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Guia de Laboratorio de Microbiología PDF
Guia de Laboratorio de Microbiología PDF
FACULTAD DE MEDICINA
GUIA DE
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA
2014
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DOCENTES DE LA CTEDRA:
MARCELA MARDONES
Lcda. Bioqumica Clnica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Catlica del Ecuador
LOIDA VELASQUEZ
Dra. Patloga Clnica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Catlica del Ecuador
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NDICE
INTRODUCCIN. 4
PRCTICA N 1
Bioseguridad. 5
PRCTICA N 2
Coloraciones...11
PRACTICA No.3
Medios de cultivos....20
PRACTICA No. 4
Antibiograma..32
PRACTICA NO. 5
Identificacin de cocos Gram positivos.....38
PRACTICA No. 6
Orina.46
PRCTICA No. 7
Identificacin bioqumica de bacilos Gram negativos...52
PRCTICA No. 9
Esputo.70
PRCTICA No. 10
Malaria o paludismo....76
PRCTICA No. 11
Infecciones de transmisin sexual.....79
PRACTICA No. 12
Tcnicas bsicas de inmunologa......86
PRCTICA No. 13
Micosis....91
BIBLIOGRAFA.....96
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INTRODUCCIN
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PRCTICA N 1
BIOSEGURIDAD
CONTEXTUALIZACIN
Observa el video en el siguiente link https://www.youtube.com/watch?v=tXt7Zs5GBMw e
imagina los riesgos a los que nos exponemos cuando no cumplimos las normas de
bioseguridad.
CONCEPTUALIZACIN
La seguridad en el laboratorio se puede definir como:
"La situacin carente de riesgo o con un riesgo limitado, que resulta del cumplimiento de un
conjunto de normas y prcticas para lograr este fin"
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Barreras secundarias: Localizadas en el crculo del operador, incluirn:
La higiene personal rigurosa.
La vacunacin Programas de salud laboral.
Vestimenta: usode ropa adecuada, guantes, gafas, pelo recogido.
No frotarse los ojos o la nariz con las manos contaminadas.
No inhalar los aerosoles producidos durante la centrifugacin, la sedimentacin o el
derrame de cultivos lquidos.
Evitar ingerir microorganismos por accidente, al llevarse los dedos o el lpiz a la boca.
No sufrir inoculacin percutnea, por ejemplo, al pincharse con una aguja.
No comer, beber, fumar o aplicarse cosmticos.
No colocarse o quitarse lentes de contacto.
No pipetear con la boca.
Presuponer que todos los pacientes estn potencialmente infectados por HIV u otros
patgenos transportados por la sangre.
Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a la
infeccin. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente al
agua.
Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente despus de cualquier contaminacin.
Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
Ningn material txico o infeccioso abandone el laboratorio.
Acceso restringido a determinadas reas de laboratorio.
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Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para
desechos contaminados.
Acceso al laboratorio nicamente al personal capacitado.
- Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo: los
sistemas de autoclave, calor seco, xido de etileno.
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cultivos almacenados de microorganismos e instrumentos descartables, por ejemplo,
escalpelos y jeringas con agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar mediante
autoclave, incinerador o cualquiera de los diversos mtodos alternativos de tratamiento de
residuos.
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos
tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos. La llama utilizada es la de
combustin completa, que es de mayor poder calorfico y no deposita holln en el material de
trabajo de laboratorio que es expuesto a la misma.
Encendido del mechero: Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de
paso del gas y acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del can. Regular la
llave hasta obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire.
No abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.
Para obtener mayor temperatura, abrir ms el flujo de gas y la entrada de aire.
EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Estimados estudiantes, por favor subir un video a la plataforma Moodle con las
respectivas fotos sobre el cumplimiento de las normas de Bioseguridad de cada una de las
prcticas realizadas, as como tambin cuando ests no son cumplidas. No olvidar colocar las
reflexiones debajo de cada foto respecto al aprendizaje obtenido.
Nota: Este portafolio ser entregado al finalizar las prcticas del primer parcial el cual debe
tener una duracin de aproximadamente 4 a 5 minutos
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8. Qu procedimientos debe tener en cuenta el personal o los estudiantes durante su
trabajo en el laboratorio?
