencia de HAMA puede eliminarse

metodologas de inmunoensayo de dos pasos.
Verdadero
Falso
Revisin
Los anticuerpos HAMA se producen como resultado de:

A. Exposicin del paciente a ratones
o a protenas de ratn
B. Contaminacin de la muestra
con protenas de ratn
C. Inmunizacin
D. Alergias a los alimentos
Revisin
Los anticuerpos HAMA se producen como resultado de :

A. Exposicin del paciente a ratones
o a protenas de ratn
B. Contaminacin de la muestra
con protenas de ratn
C. Inmunizacin
D. Alergias a los alimentos
Revisin
Los calibradores son muestras de individuos que se sabe que

estn dentro del rango normal usados para verificar el
funcionamiento del instrumento.
Verdadero
Falso
Revisin
Los calibradores son muestras de individuos que se sabe que

estn dentro del rango normal usados para verificar el
funcinamiento del instrumento.
Verdadero
Falso
Ejemplos de Pruebas
que Utilizan Inmunoensayos
Ejemplos de Pruebas que Utilizan Inmunoensayos
Una vez finalizado este captulo, usted podr :

Nombrar varias clases de pruebas que utilizan
tecnologa de inmunoensayo.
Describir el uso de pruebas especializadas para hormonas
endocrinas, dao cardiovascular, antgenos de hepatitis,
y antgenos tumorales.2
2 El auspiciante de esta Gua educativa, Abbott Laboratories, no hace

representaciones de este u otros productos dentro o fuera de los Estados Unidos.
Introduccin
Al concluir los captulos uno al tres de esta Gua de Entrenamiento,

usted habr aprendido varias tecnologas y tcnicas utilizadas en la
aplicacin de inmunoensayos.
El presente captulo tratar sobre la aplicacin de estas distintas
tcnicas de inmunoensayo para pruebas de laboratorio especficas.
Existen cuatro clases principales de inmunoensayos especializados
que sern tratados: hormonas endocrinas, marcadores cardacos,
antgenos de hepatitis y antgenos tumorales.
Tipos de Pruebas Especializadas Hormonas Endocrinas
Las hormonas generalmente son producidas en glndulas

endocrinas especficas y se transportan a las clulas a travs del
sistema circulatorio. Los ejemplos de glndulas endocrinas
incluyen hipotlamo, lbulo pituitario anterior, glndula tiroidea,
ovario, testculo, corteza suprarrenal, placenta, y pncreas. Las
hormonas juegan varios roles para mantener el funcionamiento
normal del cuerpo y medir los niveles de estas hormonas puede
ser crucial para diagnosticar una enfermedad o para monitorear el
tratamiento. Varias hormonas claves se miden tpicamente a travs
de la tecnologa de inmunoensayo (ver Tabla 4-1).
Categora de Punto Primario de
Hormona Anlisis Accin Funcin
Tirotrofina (TSH) Tiroides Glndula Tiroidea Estimulacin de la secrecin de la hormona
tiroidea
Tiroxina (T4) y Tiroides Tejido Corporal Estimulacin del consumo de oxgeno
Triyodotironina (T3) General y de la tasa del metabolismo del tejido
Tiroxina Libre (fT4) y Tiroides Tejido Corporal Formas libres de las hormonas tiroideas que se
Triyodotironina Libre (fT3) General encuentran en el suero, no unidas a otras
protenas, de ah, libre; se cree que son la
medida ms exacta del estado tiroideo.
Cortisol Metablico Tejido Corporal Metabolismo de hidratos de carbono, protenas,
General y grasas
Hormona Fertilidad Ovarios, Testculos Crecimiento de folculos y secrecin de
Foliculoestimulante (FSH) estrgeno, y ovulacin
Hormona Luteinizante (LH) Fertilidad Ovarios, Testculos Ovulacin, secrecin de progesterona
Prolactina Fertilidad Glndula Mamaria Crecimiento de la glndula mamaria, iniciacin

de la produccin de lecha
Estrgeno Fertilidad rganos Sexuales Desarrollo de caractersticas sexuales

