Conceptos bsicos en Inmunohematologa

Dr E Muiz-Diaz
Laboratorio de Inmunohematologa
Banc de Sang i Teixits
Barcelona (Espaa)
 Inmunohematologa
La IH es la parte de la Hematologa que se ocupa de los
procesos inmunes relacionado con las clulas sanguneas.

Estos procesos estn producidos por anticuerpos (Acs) que

reaccionan con antgenos (Ags) presentes en la membrana
de las clulas sanguneas.

Los Acs son inmunoglobulinas: las de clase IgG e IgM son

las ms habituales.

Los antgenos (Ags) son estructuras de la membrana

(proteinas, glcidos, lpidos, o combinaciones de ellos) con
capacidad inmunognica: capaces de desencadenar una
respuesta inmune.
 Inmunohematologa
Los Ags y los Acs son los grandes protagonistas de la IH, y los
estudios inmunohematolgicos realizados para el diagnstico
de los procesos inmunes de la sangre se basan en poner en
evidencia la reaccin Ag-Ac.

Reaccin Ag-Ac

Ags en los Anticuerpos Aglutinacin

Hemates Hemlisis
 Inmunohematologa. Antgenos.

La parte del Ag que reacciona con el Ac es el determinante antignico

o eptopo.

Cada antgeno est constituido por un nmero variable de eptopos.

 Inmunohematologa. Antgenos.
G
Los Ags presentes en R
los hematies son los U
Ags eritrocitarios. P
Los Ags codificados por
O
un mismo Gen, o por genes
S homlogos muy prximos
Los Ags de las entre s
plaquetas son los Ags S
plaquetarios. A
N
G
Los Ags de los U
granulocitos son los Sistema de
antgenos N grupo sanguneo
granulocitarios. E
O
S
 Inmunohematologa. Anticuerpos.

Los Acs son proteinas

plasmticas que se producen
en respuesta a un antgeno.

Al realizar un proteinograma
aparecen varias bandas, con
2 grandes fracciones
correspondientes a la
albmina y a las globulinas
(1, 2, 1, 2 y ).

Los Acs se sitan en la

fraccin denominada , y por
su relacin con la inmunidad
se denominan
Inmunoglobulinas (Ig).
 Inmunoglobulinas

Las Igs est formadas por 4

Regin Fc
cadenas, dos pesadas y dos
ligeras, debido a su peso
molecular, que estn unidas
por puentes disulfuro.

Cada cadena tiene una regin

constante en todas las Igs y
una variable.

Se conocen 5 clases de Igs

(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) que
Regin Fab
se diferencian entre s por la
cadena pesada.
Inmunoglobulinas
 Importancia clnica de los Acs
Los Acs ms importantes en
transfusin e IH son los de
clase IgG e IgM, y muy de
lejos, IgA.

Los Acs de clase IgG son

incompletos porque no son
capaces de aglutinar
espontneamente a los
hematies.

Los Acs de clase IgM son

completos o aglutinantes
porque son capaces de
aglutinar espontneamente a
los hemates.
 Clasificacin de los Acs segn su origen

Naturales. Aparecen sin estimulacin detectable.

La mayora son IgM, o bien mezclas de IgG+IgM.

Regulares. Aparecen siempre que se carece del antgeno

correspondiente (ABO).
Irregulares. No siempre aparecen cuando no se posee el
Ag (P1, Le, E...).

Inmunes. Se detectan despus de un estmulo

antignico (transfusin, embarazo...). Son casi
siempre IgG.

Tambin son Acs irregulares.

 Clasificacin de los Acs segn el Ag
contra el que van dirigidos
Aloanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag extrao no
presente en la persona que lo
produce.
Los Acs dirigidos contra los
Ags eritrocitarios. Anti-Rh(D)
en un indivduo Rh(D-).

Autoanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag propio.
Son los responsables de los
procesos autoinmunes.
Procesos en IH que exigen la deteccin de Acs

IH eritrocitaria
Pruebas de compatibilidad transfusionales Aloanticuerpos
Enfermedad hemoltica del RN Aloanticuerpos
Anemia hemoltica autoinmune Autoanticuerpos

IH plaquetaria
Trombocitopenia neonatal aloinmune Aloanticuerpos
Prpura postransfusional Aloanticuerpos
Prpura trombocitopnica autoinmune (PTAI) Autoanticuerpos

IH granulocitaria
Neutropenia neonatal aloinmune Aloanticuerpos
Lesin pulmonar aguda-AT (TRALI) Aloanticuerpos
Neutropenias autoinmunes Autoanticuerpos
 Una regla bsica en el diagnstico
inmunohematolgico

La deteccin de un aloanticuerpo en el suero de un
paciente exige, siempre que sea factible, la confirmacin
de la ausencia del correspondiente antgeno.
Por ej. Una gestante portadora de anti-D debe ser Rh(D-).