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PRCTICA N 2
COLORACIONES
OBJETIVOS
CONTEXTUALIZACIN
CONCEPTUALIZACIN
Coloracin Gram
Las bacterias se clasifican en Gram positivas y en Gram negativas de acuerdo a los
componentes qumicos de su pared celular. Las Gram positivas poseen una pared
celular poco permeable y resisten la decoloracin. Las Gram negativas poseen una
pared celular ms permeable, se decoloran y luego adquieren la coloracin de la
safranina.
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Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus
Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli
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Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.
a. Realizacin de la extensln
Producto lquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequea cantidad del
producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de
modo que la extensin sea lo ms fina y homognea posible. Un producto denso puede
ser diluido antes ligeramente.
Cultivo en medio slido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua solucin
salina estril y disociar en ella una pequea cantidad de cultivo. Extender para obtener
un frotis fino y homogneo.
Sangre: hacer un frotis como para un examen hematolgico, depositar sobre el primer
tercio de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequea gotita de sangre. Hacer
contactar con la misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinar 45 C.
La sangre alcanza por capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujar hacia
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la parte libre del primer portaobjetos que contenga la gota de sangre, hacindolo de un
solo movimiento, sin detener ni volver atrs.
rganos: seccionar un pequeo fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo
seccionado sobre un papel secante, haciendo seguidamente con sta porcin una
extensin o una serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se
obtengan preparaciones finas.
b. Secado
Dejar secar por s solo el frotis. Se puede acelerar la desecacin calentando ligeramente con
un mechero Bunsen, pero sin calentar jams brutalmente.
c. Fijacin
Cuando la extensin est bien seca, proceder a la fijacin. Slo algunas coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijacin. l motivo de la misma es hacer adherir el
frotis al portaobjetos y fijar la morfologa de las bacterias, clulas, por coagulacin rpida de
las protenas.
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pericrdico, pleural
Odo externo Eliminar la costra con solucin fisiolgica estril
Absceso superficial Limpiar la zona con solucin fisiolgica estril o alcohol al
70%. Pasar el hisopo sobre los bordes de la herida
Absceso profundo Limpiar la zona con solucin fisiolgica estril o alcohol al
70%. Aspirar el material de la pared o extraer tejido.
Catteres IV, clavos, Desinfectar la piel antes de la extraccin. No cultivar
vlvulas prostticas catteres de Foley; se obtienen cultivos cuantitativos de los
catteres IV al hacer rodar el segmento sobre el agar 4 veces
con un frceps estril; valores 15 colonias se asocian con
significado clnico.
Orina, chorro medio previa Mujeres: limpiar la zona con un antisptico suave, luego
higiene enjuagar con agua; mantener separados los labios mayores y
comenzar a evacuar en el inodoro; recoger el chorro medio
despus de eliminar varios ml.
Varones: limpiar el glande con un antisptico suave, luego
enjuagar con agua; retraer la piel del glande; recoger el
chorro medio despus de eliminar varios ml.
Puncin suprapbica Desinfectar la piel. Aspiracin con aguja por encima de la
snfisis pubiana, a travs de la pared abdominal, hasta la
vejiga llena
Sangre o mdula sea Desinfectar el sitio de puncin venosa con alcohol al 70% y
desinfectante, p. ej., betadina. Extraer sangre durante el
episodio febril; extraer dos muestras, de brazo izquierdo y
derecho; no extraer ms de tres muestras en un periodo de
24 horas
Tracto genital femenino: Eliminar moco antes de recolectar la muestra. No usar
Crvix lubricante en el espculo; usar ,medio de transporte para
clamidias, de ser necesario; tomar muestra de la profundidad
del canal endocervical.
Tracto GI: aspirado gstrico Recolectar temprano por la maana, antes de que el paciente
coma o salga de la cama. La mayora de los aspirados
gstricos se obtienen de lactantes o para BAAR
Hisopado rectal Insertar el hisopo aproximadamente 2,5 cm por dentro del
esfnter anal
Cultivo de materia fecal Cultivo de rutina debe incluir Salmonella, Shiguella y
Campilobacter; especificar Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas,
Yersinia, escherichia coli O157:H7, segn necesidad
Vas respiratorias inferiores Esputo: Enjuagar o hacer grgaras con agua antes de la
recoleccin
Vas respiratorias Insertar un hisopo flexible a travs de la nariz, hasta la
superiores: nasofaringe nasofaringe posterior, y rotar durante 5 segundos; muestra
de eleccin para Bodertella pertussis
Faringe (fauces) Pasar el hisopo por la faringe posterior y las amgdalas;
cultivo de rutina solo para Streptococcus grupo A (S.
pyogenes)
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Coloracin de Ziehl Neelsen
El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los cidos y se
tie de rojo con la coloracin de Ziehl Neelsen con la fucsina fenicada. No se pueden
decolorar por medio de cidos o etanol (son bacilos alcohol-cido resistentes o BAAR),
en tanto que casi todos los dems microorganismos se tien de azul.
