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Purificacin de protenas
Para qu les puede servir a ustedes la purificacin de protenas, si un mdico va a comprar todo en polvo,
en una cajano tiene que purificar nada? sta es mi opinin: para leer papers. Porque cuando lean un
artculo cientfico y estn trabajando con una protena (sobretodo si es una protena nueva), va a aparecer
en metodologas cmo se purific esa protena, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para
seguir esa metodologa y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la
literatura cientfica de protenas que son emergentes o de algn artculo clsico en el cual se indique cmo
se purific el ?. Y para qu tambin les sirve? Es un pretexto para poner en prctica todo lo que hemos
aprendido desde ac hacia atrs.
Veamos la separacin de protenas. A ver, aqu hay dos elementos que son importantes cuando uno separa
una protena, y de qu la estamos separando? Imagnense, tenemos una clula, las clulas tienen miles de
protenas, y miles de tipos de molculas, que no son protenas, no todas son protenas. Lo que nosotros nos
proponemos es aislar UNA protena, una sola (y probablemente est en muy baja concentracin) para
hacer estudios de funcionalidad y saber esa protena en qu tipo de proceso biolgico est. Aislar esa
protena tiene un desafo doble: 1) que ojal pueda aislar mucha protena, de tal manera que la pueda
manipular fcilmente, o sea hablar de mg. y g. de protenas purificadas para hacer estudios con esa
protena, y 2) ojal que esa protena que yo aslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el
polvo, por ejemplo), esa protena, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no
tenga contaminantes. No me sirve una protena que est muy contaminada para un estudio de
funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo ltimo que dije) y de rendimiento
(que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cunto estoy obteniendo, y la pureza tiene
que ver con qu estoy obteniendo. Entonces todas las tcnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un
compromiso entre Rendimiento y Pureza, de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o
sea para obtener gramos de una protena, necesito sacrificar la pureza de la protena. Y otras veces para
obtener mucha pureza, necesito sacrificar el rendimiento porque supone hacerla pasar a travs lneas
sucesivas de purificacin, que hacen que yo vaya perdiendo protena en el camino, pero me estoy
asegurando que esa protena va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se
contraponen y por lo tanto la purificacin de la protena supone un compromiso entre purificacin y
rendimiento. Entonces, vamos a ver distintas tcnicas, y muchas de estas tcnicas se utilizan una a
continuacin de la otra, de tal manera que me asegure que el producto est puro. Pero probablemente hay
un orden obligado de algunas tcnicas y por ejemplo una de las tcnicas que primero se aplica en un
compuesto, en un extracto del cual yo quiero purificar una protena es la Precipitacin Salina y les voy a
explicar por qu.
Precipitacin Salina
Qu es lo que hay que hacer primero si yo quiero obtener una protena? Vamos a poner un ejemplo
verdico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal, as que les dir que
purifiqu una vez la protena de la alcayota, s, la alcayota, y es una enzima proteoltica, es decir, capaz de
romper protenas, es decir, hidroliza el enlace peptdico. Entonces, qu deba hacer yo para purificar la
enzima de la alcayota? (la enzima proteoltica). Es una enzima ya?, la mayora de las enzimas son
protenas. Recientemente se est hablando que hay RNA que tienen actividad enzimtica, por eso hago el
alcance, pero realmente, y en general, las enzimas son protenas. Entonces, haba una enzima que rompa
protena (que era la enzima proteoltica de la alcayota), y haba que purificarla. Qu haran? Romper la
alcayota cierto?, sacar la pulpa. Sacamos el jugo de la alcayota. Aqu tenemos que tomar una decisin.
Primero, la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular, no hay ningn problema en
sacarle el juguito. Si es intracelular hay que romper toda la clula para que la enzima salga, as que ya
tenemos un primer problema. Tendra yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota, de tal manera
que me asegure que estn todos los citoplasmas expuestos digamos y la protena por tanto la puedo
obtener en el exudado de la alcayota. As que, de acuerdo, sta es extracelular y es fcil, sacamos el
juguito a la alcayota. Qu hacemos? Tengo pedazos de alcayota, tengo la cochina no msqu hago?
Filtro. Colamos, filtramos. Y despus tengo un jugo que yo supongo que es relativamente puro. Una de
las primera tcnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba), lo que uno hace es aplicar
sal, para variar la solubilidad de las protenas. Y cuando agregamos sal, suceden dos cosas. Y veamos la
protena B en este grfico:
Fig. 1. Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una protena:
- Solubilizacin por salado.
- Precipitacin por salado.
Y esto es
solubilidad
versus
concentracin de sal. Primero aumenta la solubilidad y despus disminuye la solubilidad. Por qu? De
qu modo aumenta? Primero, pensemos, vienen de poco soluble, qu significa que sean poco soluble?
cmo estn entre s? se quieren o se odian? Se quieren, se abrazan. Si son hidrofbicas estn juntas
porque los dems las rechazan cierto? Si son hidroflicas estn juntas porque tienen afinidad mutua, y por
lo tanto no interactan tanto con el agua. Si fuese as, diramos que tienen poca solubilidad. [pregunta k
es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto depende de la pareja solvente-soluto.