1. Investigaremos la presencia de anticuerpos en su suero

Suero problema + hematies de grupo conocido Rh(D+ y D-)

2. Comprobaremos la ausencia del Ag en la gestante

Ac conocido (anti-RhD) + hemates de la gestante

 La reaccin Ag-Ac es la base del
diagnstico inmunohematolgico
Los resultados posibles de
la reaccin Ag-Ac pueden
ser:
Aglutinacin
Hemlisis. Aglutinacin

Las tcnicas empleadas

para poner en evidencia
estos fenmenos son
Hemlisis
fundamentalmente las
tcnicas serolgicas.
 Tcnicas serolgicas: Aglutinacin
Es el agregado de hemates que se forma cuando las
molculas de Ac se unen a los determinantes antignicos
(Ags) de mltiples clulas adyacentes.

Algunas molculas son capaces de unirse a los Ags y de interaccionar con

otras molculas induciendo la aglutinacin final (IgM).

Otras molculas slo se unen a su antgeno pero no son capaces de hacerlo

con sus vecinas y de producir la aglutinacin (IgG).
 Tcnicas serolgicas: Aglutinacin

La aglutinacin es un
proceso qumico reversible
que se produce en dos
fases:
Fase de Sensibilizacin: unin del
Ac con el Ag.
Fase de Aglutinacin: formacin
de puentes entre las clulas
sensibilizadas hasta constituir la
red que conduce a la aglutinacin.

Son muchos los factores que

inciden en estas dos fases y
que podemos manipular para
aumentar, o disminuir, la
aglutinacin.
 Factores que afectan a la fase de
Sensibilizacin
1. Temperatura.

2. pH.

3. Tiempo de incubacin.

4. Tipo de anticuerpo: clase de Ig.

5. Proporcin de Ag y Ac.

6. Constante de afinidad del anticuerpo.

1. Temperatura
Los Acs IgG reaccionan de
forma ptima a 37C
(calientes).
Los Acs IgM reaccionan de
forma ptima a 4C o a TA.
(fros).

2. pH
El pH ptimo para la reaccin
est entre 6.9 y 7.2.
Algunos Acs necesitan de un 5. Proporcin de Ag y Anticuerpo
medio cido para actuar.
Tiene que haber una relacin
entre el nmero de molculas
3. Tiempo de incubacin de Ac y el de lugares
El estado de equilibrio sin antignicos.
potenciadores es de 15 a 60
min.

4. Tipo de Anticuerpo 6. Constante de afinidad del Ac

IgM: aglutinante en solucin
salina.
IgG: no aglutinante. Habr
que potenciar la aglutinacin.
A mayor afinidad del Ac mayor
es la velocidad de asociacin y
ms lenta la disociacin.
 Factores que afectan a la fase de
Aglutinacin
1. Intensidad inica del
medio (Potencial Z). 2. Tipo de Ac
El potencial Z es la Los IgM siempre aglutinan.
diferencia de potencial entre Los IgG raramente (segn la
el hemate cargado localizacin del eptopo del Ag).
negativamente y la nube de
cargas positivas del medio.
Es el responsable de la +
fuerza de repulsin de los + CARGA POSITIVA:
hemates. + + + CATIONES DEL MEDIO

+
+ + +
CARGA NEGATIVA:
SIALOGLICOPROTEINAS
HEMATIE + +
DE LA MEMBRANA
+ + +
+
++
+
 Ausencia de
aglutinacin

nube de
iones
+ Ig G
anticuerpo
+ incompleto
+ +
+ +++
+ + +
+ ++ + + +
14 nm + + +
+ ++ 25 nm
+ + +
+ ++ ++ +
++ ++ +
+ + ++
+
+
35 nm

Ig M
anticuerpo
completo

Aglutinacin
 Potenciadores de la reaccin Ag-Ac
Souciones de baja fuerza inica (LISS)
- Aceleran la fase de sensibilizacin al disminuir la carga negativa.
- Suele requerir una sustancia no inica para evitar la hemlisis (Glicina).

