Pre-requisito

CLAVE
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE
QUERTARO
FACULTAD DE QUMICA

Laboratorio integral de
bsicas

Nombre de la prctica: Prctica Pgina Pginas de

Evaluacin del efecto de la fase mvil y el 11 s la
flujo en la separacin de dos compuestos
mediante HPLC

Realiz: Sesin Mircoles Revis: Autoriz:

Fecha: 12 de octubre de 2016 Fecha: Fecha:

Contenido Pgina
I. INTRODUCCIN
II. OBJETIVO
III. METODOLOGIA
III. 1. Material y equipo.
III. 2. Reactivos y soluciones.
III. 3. Requerimientos de seguridad
III.4. Disposicin de residuos
III. 5. Procedimiento.
III. 6. Diseo experimental (si lo hay)

IV. RESULTADOS.
IV.1 Clculos

V. DISCUSIN.
VI. CONCLUSIONES.
VII. BIBLIOGRAFA

I. INTRODUCCIN
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II. INTRODUCCIN

En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una

columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el
resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas
fases, mvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto
rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por
la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.

La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales

lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de
alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se
encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.
Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las
industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica.

Es necesario conocer las caractersticas del equipo con el que se cuenta en el

laboratorio para poder analizar correctamente los resultados obtenidos debido a que
la fase mvil puede ser isocrtica en la cual se mantiene constante o de gradiente para
muestras complejas, en la cual hay una variacin en su composicin. La columna tiene
una longitud de 150 mm, un dimetro de 4.6 mm y una fase estacionaria C18 cuyo
grupo ligando es octadecil (-(CH 2)17-CH3), la cual es ampliamente utilizada para un
empleo general. sta es no polar, por lo que nos ayudara a separar compuestos no
polares o de polaridad media. Es decir, se utiliza una fase en reversa: fase mvil polar
y fase estacionaria no polar. Por lo que al seleccionar diferentes fases mviles se
obtendrn resultados diferentes, ya que dependiendo de la polaridad de la fase mvil
se observarn interacciones diferentes en ambas fases.

Esto de igual manera tiene mucho que ver con la interaccin que se tenga con el
analito, si la fase estacionaria es no polar, interaccionar con analitos no polares, as
que es mejor utilizar columnas no polares para analitos no polares.
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Principio del HPLC

La cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) es una tcnica utilizada para separar
e identificar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no
polar (columna) y fase mvil. La fase mvil acta de portador de la muestra.
La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas
entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria.
Se basa en la elucin de los componentes de una muestra, la cual comprende el
lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase mvil a travs de una columna
de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porcin de muestra se
introduce por la parte superior de la columna (tiempo t 0), los componentes se
distribuyen por s mismos entre las dos fases segn la naturaleza qumica de stos
con respecto a la fase mvil y estacionaria. Adiciones posteriores del disolvente llevan
a las molculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una
tiempo determinado (tx).

Efectos de variables sobre una separacin cromatogrfica

Los principales parmetros a controlar en la cromatografa de lquidos de alta

eficiencia son el pH, el flujo, la polaridad de la fase mvil, y el tamao de la muestra.

El flujo es la cantidad de mL de fase mvil por minuto. Dependiendo del flujo, el tiempo
de retencin vara. Esto es lgico recordando que el tiempo de retencin es el tiempo
requerido por cada componente para recorrer toda la columna, y que el tiempo de
retencin depende del volumen de retencin, es decir el volumen de la fase mvil
requerida para eluir el soluto la cual es constante y el flujo que puede ser programado.
A su vez, la ecuacin de Van Deemeter relaciona el flujo con el nmero de platos
tericos, de donde se demuestra que a flujos ms bajos mayor nmero de platos
tericos.

La polaridad de la fase estacionaria, el soluto y la fase mvil debern de ser tomadas

en cuenta para lograr una buena separacin. Se deber de buscar que las polaridades
de la fase estacionaria y la mvil sean diferentes para que stas no se vean atradas.
Por otro lado, la fase estacionaria y el analito o mezcla de analitos debern de tener
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polaridades ms cercanas para que se vean ligeramente atrados a ella y as poder

medir los tiempos de retencin. Si las polaridades de los analitos son muy parecidas
habr que variar otros parmetros para poder separarlos.

II. OBJETIVO

Demostrar cmo el tipo de fase mvil fuese afectar el anlisis y la separacin en

Cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC).