Femeninos. Auxiliar. secundarias
Progesterona Fertilidad Estructura Preparacin del tero para la implantacin del
Reproductiva vulo, mantenimiento del embarazo
Femenina. Auxiliar.
Testosterona Fertilidad rgano Sexual Desarrollo de caractersticas sexuales
Masculino. Auxiliar. secundarias
Gonadotrofina Corinica Embarazo/ Ovarios, Testculos Mantenimiento de la funcin del cuerpo lteo,
Humana (hCG) Fertilidad ovulacin, secrecin de progesterona
Tabla 4-1 Hormonas Endocrinas Medidas a travs del Inmunoensayo
Indicadores de Lesin Cardiovascular
El anlisis de inmunoensayo es de gran ayuda para evaluar el

dao cardaco durante o despus de un infarto de miocardio (o
ataque al corazn). A menudo se llevan a cabo anlisis de
inmunoensayo para protenas especficas liberadas durante y
despus de un ataque cardaco, para un diagnstico y monitoreo
de la condicin del corazn. Tales marcadores incluyen troponina,
mioglobina, CK-MB, y ms recientemente Pptido Natriurtico del
tipo B y Protena Reactiva C de alta sensibilidad (hsCRP). Los
marcadores se enumeran en la Tabla 4-2.
Marcador de Lesin Cmo se Correlacionan los Niveles con la Lesin
Cardaca Descripcin Cardiovascular
Troponina-I Protena que se libera de Los niveles aumentan a las 4 horas despus del infarto de
las clulas musculares miocardio; solo o mejor an cuando se lo combina con
muertas o daadas del pruebas para CK-MB (ver abajo), es un anlisis de
corazn diagnstico muy confiable; permanece elevado hasta 8
das posteriores a la lesin.
Mioglobina Protena que se Se libera ante el dao de algn msculo; los niveles
encuentra en el corazn aumentan a las 2 horas despus del infarto de miocardio;
y otros msculos, los niveles vuelven a los rangos de referencia a las 24
importante para horas aproximadamente; se lo considera un anlisis de
transportar el oxgeno a diagnstico prematuro muy sensible, especialmente junto
las clulas musculares con otros marcadores de infarto de miocardio.
Creatinine Una forma de la enzima Los niveles aumentan a las 4 o 6 horas despus del infarto
Kinase-MB (CK- que se encuentra de miocardio; los inmunoensayos rpidos son tiles para
MB) principalmente en los los diagnsticos de emergencia; se lo considera una
msculos del corazn y prueba estndar en el diagnstico de infarto de miocardio.
que se libera ante algn
dao
Pptido Hormona de la protena Los niveles elevados indican lesin o stress en el
Natriurtico del que se libera del ventrculo izquierdo del corazn, lo que incluye infarto de
tipo B (BNP) ventrculo izquierdo del miocardio, hipotensin (presin sangunea baja), o stress
corazn cuando est del msculo ventricular por la acumulacin de sangre y
daado fluido como en un ataque cardaco congestivo.
CRP de Alta Protena liberada en el Puede ser til para predecir riesgo de otro infarto de
Sensibilidad suero en respuesta a miocardio, en el caso de que ya haya ocurrido uno; sin
(hsCRP) una lesin, infeccin, e embargo, deben considerarse mltiples disparadores
inflamacin para la produccin de CRP al interpretar los resultados.
Tabla 4-2 Marcadores de Dao Cardiovascular
Hepatitis
La hepatitis es la inflamacin del hgado, y pueden causarla

virus, bacterias, frmacos, toxinas o la ingestin excesiva de
alcohol. En parte, debido al desarrollo de los inmunoensayos, se
han identificado cinco virus distintos que causan hepatitis: Hepatitis
A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, y Hepatitis E. Cada virus
puede ser individualizado usando tcnicas de inmunoensayo (ver
Tabla 4-3).
Familia del Virus Vas de Transmisin Aparicin Incubacin Mortalidad
Virus de la Hepatitis A Va Fecal Oral Generalmente 15 45 das Alrededor del 0.3%
(HAV): Picornaviridae; abrupto
enterovirus pequeo, ARN
de una sola hebra
Virus de la Hepatitis B Agujas contaminadas, Generalmente Promedio de 60 90 0.5 1.0%
(HBV): Hepadnaviridae; transfusiones con insidioso das
virus ADN de cadena doble sangre no analizada,
Extensin 45 180 das
parcialmente tatuajes, contacto sexual
Virus de la Hepatitis C Similar a HBV Insidioso 2 26 semanas 0.2 0.4%; proceso
(HCV): Flaviviridae; virus crnico a menudo sin
ARN de una sola hebra sntomas que puede
producir cirrosis hasta
en un 30% de los
pacientes infectados
Virus de la Hepatitis D Similar a HBV Generalmente 21 90 das 2 20% con
(HDV): abrupto coinfeccin, hasta un
virus ARN de una sola hebra 30% con
sobreinfeccin
Virus de la Hepatitis E Ingestin de agua Generalmente Promedio de 40 das Alrededor del 1 2%,
(HEV): contaminada, higiene abrupto 15 20% en mujeres
Extensin 15 60 das
Apariencia de calicivirus; personal deficiente embarazadas
virus ARN de una sola hebra
Table 4-3 Tipos de Hepatitis detectados por Inmonoensayos
Hepatitis
Todos los tipos de hepatitis virales afectan las clulas hepticas.