Albmina
- Reduce la repulsin entre clulas (potencial Z) favoreciendo la aglutinacin.
- Hace posible que Acs IgG sean capaces de unir hemates adyacentes.

Enzimas
- Bromelina, ficina, papaina,tripsina, pronasa y neurominidasa.
- Reducen la carga negativa. Hacen aglutinantes a los Acs IgG.
- Mejoran el acceso a los lugares antignicos.

Molculas cargadas positivamente

- Son polmeros que aportan un exceso de carga positiva: polybrene, sulfato de
protamina, poli-L-Lisina, que pueden producir una aglutinacin espontnea.
- Pueden dar falsos positivos.
PEG
- Es un polmero soluble que potencia la reaccin Ag-Ac eliminando el agua que hay
alrededor de los hemates.
- til para la deteccin de Acs de clase IgG.
El test de la antiglobulina (Test de Coombs)
En 1945 Coombs, Mourant y Race disearon una tcnica
para poner en evidencia a los Acs que no eran capaces de
aglutinar directamente a los hematies (IgG).

1. La base es la utilizacin de un suero anti-Inmunoglobulina

humana o, anti-C, (suero antiglobulina) que acta como un
puente de enlace entre los Acs que se han fijado.

2. Originalmente se emple para demostrar anticuerpos Rh(D)

incompletos o no aglutinantes (IgG) en el suero.

3. Posteriormente, para detectar la sensibilizacin in vivo de

hemates por anticuerpos, o factores del C, (autoanticuerpos)
en pacientes afectos de Anemia hemoltica autoinmune.

Es el test ms importante en Inmunohematologa

 Cmo se obtiene la antiglobulina humana?

Inyeccin
plasma humano o de
Igs especficas

Suero de Coombs:
anticuerpos contra las
fracciones Fc de las Igs humanas

Antiglobulina Poliespecifica / Polivalente: Anti-Igs (mayorit. IgG) + C3d

Antiglobulina Monoespecifica: Anti IgG, anti IgM, anti IgA, anti C3d
Aplicaciones de la tcnica de la antiglobulina

Prueba directa Prueba indirecta

AHAI: autoacs. Tipificacin:

-Ac conocido y Ag desconocido.
Hemlisis inducida por
frmacos.
Deteccin e identificacin
de Acs:
EHRN: RN con CD+.
-Ac desconocido y Ag
conocido.
Reacciones aloinmunes:
- Ac fijado a hemates Pruebas cruzadas.
transfundidos.
 TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA

Test directo:

Indicaciones:
Anemia hemoltica autoinmune
Enfermedad hemoltica del recin nacido
Hemlisis por frmacos
Reacci hemoltica post-transfusional
 TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA

Test indirecto:

suero hematies hematies anticuerpos aglutinacin

paciente reactivo sensibilizados anti-IgG y/o C

Indicaciones:
Deteccin e identificacin de anticuerpos anti-eritrocitarios
Pruebas de compatibilidad pre-transfusional
Tipificacin de antgenos eritrocitarios que no son visualizados
por aglutinacin directa
Sensibilizacin: reaccin Ag-Ac
El suero antiglobulina se une al fragmento Fc de los Acs IgG
El suero antiglobulina acta como puente entre los Acs IgG
favoreciendo la aglutinacin
Aglutinacin final
 Comparacin entre el Coombs Directo
e Indirecto
Coombs Directo
Detecta Acs (IgG) y/o C
directamente fijados a los
hemates en estudio.
La sensibilizacin se ha producido
espontneamente en el organismo del
paciente.
La tcnica requiere 1 paso.
Los hemates son examinados
directamente con la antiglobulina
humana.
Coombs Indirecto
Detecta Acs (IgG) y/o C fijados
a los hemates, procedentes del
suero en estudio.
La sensibilizacin de los hemates
se ha provocado al incubar el suero
en estudio con los mismos.
La tcnica requiere 2 pasos.
La prueba exige una incubacin previa
(suero+hemates) antes de aadir la
antiglobulina humana.
 Mtodos para observar la Aglutinacin

La tcnica en tubo Es la tcnica estndar

Ventajas
Se pueden aadir aditivos
Permite la manipulacin
Es visible la hemlisis

Desventajas
La aglutinacin es inestable
Requiere experiencia en la
manipulacin y lectura cuidadosa 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 0
 Mtodos para observar la Aglutinacin

Aglutinacin en columna / tarjeta La columna contiene gel, microesferas...