Y hasta aqu no ms disuelve la protena del agua, hasta aqu no ms con esa concentracin de sal, esta
concentracin de sal es la mxima [q disuelve]. Y lo que pasa es que para interferir con la afinidad que hay
entre molculas de las protenas que hacen que se vayan al fondo y no interacten con el agua, necesito
agregar sal, para que la sal se interponga en la interaccin entre las protenas, de tal manera que las cargas
de la protena interacten ms bien con la sal que con la misma protena, y como la sal es soluble, todo
feliz. El problema es cuando agrego ms sal, porque voy a llegar a un mximo de solubilidad con la
protena B, pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilizacin por saldo [cuando la curva sube] y
a ste [cuando la curva baja], salting-out = precipitacin por salado) agrego ms sal, por qu empiezan a
precipitar las protenas? [un nio responde algo de que le kitan el lugardisminuyen las interacciones con
las protenas]. Exacto, entonces las protenas se sienten rechazadas y precipitan. Ahora, esto es espicfico
para una protena, la protena B, la protena A y C van a responder de manera distinta, y ESE es el secreto
para purificar. Porque significa que si yo agrego una oncentracin de sal determinada va a haber protenas
ms solubles que otras. Por ejemplo a sta concentracin, la soluble va a ser la C y las insolubles la B y la
A. [Seala en el grfico, cuando la curva C est arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo
centrifugo este compuesto a esa concentracin de sal, voy a obtener precipitado de A y B, y soluble de C,
y as me quedo con la protena C. Uds. dirn: pero si esto no precipita completamente, bueno obvio ,
si es la primera etapa de purificacin, pero indudablemente enriquec la protena C. Y lo mismo pasa si
agrego poquita sal, voy a tener ms soluble la A que la B y la C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de
las protenas y eso es empleado como una etapa primera de purificacin de protenas. Ojal no la
denature, porque si la denatura, sonamos con la purificacines difcil renaturar las protenas. No se dice
redenaturar, se dice Renaturar
Cmo puedo ver una protena que es microscpica? Cmo puedo saber que la protena est presente?
Viendo la funcionalidad de la protena.
Qu es la solubilidad? (una vez ms) cantidad mxima de soluto que se puede disolver en un solvente
determinado, por lo tanto depende de la pareja solvente- soluto , as que hasta aqu no mas disuelve la
protena del agua , hasta aqu no mas con esta concentracin de sal, hasta aqu no mas esta concentracin
de sal es la mxima. Y lo que pasa es que, para interferir con la afinidad que hay entre las molculas de la
protena, que hace que se vayan al fondo y no interacten con el agua, necesito agregar sal, para que la sal
se interponga en la interaccin entre las protenas, de tal manera que las cargas de las protenas interacten
mas bien con la sal que con la misma protena, y como la sal es soluble, todos felices. El problema es
cuando agrego mas sal, porque voy a llegar a un mximo de solubilidad con la proteina B, a eso se le
llama salting in, y a este proceso que viene salting out, que significaria (solubilidad por salado, y
precipitacin por salado)
Entonces salting in le denominamos a esta primera fase, y cuando agregamos mas sal, porque empiezan
a precipitar estas protenas? Porque ah la sal empieza a interactuar con el agua, no permite que las
proteinas lo hagan, y por lo tanto a las protenas no les queda mas que interactuar entre si, se sienten
rechazadas y luego precipitan. Ahora esto es especifico para la proteina B, la proteina A y C van a
reaccionar de manera distinta, y ese es el secreto para purificar, porque significa que si yo agrego una
concentracin de sal determinada, va a haber proteinas ms solubles que otras. Por ejemplo a esta
concentracin X, la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B, y significa que si yo
centrifugo ese compuesto a esa concentracin de sal, voy a obtener precipitado de Ay B, soluble de C y
me quedo con esa proteina. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificacin,
pero indudablemente enriquec la proteina C si agrego sal. Y lo mismo podra pasar si agrego poquita sal,
voy a obtener mas oluble la A, que la B y C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso
fue empleado como una etapa primaria de purificacin Ojala no la denature, por que si lo hace no se puede
purificar, porque es difcil renaturar.
Ahora piensen que tal vez esa protena tena una molcula que
siempre la acompaa y que la inhiba o bajaba su actividad, probablemente esa molcula en ese paso salga
y la pierda. Entonces tengo que tener conciencia del proceso que estoy aplicando, porque estoy
introduciendo modificaciones en la muestra, y probablemente haya algn factor que sea importante para la
actividad de la enzima, y que a lo mejor encenda o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si
era de bajo peso molecular, as que puede que suceda y puede que no. Si son molculas de alto peso
molecular, se aplican otras tcnicas ms gruesas, y se va afinando con otras mas especificas.
Cuando uno trabaja con una protena que no se conoce, se debe estar atento a todos los resultados y tratar
de interpretarlos.
Esa era una segunda etapa de purificacin, y es bastante gruesa. Ahora yo tomo los extractos que obtengo
ac, y los ocupo en tcnicas que voy mostrando a continuacin.
Entonces aqu agregamos una muestra, una gota que se resuelve en 3 manchas, son 3 aminocidos
distintos que estoy separando. Entonces los identifico, porque despus los roco con un colorante para
aminocidos ( hay uno que interacta con el grupo alpha amino, que se llama ninhidrina, y ese colorante
cuando se roca sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente sospecho
que era por ejemplo aspartico, glutmico y fenilalanina, y pondr en paralelo los mismos pero comprados
y comparo los Rf, y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho, por ejemplo, si el que pienso
es aspartico, y migra igual que el aspartico es porque debe serlo.
Qu podemos decir? Bendita tcnica, porque permite separar de una manera con mucha resolucin
protenas que normalmente no eran separadas por otra tcnica, la cromatografa en gel de poliacrilamida.
Puedo separar DNA a travs de esta tcnica? no se usa, porque el SDS no se va a pegar al DNA, por gel
de agarosa separo DNA, como les deca en la tabla.
Qu sucede, ahora, en el ejemplo que tenemos ah?