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Mtodos para la cuantificacin de protenas

Emilio Fernndez Reyes y Aurora Galvn Cejudo
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

En esta prctica se utilizaran tres mtodos para la cuantificacin de

protenas: Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los mtodos se
realizaran: una curva estndar, el clculo del coeficiente de extincin y el
rango de sensibilidad. Se realizar la cuantificacin de dos muestras
problemas de baja y alta concentracin, respectivamente, y se discutir
las ventajas e inconvenientes de cada uno de los mtodos.

Palabras clave: cuantificacin de protenas, Biuret, Bradford, BCA

Abreviaturas: BCA: cido bicinconnico

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

1.1 Mtodos para la cuantificacin de protenas: ventajas e

inconvenientes

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una

tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una
protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una
preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para
otros muchos propsitos.

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de

estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para
absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la
capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se
recogen los mtodos ms usados as como sus respectivas sensibilidades.
Cada uno de estos mtodos tiene sus ventajas e inconvenientes, las
principales se recogen en la Tabla II.

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Tabla I. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas y sus rangos de
sensibilidad

Mtodo Rango de sensibilidad Coeficiente de extincin o Clculo de la

(g) concentracin
Mtodos de
Absorcin 100-3000 280 = 1 mL/mg cm
A280 3-100 205 = 31 mL/mg cm
A205 100-3000 Protena (mg/mL) = (1.55A280 0.76A260)
A280 - A260 25-700 Protena (mg/mL) = (A235 A280)/2.51
A235 - A280 5-180 Protena (mg/mL) = (A224 A236)/0.6
A224 - A236 2-45 Protena (g/mL) = 144(A215 A225)
A215 - A225
Mtodos Derivados
Colorimtricos
Biuret 1000-10000 545 = 0.06 mL/mg cm
Lowry 25-100 a 500 nm Usar curva estndar
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
Bradford 1-15 595 = 81 mL/mg cm
BCA 0.5- 10 Usar curva estndar
Mtodos Derivados
Fluorimtricos
o-ftalaldehido 1-5 excitacin a 340 nm Usar curva estndar
emisin a 475 nm

Tabla II. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas, principales ventaja e

inconvenientes

Mtodo Ventajas Inconvenientes

Mtodos de No se pierden las Interfieren muchos compuestos que absorben
Absorcin muestras en el UV

Mtodos Derivados
Colorimtricos
Biuret Bastante especfico para Tiene poca sensibilidad
protenas
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Lowry Tiene bastante No todas las protenas reaccionan igual
sensibilidad Mustra muchas interferencias como
detergentes no inicos, sulfato amnico etc.
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes
BCA Es el mtodo mas sensible
Es el que muestra menos
interferencias
Mtodos Derivados
Fluorimtricos
o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual

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1.2. Mtodo de Biuret

Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los

grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con
4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad
de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy
baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados
muy concentrados (por ejemplo en suero).

1.3. Mtodo de Bradford

Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin

Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos
formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para
formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor
que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato
y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

1.4. Mtodo de BCA

El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un

complejo prpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso
producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino
(reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un
mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros
mtodos.

OH-
Protena + Cu 2+
Cu1+

Cu1+ + BCA complejo prpura BCA- Cu1+

1.5. Objetivos

Con esta prctica se pretende introducir al alumno en los diferentes

mtodos para la cuantificacin de protenas: su fundamento, sus ventajas e
inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos (Biuret, Bradford y BCA), para cada
uno de ellos se realizar una curva estndar, se determinar el coeficiente de
extincin, el rango de sensibilidad, y se realizar la cuantificacin de dos
muestras problemas.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

Tubos de ensayo
Pipetas de automticas regulables de 20-100 l y de 200-1000 l

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 Espectofotmetro
Agua destilada
Soluciones estndar de protena
Reactivo de Biuret
Reactivo de Bradford
Reactivo de BCA

3. PROTOCOLO A REALIZAR

3.1. Mtodo de Biuret

Aadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estndar y muestras problemas
preparadas como se indica en la Tabla III.
Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.

Tabla III. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret
Reactivos Resultados
Tubos Estndar A545 nm [protena]
(20 mg/ml) H2O R. Biuret
Blanco 0 l 100 l 1 ml
1 25 l 75 l 1 ml
2 50 l 50 l 1 ml
3 75 l 25 l 1 ml
4 100 l 0 l 1 ml
Muestras
M1 100 l 0 l 1 ml
M2 100 l 0 l 1 ml

- Representa la curva estndar.

- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.

3.2. Mtodo de Bradford

Aadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estndar y muestras

problemas preparadas como se indica en la Tabla IV.
Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.

Tabla IV. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford
Reactivos Resultados
Tubos Estndar A595 nm [protena]
(0,5 mg/ml) H2O R. Bradford
Blanco 0 l 100 l 1 ml
1 25 l 75 l 1 ml
2 50 l 50 l 1 ml
3 75 l 25 l 1 ml
4 100 l 0 l 1 ml
Muestras
M1 100 l 0 l 1 ml
M2 100 l 0 l 1 ml

4
 - Representa la curva estndar.
- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.

3.3. Mtodo de BCA

Aadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estndar y

muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla V.
Incubar 10 min a 60 C y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.

Tabla V. Protocolo estndar para la cuantificacin de protenas por el mtodo de BCA

Reactivos Resultados
Tubos Estndar A562 nm [protena]
(0,1 mg/ml) H2O R. BCA
Blanco 0 l 100 l 1 ml
1 25 l 75 l 1 ml
2 50 l 50 l 1 ml
3 75 l 25 l 1 ml
4 100 l 0 l 1 ml
Muestras
M1 100 l 0 l 1 ml
M2 100 l 0 l 1 ml

- Representa la curva estndar.

- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.

3.4. Compuestos que interfieren en la determinacin de protenas

Repetir las curvas estndar para cada uno de los tres mtodos pero
incluyendo se pueden incluir :
10 l de 1M EDTA ,
10 l de Tritn X-100,
10 l de SDS 20%

Determinar cmo estos compuestos afectan a la cuantificacin de

protenas por uno u otro mtodo.

4. RESULTADOS ESPERADOS

El mtodo de Biuret (poco sensible) permitir cuantificar la cantidad de

protenas en la muestra M1 pero no en la M2. Por el contrario los mtodos mas
sensibles (Bradford y BCA) permitirn cuantificar la muestra M2, pero la M1 se
saldr de rango. Para poder cuantificar la muestra M1 hara falta hacer
diluciones de la misma.

5. EJERCICIOS, DISCUSIN Y COMENTARIOS

- Qu mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?.

- Qu problemas tienes para determinar la concentracin de
protenas de las muestras M1 o M2. con cada una de estos
mtodos?. Cmo lo resolveras?.

- Discute tus resultados de acuerdo con los datos de la Tabla VI .

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 - Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la
cuantificacin de protenas en: suero, orina, LCR, durante una
purificacin enzimtica, en un extracto bacteriano concentrado, en
preparaciones de membranas plasmticas solubilizadas con SDS, en
preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn
X-100.

Tabla VI. Algunos compuestos que interfiren en la determinacin de protenas

Compuesto Interferencia en el Mtodo de Interferencia en el Mtodo de
BCA Lowry
50 mM EDTA Si Si
4 M Cloruro de guanidina N0 Si
1% Triton X-100 No Si
40% Sacarosa No Si
20% Sulfato amnico Si Si
3% Sulfato amnico No Si

ANEXO 1: REACTIVOS

Reactivo de Biuret
Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y
6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita aadir 200 ml de
NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de
plstico.

Reactivo de Bradford
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie
Blue G-250 con 10 ml de fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Aadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a travs de papel de filtro y guardar en
la oscuridad.

Reactivo de BCA
Reactivo preparado del siguiente modo.
Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sdico 0,16%, NaOH
0,4% y NaHCO3 0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH.
Reactivo B: CuSO4 al 4%
Reactivo de trabajo: mezclar 100 volmenes de A con 2
volmenes de B.

Soluciones estndar de protenas

Seroalbmina bovina 20 mg/ml
Seroalbmina bovina 0,5 mg/ml
Seroalbmina bovina 0,1 mg/ml

Muestras M1 y M2
La muestra M1 debe tener una concentracin de protenas entre
10 20 mg/ml
La muestra M2 debe tener una concentracin de protenas entre
0,1- 0,5 mg/ml

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6. BIBLIOGRAFA

Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72: 248-254.
Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein
using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.
Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley &
Sons, New York.