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Cmo examinar las preparaciones
Haga un examen completo del primer portaobletos empleando el objetivo de inmersin (100x)
en aceite, con iluminacin mxima y sin filtro de color.
Placa positiva: una vez que se hayan examinado 10 bacilos resistentes a los cidos.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Experimentacin
1. Durante la clase los estudiantes deben aprender a manejar el mechero de Bunsen y el
uso de las asa microbiolgicas.
2. Realizarn frotis de muestras biolgicas lquidas, slidas y de esputo.
3. Efectuarn tinciones como la coloracin Gram (dos placas por grupo) y BAAR (una
placa por grupo). Por favor traer mascarilla.
4. Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.
RESPONDER AL CUESTIONARIO:
1. Cules son los reactivos y tiempos empleados para la coloracin Gram y BAAR?
2. Porqu la Escherichia coli puede adquirir el color de la safranina?De qu est
compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
3. Porqu el Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no el de la
safranina? De qu est compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. Porqu el bacilo de Koch se tie con la fucsina fenicada y no con el azul de metileno?
De qu est compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
5. Cmo realiza una placa con frotis para coloracin Gram de una muestra de orina y de
un agar sangre?
6. Cmo realiza una placa con frotis para coloracin BAAR de una muestra de esputo y
de orina?
7. Cual es el mtodo para observar las placas teidas con Gram o BAAR en el
microscopio?
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8. Qu debe realizar para recolectar muestras de mdula sea, pleural y de la faringe?
9. Problema: Mara Augusta tiene un resultado de BAAR de 1 a 9 bacilos en 100 campos.
Cul es la interpretacin de este resultado?
10. Qu coloracin adquiere el Streptoccocus pneumoniae cuando se lo tie con Zhiel-
Neelsen? Es posible diferenciarlo de otras bacterias?
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PRACTICA No.3
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS:
Conocer la importancia y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento bacteriano
Realizar tomas de muestras y siembras en medios de cultivo como agar sangre
Observacin en los medios de cultivo las diferentes colonias bacterianas en crecimiento
y realizacin de coloracin Gram
CONTEXTUALIZACIN
Excepto algunas raras excepciones, todo examen bacteriolgico incluye el cultivo del producto
a examinar. El cultivo bacteriano tiene tres propsitos principales:
Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las bacterias presentes en una infeccin.
Determinar cules bacterias que se desarrollan es ms probable que sean la causa de
la infeccin y cules son contaminantes probables o colonizadores.
Obtener desarrollo suficiente de las bacterias relevantes en clnica para permitir su
identificacin y caracterizacin.
Necesario para los estudios complementarios como los de la sensibilidad de las
bacteriuas a los distintos antibiticos.
Las bacterias pueden ser divididas en auttrofas y hetertrofas. Las primeras comprenden las
bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrgeno de la atmsfera y de la materia
inorgnica simple. Las bacterias hetertrofas reguieren compuestos orgnicos ms complejos
como fuente de carbono y nitrgeno, as como proteinas o sus derivados, tambin requieren
carbohidratos y grasas. Este ltimo grupo de organismos es el ms importante en
bacteriologa mdica.
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Protenas. Se suministran generalmente como "peptonas', que se encuentran disponibles, en
el comercio, preparadas por digestin parcial de carne con enzimas ppticas; consisten en
polipptidos, dipptidos y aminocidos.
Factores accesorios de crecimiento. Son tambin requeridos por algunas bacterias. Entre
ellos estn las vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, biotina). Estas
suministran enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de sintetizar. Otros factores
necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos ms complejos, como el
suero, la sangre, la yema de huevo, etc.
Sales minerales. Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. tambin son requeridos por
algunas bacterias en su desarrollo.
Luz. La mayora de las bacterias se desanollan mejor en ausencia de luz. La luz del sol, con
su componente ultravioleta, puede incluso ser letal.