I. METODOLOGA

IV. 1. Material y equipo.

Se utiliz el instrumento de Cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC).

IV. 2. Reactivos y soluciones.

1mL de solucin de Benceno 5mL/L, disuelta en Metanol.

1mL de solucin de Tolueno 5mL/L disuelto en Metanol.
1mL de Mezcla Benceno ms Tolueno disuelta en Metanol.

IV. 3. Requerimientos de seguridad

Bata de manga larga, zapato cerrado, guantes y lentes de seguridad.

IV.4. Disposicin de residuos.

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Los residuos fueron depositados en el contenedor de orgnicos.

IV. 5. Procedimiento.

Se utilizaron diferentes parmetros para cada equipo para observar cuales eran los
mejores, resultando como mejor cromatograma los siguientes parmetros:
Fase mvil de 50:50 agua-acetonitrilo, 10uL de inyeccin y un flujo de 0.8 mL/min.
Las longitudes de onda a las que el equipo trabajara fueron elegidas por cada equipo.
El instrumento puede ser manejado por medio de un software. Es importante encender
primero el instrumento y despus el software, de otra manera no se coordinar
correctamente. Se encendi la computadora y se seleccion el cono del software para
comenzar a utilizarlo.
Para poder establecer las variables, se siguieron los siguientes pasos:
Se pueden observar diversos conos en el software los cuales corresponden a los
distintos componentes del aparato. Para modificar las condiciones de cada uno se
debe presionar click derecho y posteriormente seleccionar method. En el cono Quant
pump se seleccionaron los solventes de la fase mvil, la proporcin de cada solvente
y el flujo. En DAD (detector con arreglo de diodos) se indicaron las diferentes
longitudes de onda. En Sampler se indic el volumen de inyeccin y la posicin del
vial. Posteriormente se coloc el vial en la posicin indicada y se esper a que las
seales mostradas en pantalla de las diferentes longitudes de onda seleccionadas se
mantuvieran constantes. Al correr la cromatografa se pudieron observar los distintos
picos obtenidos en pantalla simultneamente con las distintas establecidas.
Posteriormente se observaron los diferentes cromatogramas de cada uno de los
equipos y se seleccion el que tuviera mejores resultados y se trabaj sobre ese para
hacer el anlisis de resultados correspondiente.
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II. RESULTADOS

Fig.11.1. Cromatograma obtenido bajo las mejores condiciones en HPLC

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Fig.11.2. Cromatograma de tolueno obtenido con las mejores condiciones en

HPLC

Fig.11.3. Cromatograma de benceno obtenido con las mejores condiciones en

HPLC
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III. DISCUSIN

La finalidad de esta prctica fue el observar una forma de identificar compuestos ya

conocidos en un cromatograma a partir de sus mejores condiciones y estndares
preparados de tales sustancias bajo las mejores condiciones cromatogrficas de
separacin.
Se observ una mejor separacin en las condiciones ya descritas en la metodologa
por el hecho de que los picos que se determinaron inicialmente como benceno y
tolueno, si bien, no presentaron una resolucin cromatogrfica tan buena, ya que no se
separaron por completo los picos, si se alcanzan a apreciar, cosa que con las dems
condiciones no ocurri, por tal razn se seleccion este cromatograma.
En el caso de las corridas cromatogrficas que se hicieron con los estndares de
benceno y tolueno, estos salieron mucho ms a la izquierda que en el cromatograma
seleccionado, as como aparecieron prcticamente juntos, por lo que se lleg a que las
condiciones del cromatograma seleccionado no correspondieron con las de los
estndares de los compuestos y por tanto las diferencias tan grandes en la separacin
de picos y la baja resolucin cromatogrfica de estas, ya que aparecieron
prcticamente en los mismos tiempos

IV. CONCLUSIN

1. La fase mvil tiene una gran relevancia en la separacin de dos componentes.

2. Una mezcla debe, entre otros, ponerse bajo diferentes condiciones
cromatogrficas para notar cul es su mejor resolucin.
3. Si se conocen los compuestos de la mezcla, se pueden utilizar estndares de
estos para identificarlos en el cromatograma.

V. BIBLIOGRAFA

BARQUERO, M. 2004. Mecanismos y Aplicaciones de la Cromatografa Lquida de

Alto Desempeo, ED. Universidad de Costa Rica, San Jos: 32-41
SKOOG, D. 1997. Fundamentos de Qumica Analtica, 2 ed., ED. Revert, Barcelona:
755