Utilizan aditivos (LISS) para potenciar la reaccin Ag-Ac y reducir el tiempo

de incubacin.
La reaccin es semipermanente y puede evaluarse horas-das despus.

Ventajas
Entrenamiento mnimo y poca
manipulacin.
Se requieren pocos reactivos.

Desventajas
Requiren equipamiento
Muy sensibles
Equipamiento en la tcnica de
aglutinacin en columna
Prinicipio de la aglutinacin en Gel
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-
 Mtodos para observar la Aglutinacin

Tcnica en fase slida en microplacas

8 Se utilizan microplacas
de plstico con 96 pocillos.

8 Permite automatizacin.

8 Muy til para grandes

series.
 Tcnica en Fase Slida (Microplaca)

Hemates o estromas
eritrocitarios de composicin
antignica conocida, fijados en los
pocillos de una
microplaca.

Se aade el suero a estudiar y se

incuba; posteriormente
se lava la placa para eliminar el
exceso de anticuerpo.

El anticuerpo fijado se detecta

aadiendo un reactivo de
antiglobulina conjugado en enzima
o con hemates
sensibilizados recubiertos con
antiglobulina.
 Tcnica en Fase Slida (Microplaca)

Ventajas:
- Sensibilidad parecida al PEG
- Larga caducidad
- Lectura de resultados automatizable.

Desventajas:
- La fase de lavado de las microplacas es delicado.
- Se puede automatizar, pero encarece los costes.
- No es prctica para muestras aisladas.
- Ideal para series largas de muestras.
 El Complemento
Es un sistema de 25-30 proteinas sricas y de la membrana que
actan en cascada para producir diversos efectos biolgicos,
entre ellos la lisis de los hemates.

Se encuentran en estado inactivo o de proenzimas, y tras su

activacin se convierten en enzimas activos.

La activacin se produce:

por va clsica: reaccin Ag-Ac

por va alternativa: bacterias, virus, proteinas o carbohidratos ajenos.

Nueve componentes estn numerados de C1 a C9.

Activacin completa del Complemento

C1qrs rompe C4 y C2 en 2 fragmentos: C4a y C4b y C2a y C2b.

C4b y C2a se unen para formar la C3 covertasa que rompe C3 en C3a y C3b.
C3 convertasa se une a C3b para formar la C5 convertasa que rompe C5 en dos
fragmentos, etc.
El complejo de proteinas de ataque lo forman el grupo de C5 a C9 que acaban
produciendo agujeros en la misma y la hemlisis subsiguiente.
Activacin incompleta del
Complemento (C3d)
Receptor macrofgico para el receptor Fc

Macrfago

Fc de Igs
Jk a

Hemate
 Receptor macrofgico para C3b

Macrfago

Ca ++
Ca ++
C1s C1r
C1q

C4b
C2a
C3b
Jka Jka

Hematie
 Reaccin transfusional
IgG
Reaccin Habitualmente extravascular
retardada Anti-Jka y anti-Jkb

Activacin incompleta del C

Reaccin Intravascular / Extravascular

inmediata anti-A y anti-B

IgM
Activacin completa del C
 KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

Tcnicas moleculares. Aplicaciones

La tcnica ms comn es la PCR: PCR-ASRA, PCR-ASP, Discriminacin
allica con tecnologa Taqman.

1. En pacientes transfundidos o con Coombs directo positivo

podemos determinar el genotipo. (Ej. Hemoglobinopatas).

2. Definir las variantes RhD y confirmar el carcter positivo o

negativo de la muestra.

3. Confirmar el grupo ABO en las discordancias srico-hemticas.

4. Buscar donantes con determinados genotipos (Ej. Dombrock)

cuando no se dispone de antisueros.

5. Determinar la zigosidad exacta de clulas de Panel (Ej. Fy(a+b-)

puede ser Fya/Fya, Fya/Fy, Fya/Fyx.

6. Anlisis del genotipo fetal: RhD, Rhc, K. Permite aplicar un

programa profilctico racional.
Gracias por su atencin

Barcelona vista desde el Parque Gell