Reaccin. La mayora de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2
a 7.6), pero existe tambin un lmite de potencialidad bastante amplio. Los hongos crecen con
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facilidad en medios cidos (pH 5) mientras que el medio especial para el crecimiento del
Vibrio cholerae debe ser marcadamente alcalino (pH 9.6)
De acuerdo a su consistencia
Lquidos: Utilizados generalmente para obtener crecimiento rpido y masivo; en estos medios
las bacterias conservan su forma original y caractersticas.
Semislidos: tiles para investigar movilidad y conservar las bacterias por perodos largos,
contienen de 1-1 5% de agar
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Los medios de apoyo o universales contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la
mayora de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar ventaja alguna en
el crecimiento de un microorganismo en particular.
Los medios selectivos contienen uno o ms agentes que inhiben todos los microorganismos
excepto los que son buscados. En otras palabras, estos medios seleccionan el crecimiento de
ciertas bacterias e inhiben el de otras. Los agentes inhibidores utilizados para este propsito
son colorantes, sales biliares, alcoholes, cidos y antibiticos. Un ejemplo es el agar con
alcohol feniletlico, que inhibe el desarrollo de bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos, y permite el crecimiento de cocos Gram positivos.
Los medios diferenciales emplean un factor (o factores) que permite que las colonias de una
especie o tipo bacteriano exhiban ciertas caractersticas metablicas o de cultivos que pueden
utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar placa.
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Un ejemplo de medio de transporte es el medio de Stuart. Se utiliza en una unidad
descartable de cultivo, denominado Culturette, que consiste en un tapn estril de poliestireno
y una ampolla del medio de Stuart. Despus de recoger la muestra, se coloca en el tubo y se
aplasta la ampolla para liberar el medio alrededorr del extremo de tapn. Este tipo de medio
no es adecuado para aislar anaerobios sensibles al oxgeno.
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de amonio frrico. Los indicadores aislamiento y diferenciacin
son el azul de bromotimol y la de especies de Salmonella
fucsina cida y Shiguella de otros bacilos
entricos gramnegativos
Agar MacConkey Base de peptona con lactosa. Los Aislamiento y diferenciacin
microorganismos grampositivos son de bacilos entricos
inhibidos por el cristal violeta y las gramnegativos
sales biliares. Rojo neutro como fermentadores y no
indicador fermentadores de la lactosa
Agar manitol salado Base de peptona, manitol y rojo Aislamiento selectivo de
fenol como indicador. La estafilococos
concentracin de sal al 7,5% inhibe
la mayora de las bacterias
Agar sangre Agar con sustrato nutritivo (extracto Cultivo de microorganismos
de levadura,peptona, hidrolizado de con requerimientos
hgado), cloruro de sodio, con 5% especiales de cultivo,
de sangre de cordero determinacin de
reacciones hemolticas
Agar Thayer-Martin Agar sangre base enriquecido con Selectivo para N.
hemoglobina y suplemento B; los gonorrhoeae y N.
microorganismos contaminantes meningitidis
inhibidos por colistina, nistatina,
vancomicina y trimetoprima
Caldo para Caldo base de peptona con glucosa Medio lquido selectivo
gramnegativos (GN) y manitol. El citrato de sodio y el (enriquecimiento) para
desoxicolato de sodio actan como patgenos entricos
agentes inhibidores
Caldo selenito Caldo base de peptona. El selenito Enriquecimiento para el
de sodio resulta txico para la aislamiento de las especies
mayora de las Enterobacteriaceae de Salmonella
Caldo tetrationato Caldo base de peptona. Las sales Selectivo para especies de
biliares y el tiosulfato de sodio Salmonella y Shigella
inhiben los microorganismos
grampositivos y Enterobacteriaceae
Caldo de tioglicolato Digerido pancretico de casena, Favorece el crecimiento de
caldo de soja y glucosa que anaerobios, aerobios,
enriquece el desarrollo de la microaerfilos y
mayora de los microorganismos. El microorganismos exigentes
tioglicolato y el agar reducen el
potencial rdox
Caldo tripticasa soja Caldo enriquecido con mltiples Caldo de enriquecimiento
(TSB) propsitos que puede favorecer el utilizado para el subcultivo
crecimiento de muchas bacterias de diversas bacterias de
con requerimientos especiales de cultivos primarios en placas
cultivo y sin ellos de agar
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MEDIOS USADOS PARA EL AISLAMIENTO PRIMARIO
CARACTERSTICAS DE LA COLONIA
Es importante destacar las caractersticas clave de una colonia bacteriana para toda
identificacin bacteriana; el xito o el fracaso de los procedimientos posteriores de
identificacin a menudo dependen de la precisin de estas observaciones. Los criterios
utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento bacteriano son:
Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego para que
se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a estudiar; abrir la caja
petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la muestra se efecta un
pequeo inculo en el borde, de all se parte la primera estriacin; luego de la esquina de una
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de las estras de la primera estriacin se realiza la segunda estriacin y finalmente de la
esquina de una de las estras de la segunda estriacin, se realiza la tercera estriacin,
procurando hacer las estras mucho ms separadas de las dos primeras, con la finalidad de
separar las colonias que sean sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora,
colocndola de lado contrario al que se sembr y se la deja en las condiciones apropiadas
para el crecimiento de cada bacteria (temperatura, atmsfera, potencial rdox, tiempo, etc.)