Los individuos infectados con un virus de hepatitis tienden a
padecer sntomas generalizados, que en la primera etapa son
similares a la gripe. Los sntomas incluyen fatiga, dolor
muscular/articular, prdida del apetito, nuseas, diarrea,
fiebre e ictericia.
Debido a que los sntomas no son especficos, se requieren
inmunoensayos para distinguir entre los virus especficos. Las
pruebas de hepatitis se utilizan tanto para screening como para
monitoreo. Por favor consulte la Gua de Entrenamiento sobre
Hepatitis de Abbott Diagnstico para obtener ms detalles.
Marcadores Tumorales
Las clulas tumorales pueden producir protenas que se detectan

en suero por medio del inmunoensayo, y estas protenas se
conocen como marcadores tumorales. Los marcadores tumorales
generalmente son especficos para un cierto tipo de cncer. La
medicin de los marcadores tumorales puede ser til para el
diagnstico y monitoreo de diferentes tipos de cncer, y estas
pruebas pueden usarse para detectar cncer y monitorear la
progresin del tratamiento (ver Tabla 4-4).
Clases Ejemplo Localizaciones del Cncer
Hormonas Gonadotropina Corinica Humana (hGC) Testicular, Mama, Tracto GI , Pulmn,
Ovario
Antgenos Alfafetoprotena (AFP) Test Sindrome de Down, Estmago.
Oncofetales Esfabo, Ovario
Antgeno Carcinoembrionario (CEA) Colon rectal, Tracto GI , Pulmn, Mama
Antgeno Prosttico Especfico (PSA) Prstata
Marcadores CA 15-3, CA 549, CA 27-29 Cncer de Mama
de
Carbohidratos Ca 125 Carcinoma de Ovario y Endometrio
Antgenos del CA 19-9 Pncreas, Tracto GI
Grupo
Sanguneo Ca 50 Pncreas, Tracto GI
Ca 72-4 Ovario, Tracto GI
CA 242 Pncreas, Tracto GI
Protenas Monoclonal IgA, Monoclonal IgG Mieloma Mltiple
Monoclonal IgM, B2-Microglobulina Macroglobulinemia Waldenstrom
Nota: no todos los inmunoensayos del mercado estn

Tabla 4-4 Marcadores Tumorales Detectados por inmunoensayo aprobados por normas gubernamentales para todas
las indicaciones mencionadas arriba.
Idealmente, los marcadores tumorales seran 1) especficos para el

rgano objetivo, y 2) producidos en una concentracin lo
suficientemente grande como para ser detectados con exactitud en
pacientes con cncer pero no en una poblacin normal.
Desafortunadamente, con la posible excepcin de PSA
(marcador comn usado para indicar la presencia de cncer de
prstata), rara vez se logran ambas caractersticas.
Por lo tanto, en la prctica clnica, los marcadores tumorales se
usan ms como ayuda en el diagnstico en combinacin con otras
pruebas de diagnstico (p. ej., MRI), y para monitorear la
progresin de la enfermedad despus de su deteccin y
tratamiento.
El porcentaje y la magnitud de la reduccin de los marcadores