Debe trabajarse siempre cerca de un mechero de Bunsen al inocular, ya que la corriente
asendente de aire va por la flama, arrastra el polvo, etc.; con el aire hacia arriba, alejndole de
la placa, y cuando el aire se enfra, el polvo se precipita lejos de la placa.
A menudo se reciben torundas para cultivo; en vez de recogerse material con el asa, deben
emplearse las torundas corno material primario de inoculacin a partir del cual se distribuye
con el asa en la forma descrita ms adelante. Deben ser subrayados ciertos puntos de
importancia sobre el uso del mtodo de placas; por ejemplo, las placas deben estar
preferentemente secas antes de usarse, para que los microorganismos no se extiendan,
impidiendo la formacin de colonias aisladas.
Medios inclinados: Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas
aisladas, sea para identificacin ulterior o para base de cultivo. Se requiere prctica y siempre
debe hacerse cerca del mechero de Bunsen; el cuello del tubo o del frasco debe ser flameado
antes de recubrirlo o de volver a colocar el tapn de algodn (mtodo que se usar en la
prctica No. 7 Pruebas bioqumicas).
Cultivos lquidos: Al inocular un medio lquido como el agua de peptona o el caldo con
tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae el asa por frotamiento contra la pared del
tubo. Cuando ste se endereza, el material se encuentra bajo la superficie del medio.
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FACTORES DETERMINANTES EN LA PREPARACIN DE UN MEDIO DE
CULTIVO
4. Tensin de oxgeno:
4.1. Aislamientos de aerobios: como la respiracin es su nica fuente de energa,
los microorganismos aerobios deben tener una provisin adecuada de oxgen en
su ambiente, se pueden satisfacer las demandas de oxgeno de las siguientes
maneras:
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Se pueden mezclar cido piroglico y carbonato de sodio en una cpsula o un frasco,
que luego se coloca en un recipiente sellable ms grande que contiene los frascos de
cultivo o las placas de agar. Cuando se mezclan el cido piroglico y el carbonato de
sodio, se absorbe oxgeno y se libera CO2, creando de este modo un ambiente
anaerobio.
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tales medios mnimos de agar y luego se sellan con cera para preservarlos a las temperaturas
de refrigeracin. Una varilla de agar del cultivo se puede recubrir con parafina lquida y
almacenar durante aos, se ha aplicado esta tcnica para la preservacin de los hongos. A
menudo se almacenan las bacterias esporuladas en suelo estril. En primer trmino se seca
el suelo a la temperatura del ambiente y luego se almacena a la temperatura de refrigeracin.
Congelacin: La mayora de las Bacterias pueden ser congeladas en varios tipos, de medios,
se congelan rpidamehte las muestras a temperaturas de -20 a 30C para mantener la mayor
parte de las clulas en un estado viable. Se han empleado con xito temperaturas ultrabajas
utilizando el hidrgeno lquido, a fin de almacenar y preservar una amplia variedad de clulas,
incluso hongos, virus, y hemates.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN:
1. Los estudiantes procedern a realizar siembras en agar sangre cuyos resultados se
observarn en la siguiente semana.
2. Se evaluar el portafolio de coloraciones
3. Realizar el portafolio de la prctica e incluir los resultados, reflexiones y el cuestionario en el
mismo.
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7. El agar MacConkey se considera un
medio..porque permite reconocer las
bacterias que fermentan o no la lactosa, tambin es considerado un medio selectivo ya
que contiene y violeta cristal que
inhiben el crecimiento de bacterias no entricas.
8. Cmo se llama el medio de cultivo que sirve para el asilamiento selectivo de cocos
Gram positivos y bacilos anaerobios Gram negativos, inhibiendo el crecimiento de
bacilos Gram negativos?
9. Escriba el nombre de un medio de cultivo que permita el crecimiento de especies de
Neisseria (gonorrhoeae y N. meningitis).
10. Escriba el nombre de un medio de cultivo que reducen el potencial rdox favoreciendo
el crecimiento de anaerobios.
11. Mencione los criterios utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento
bacteriano.
12. Mencione los 5 factores determinantes para la preparacin de un medo de cultivo.
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PRACTICA No. 4
ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS:
Conocer y realizar el mtodo convencional de difusin en discos
Interpretar la sensibilidad y resistencia que presentan diferentes bacterias a los
antibiticos
CONTEXTUALIZACIN
Las enfermedades infecciosas siempre han sido un problema grave para el hombre, el
hallazgo de sustancias eficaces que pudieran ser utilizadas en el tratamiento de estas
enfermedades se remonta al siglo XVll en el que ya se emplearon sustancias qumicas como
la quinina para la malaria.
Reactivos y Materiales
1. Agar de Mueller Hinton: Preparar el agar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Una vez salido del autoclave permitir que el medio alcance entre 45 y 50C, es
recomendable para asegurarse de tener esta temperatura colocar el medio que sale del
autoclave, en un bao Mara a 48C y mantenerlo ah por un tiempo prudencial hasta
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que la temperatura interna del medio contenida en el recipiente alcance la temperatura
deseada.
Reactivos: Cloruro de Bario 0.048M (1.75%p/v), Acido Sulfrico 0.3N (1% p/v).
Aadir 0.5 ml de Cloruro de Bario a 99.5ml de Acido Sulfrico. La densidad ptica en un
espectrofotmetro a 625nm que debe dar 0.08 a 0,10 de absorvancia.
Tcnica
Una vez sembrado y obtenido el crecimiento de los microorganismos de una muestra clnica,
evaluar correctamente el hallazgo antes de decidir la realizacin del antibiograma.
Seleccionar 4 a 5 colonias similares del microorganismo suceptible de practicar el
antibiograma y colocarlas en el caldo de cultivo.
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En las bacterias exigentes tales como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y
Streptococcus pneumoniae, obviar el paso de crecimiento en caldo y preparar un inculo
directamente en 4 a 5 ml de solucin salina y ajustarlo con el estndar MacFarland # 0,5 para
luego inocularlo en las cajas petri.
lntroducir un aplicador estril en el caldo de crecimiento, eliminar el exceso por rotacin en las
paredes del tubo luego inocular en un sentido en toda la superficie de la caja petri y repetir el
paso anterior en dos sentidos diferentes para finalizar la inoculacin pasar el aplicador por la
periferia del medio de cultivo.
lntroducir la pinza en el frasco de alcohol y pasarla por el mechero esperar hasta que el fuego
de la pinza se consuma. Colocar los discos de los antibiticos seleccionados con la pinza e
impregnarlos en la superficie de las placas inoculadas haciendo una ligera presin sobre ellos.
.
La seleccin de los agente antimicrobianos se denominan batera de antimicrobianos, las
decisiones finales con respecto al contenido de la batera deben ser tomadas por el
laboratorista, el personal mdico (en particular de los especialistas en enfermedades
infecciosas) y de la farmacia.
El siguiente paso es incubar a 35C en un ambiente de aerobiosis sin CO2 ya que puede
alterar el pH de la superficie y consecuentemente el desarrollo de los microorganismos
inoculados, excepto para Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae cuyas variaciones
de estandanzacin fueron determinadas bajo ese parmetro, chequear adecuadamente la
temperatura de la incubadora ya que si sobrepasa la temperatura ideal puede afectar la
prueba.
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Luego de 16 a 18 horas de incubacin se procede a la lectura de las zonas, de inhibicin, para
ello se puede utilizar una regla o tambin se puede utilizar plantillas previamente diseadas
para el efecto. Una vez hecha la lectura de los halos de inhibicin se procede a comparar con
las tablas pertinentes para establecer la categora con la cual ser clasificado el
microorganismo para cada uno de los antibiticos.
Mtodos de prueba
Mtodos que miden directamente la actividad de antimicrobianos en forma directa
Las mediciones directas de la actividad antimicrobiana se hacen mediante:
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El NCCLS publica tablas actualizadas que enumeran los posibles agentes antimicrobianos a
incluir en las bateras de prueba contra determinados microorganismos o grupos de
microorganismos.