tumorales se usa para evaluar la eficacia del tratamiento. Despus
del tratamiento, el marcador tumoral debera reflejar si aquel ha
sido exitoso.
Un descenso del nivel del marcador tumoral reflejara una
respuesta positiva al tratamiento mientras que un mnimo cambio
en el nivel del marcador tumoral reflejara una respuesta pobre al
tratamiento.
Si el tratamiento es exitoso, entonces una vez que el nivel del
marcador tumoral se ha estabilizado en un nuevo nivel inferior, las
mediciones de seguimiento del marcador programadas en forma
regular son de ayuda para determinar la estabilidad de la
enfermedad.
Pruebas Congnitas
Tambin se encuentran disponibles los inmunoensayos que miden
ciertos agentes infecciosos que son especialmente perjudiciales si
un feto est expuesto. Estos ayudan a diagnosticar proactivamente
alguna infeccin de la paciente y a prevenir un dao en ella o en el
feto (Tabla 4-5).
Condicin Mdica que Puede
Prueba Factor que se Mide ser Causa de la Infeccin
Rub IgG y Rub IgM Anticuerpos IgG o IgM Causa una erupcin que generalmente es leve en nios y
para Rubeola adultos; la infeccin durante el embarazo puede ser
perjudicial para el feto y provocar aborto, muerte, y
deficiencias de nacimiento
Toxo G y Toxo M Anticuerpos IgG o IgM Defectos del sistema nervioso central, especialmente si la
para Toxoplasmosis infeccin tiene lugar en el primer trimestre del embarazo;
causa principal de muerte en paciente con SIDA
CMV G y CMV M Anticuerpos IgG o IgM Neumona intersticial, mononucleosis, deficiencias
para Citomegalovirus congnitas de nacimiento, aborto, retraso mental, ceguera
y sordera
Tabla 4-5 Pruebas para Factores Congnitos
Pruebas Congnitas
Las pruebas para exposicin a la Rubeola, Toxoplasmosis, y CMV

son de especial importancia para el screening de embarazadas y
gente con inmunosupresin. Los recin nacidos, pacientes con
SIDA, pacientes con cncer, y quienes hayan recibido un
transplante de rgano son susceptibles de enfermarse si se
exponen a estas enfermedades, mientras que las personas con
sistemas inmunolgicos normales luchan contra las infecciones en
forma exitosa. Los recin nacidos pueden padecer alguna infeccin
si sus madres estn expuestas durante el embarazo.
Pruebas Congnitas
Existen pruebas para detectar anticuerpos IgM e IgG que son

especficos para virus particulares en los pacientes. Si un paciente
es positivo en anticuerpos IgM, recientemente ha estado expuesto
al virus y se encuentra preparando una pronta respuesta
inmunolgica. Si un paciente es positivo en anticuerpos IgG,
estuvo expuesto por lo menos varios meses antes de la prueba, y
puede ser un infectado crnico.
El tipo de anticuerpo que se encuentra en los recin nacidos
tambin puede ayudar al mdico a descubrir si el infante adquiri
en forma pasiva anticuerpos de la madre, o si l se infect con el
virus. Estas pruebas proporcionan informacin importante acerca
de infecciones actuales y pasadas en poblaciones susceptibles.
Pruebas Metablicas
Los inmunoensayos tambin estn disponibles para una amplia

variedad de indicadores de funciones metablicas y deficiencias
nutricionales. Las deficiencias especficas pueden surgir como
resultado de dietas inadecuadas, o como indicio de alguna
enfermedad fisiolgica, como la anemia. Existen mltiples formas
de anemia que requieren un cuidadoso diagnstico y tratamiento.
Algunos ejemplos de estos tipos de pruebas y sus indicaciones se
detallan en la Tabla 4-6.
Pruebas Metablicas
Condicin Mdica que Puede

Prueba Factor que se Mide ser Causada por una Infeccin
Ferritina Protena que almacena hierro para Los niveles de ferritina en suero se correlacionan
ser usado posteriormente por con la cantidad de hierro almacenado; niveles
mltiples tejidos del cuerpo bajos indican anemia
o dieta deficiente
Vitamina Vitamina, cobalamina, que ayuda a Las deficiencias pueden causar anemia
B12 formar glbulos rojos que llevan macroctica, enfermedades neurolgicas, y
oxgeno a los tejidos del cuerpo pueden ser un indicio de enfermedades
autoinmunes y otros desrdenes del tracto
digestivo
Folato Vitamina que es cofactor en Las deficiencias durante el embarazo pueden
diversas rutas metablicas causar defectos de nacimiento en la columna
vertebral; la deficiencia de la vitamina B12 y del
folato pueden llevar a una anemia megaloblstica
Tabla 4-6 Pruebas para Factores Metablicos
Otras Pruebas y Tecnologas de Inmunoensayo
Muchos otros analitos se analizan usando inmunoensayos. Un

ejemplo es el uso de ensayos turbidimtricos para las pruebas de
protenas especficas en analizadores de qumica clnica. Los
inmunoensayos tambin se usan para analizar los niveles de
drogas teraputicas en suero, lo que puede ser de utilidad para
asegurar la dosis adecuada de medicamentos para un paciente
individual.
Las pruebas para drogas de abuso son otra aplicacin de los
inmunoensayos.
Resumen
Este captulo se centr en ejemplos de inmunoensayos

comnmente usados en el entorno clnico. Se describieron seis
categoras de pruebas.
Hormonas Endcrinas: Entre los ensayos para una variedad de
hormonas tiroideas, de fertilidad, y de embarazo se incluyen las pruebas
para tirotrofina, hormona foliculoestimulante, testosterona, y otras.
Indicadores de Dao Cardiovascular: Los ensayos para las protenas
liberadas por el msculo daado del corazn tras un ataque cardaco son
tiles para el diagnstico y tratamiento de esta condicin. Entre las
pruebas se incluyen aquellas para medir troponina, mioglobina, Creatinine
Kinase-MB, Pptido Natriurtico del tipo B , y otros marcadores cardacos.
Antgenos de Hepatitis: Los ensayos para cada una de las cinco cepas
de virus de Hepatitis se utilizan con fines de diagnstico y monitoreo.
Resumen
Antgenos Tumorales: Los ensayos para antgenos especficos

producidos por clulas cancergenas pueden usarse para diagnstico y
monitoreo, e incluyen antgeno especfico de prstata (PSA) para cncer
de prstata y alfa fetoprotena (AFP) para cncer testicular, entre otros
ejemplos.
Agentes Infecciosos Congnitos: Los ensayos de suero para los
anticuerpos IgM e IgG en personas expuestas a agentes infecciosos
como la Rubeola, Toxoplasmosis, y Citomegalovirus (CMV) son tiles
para diagnosticar y monitorear la posible infeccin, particularmente en
mujeres embarazadas para determinar el riesgo de defectos de
nacimiento de sus hijos.
Metablicos: Los ensayos para protenas y vitaminas que intervienen en
el metabolismo pueden medirse, incluyendo la ferritina como medida de
los niveles de almacenamiento de hierro, y las vitaminas B12 y folato.
Revisin
Las pruebas para cul de las siguientes opciones no se

cuantifican rutinariamente usando inmunoensayos:
A. TSH
B. AFP
C. Glucosa
D. Folato
Revisin
Las pruebas para cul de las siguientes opciones no se

cuantifican rutinariamente usando inmunoensayos :
A. TSH
B. AFP
C. Glucosa
D. Folato
Revisin
Una prueba para hCG se clasificara como:

A. Ensayo para tiroides
B. Marcador de hepatitis
C. Marcador de embarazo
D. Marcador de cncer
Revisin
Una prueba para hCG se clasificara como :

A. Ensayo para tiroides
B. Marcador de hepatitis
C. Marcador de embarazo
D. Marcador de cncer
Revisin
Cul de los siguientes son los cinco virus principales

que causan hepatitis viral:
A. HBV1, HBV2, HBV3, HBV4,
y Virus de Epstein-Barr
B. HAV, HBV, HCV, HDV, HEV
C. Ictericia y sus cuatro subtipos
D. Ninguna de las opciones anteriores
Revisin
Cul de los siguientes son los cinco virus principales

que causan hepatitis viral :
A. HBV1, HBV2, HBV3, HBV4,
y Virus de Epstein-Barr
B. HAV, HBV, HCV, HDV, HEV
C. Ictericia y sus cuatro subtipos
D. Ninguna de las opciones anteriores
Revisin
Los paneles de la hepatitis viral se usan para:

A. Diagnstico
B. Monitoreo
C. Screening
Revisin
Los paneles de la hepatitis viral se usan para:

A. Diagnstico
B. Monitoreo
C. Screening
Revisin
Un paciente que es positivo por anticuerpos IgG para Rubeola

estuvo expuesto recientemente al virus y est preparando una
respuesta inmunolgica temprana.
Verdadero
Falso
Revisin
Un paciente que es positivo por anticuerpos IgG para Rubeola

estuvo expuesto recientemente al virus y est preparando una
respuesta inmunolgica temprana.
Verdadero
Falso
Bibliografa y Sugerencias
para una Estudio ms Profundo
Harlow E, Land D, eds. Antibodies: A Laboratory Manual.

New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1988.
Wild D, editor. The Immunoassay Book. New York:
Stockton Press;1994.
Moore WT, Eastman RC, eds. Diagnostic Endocrinology.
Toronto: BC Decker; 1990.
Kricka L. Human anti-animal antibody interferences
in immunological assays. Clin Chem. 1999; 45:942-956.
Glosario
Afinidad medida de la atraccin entre un punto simple del

antgeno y un anticuerpo simple con ese punto.
Analito sustancia, conjunto de sustancias, o factor
que se analizar.
Anticuerpo glicoprotena producida por los linfocitos B en
respuesta a la exposicin a un antgeno y se une especficamente
a ese antgeno.
Antgeno sustancia que es capaz, bajo condiciones apropiadas,
de inducir una respuesta inmune especfica y de reaccionar con el
producto de esa respuesta (anticuerpo o especficamente linfocitos
T sensibilizados).
Glosario
Exceso de antgeno la presencia de exceso de antgeno en

relacin con la concentracin de anticuerpo, provoca una
desestimacin de la concentracin de antgeno (a veces
denominado efecto prozona).
Antisuero suero que contiene anticuerpos.
Avidez la intensidad combinada de reactividades de un
anticuerpo y un antgeno, representando la afinidad neta de todos
los puntos de unin en el antisuero.
Calibrador material de caractersticas conocidas (concentracin,
actividad, reactividad) usado para calibrar o ajustar un
procedimiento de ensayo. El material debera tener las mismas
caractersticas de rendimiento que las muestras para la prueba en
ese procedimiento.
Glosario
Quimioluminiscencia emisin de luz a travs de una reaccin

qumica que incluye la oxidacin de un compuesto orgnico por
medio de un oxidante (por ejemplo perxido de hidrgeno).
Sensibilidad clnica la capacidad de una prueba para clasificar
correctamente a los pacientes que padecen una enfermedad
produciendo un resultado de la prueba verdadero positivo.
Especificidad clnica la capacidad de una prueba para clasificar
correctamente a los pacientes que no padecen una enfermedad
produciendo un resultado de la prueba verdadero negativo.
Curva de respuesta de concentracin describe la relacin
entre la seal del ensayo y la concentracin de analito.
Glosario
Eptope regin nica en un antgeno que se une a un anticuerpo
especfico.
ELISA (Enzimo-inmunoensayo) inmunoensayo que utiliza un
anticuerpo marcado con un marcador enzimtico. El cambio en la
actividad enzimtica como resultado de la reaccin enzima-
anticuerpo-antgeno es proporcional a la concentracin de
antgeno y se puede medir.
Resultado falso positivo de un ensayo resultado positivo de
una prueba que se obtiene de una muestra realmente negativa.
Resultado falso negativo de un ensayo resultado negativo de
una prueba que se obtiene de una muestra que realmente contiene
un analito.
Polarizacin por fluorescencia ocurre cuando una molcula
absorbe luz a una longitud de onda y reemite luz a una longitud de
onda mayor.
Glosario
HAMA (Anticuerpo Human Anti Ratn) producido en los seres

humanos como respuesta inmune luego de una exposicin a
anticuerpos de ratn.
Inmunocomplejos complejos formados por la unin de
molculas de antgenos y anticuerpos, con o sin fijacin del
complemento.
Inmunoglobulina protena compuesta por cadenas pesadas y
livianas y que funciona como un anticuerpo.
Anticuerpos monoclonales anticuerpos que se producen in
vitro por una lnea celular que se origina en una clula simple.
Todas las molculas son de tipo y subtipo simple y poseen una
especificidad antignica simple.
Glosario
Inmunoensayo no competitivo inmunoensayo en el cual el

analito de la muestra y el analito marcado se presentan en forma
consecutiva al anticuerpo de la reaccin.
Precisin punto hasta el cual los anlisis de replicacin de una
muestra concuerdan entre s. Estadsticamente, es lo contrario de
la varianza de una medicin o clculo.
Radioinmunoensayo (RIA) ensayo cuantitativo para la
deteccin de reacciones antgeno-anticuerpo usando sustancia
marcada radioactivamente para medir la unin de sustancia sin
marcar a un anticuerpo especfico o receptor.
Ensayo sndwich se usa para describir un inmunoensayo, que
combina analitos entre dos anticuerpos especficos.
Gracias
Abbott Divisin Diagnstico
Global Marketing: Inmunoqumica

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Muestra (Ag) Tcnica

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Figura 2-2 Inmunoensayo competitivo por polarizacin de fluorescencia (FPIA)

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En la figura 2-8 se puede ver un resumen de la forma en que los

Se transfiere una alcuota de la

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Los compuestos quimioluminiscentes tambin pueden usarse para

Figura 2-10 Comparacin de las tcnica MEIA y CHEMIFLEX

Las tcnicas de MEIA y CMIA usan micropartculas para fijar

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CMIA Micropartcula Imn Compuesto Tubo Fotomultiplicador

Figura 2-11 Comparacin de los pasos en las tcnicas MEIA y CMIA