DISCOS DE ANTIBITICOS USADOS PARA GRMENES GRAM POSITIVOS Y GRAM
NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORI
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN
1. Continuando con la prctica anterior, cada estudiante realizar la observacin de las
colonias sembradas en agar sangre y realizar la coloracin Gram de dos
colonias diferentes, observar en el microscopio y anotar los resultados de todos los del
equipo de trabajo en un cuadro para el informe pendiente.
2. Se realizar el antibiograma y su respectiva interpretacin. Trabajo grupal.
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PRACTICA NO. 5
OBJETIVOS:
Conocer los diferentes fundamentos de las pruebas empleadas para la identificacin
Realizar los diferentes mtodos de identificacin de las familias y gneros de cocos
Gram positivos
Reconocer algunas especies mediante las tcnicas de identificacin empledas
Son cocos gram positivos, aparecen solos, en pares, tetradas, paquetes de ocho y en
racimos. No mtiles, no esporulados, catalasa (+), reducen nitratos a nitritos.
Las colonias son redondas, lustrosas, blancas aunque tambin existen especies pigmentadas.
Forman esta familia especies Saprfitas, parsitas y patgenas que se encuentran
distribuidas ampliamente en la naturaleza
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Puede infectar cualquier parte del cuerpo humano, es la causa ms comn de infecciones
supurativas, en casos severos puede producir septicemias, es frecuentemente el agente
causal de la ostiomielitis.
Cepas de S. aureus cuando crecen en altas concentraciones de CO2 (30%) pueden producir
una enterotoxina termoestable, causante de envenenamiento por alimentos.
Otras cepas producen una toxina epidermoltica (exfoliativa) causante del sndrome de piel
escaldada.
Staphylococcus epidermidis:
Se lo encuentra en el aire y en la piel. Normalmente no patgeno, pero puede causar
infecciones secundarias de la piel, heridas posquirurgicas y endocarditis posoperatorias.
Staohylococcus saprofiticus:
Se lo encuentra en el aire, polvo y productos animales. Generalmente considerados no
patgenos, pero en ocasiones puede producir infecciones urinarias.
Peptococcus:
Son anaerobios estrictos se los considera los Estafilococos anaerbicos, se los encuentra en
cultivos de heridas profundas.
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FAMILlA Streptococcaceae
Son cocos gram positivos que se dividen en un solo plano, formando pares o cadenas,
aerobios y anaerobios facultativos. No producen esporas, no son mtiles. Son catalasa
negativa.
40
Adems las infecciones causadas por Estreptococos del grupo A pueden llevar a sndromes
post-infecciosos de fiebre reumtica, cardiopatas reumticas y glomrulo nefritis aguda.
Los estreptococos tienen hemolisinas que actan de diferente manera en agar sangre:
Hemlisis beta: zona clara alrededor de la colonia
Hemlisis alfa: zona de hemlisis incompleta (verde).
Hemlisis gamma: ausencia de hemlisis
Streptococcus pneumoniae
Son dipldcocos gram positivos, con los extremos alargados en forma de lanza, tambin se
agrupan en cadenas; no forman esporas, no mtiles, poseen una cpsula formada de
polisacridos especficos, lo que permite una tipificacin con antisueros especficos.
Patgenos para el hombre, producen neumonas, meningitis, otitis y endocarditis. Crecen bien
en agar sangre y chocolate en atmsferas que contienen el 10% de CO2.
PRUEBAS DE LABORATORIO
-Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H 2O2) en
oxgeno y agua.El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido
de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas.
41
2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)
Procedimiento: En una placa portaobjetos aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%
(diluir la solucin al 30% con agua destilada), transferir clulas del centro de una colonia bien
aislada y mezclar. La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o
efervescencia indica una reaccin positiva.
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-Novobiocina: Se usa el agar Mueller-Hinton, como el antibiograma tambin en agar
sangre.
Se utiliza para identificar que tipo de Staphylococcus coagulasa negativos es. Pueden ser
sensibles o no a la novobiocina (5 g). Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que
Staphylococcus saprophyticus no lo es.
Procedimiento: Se toma un agar Muller Hinton agar sangre y en un lado de la placa se
estria con el asa en forma continua la cepa del Staphylococcus coagulasa negativo, con una
pinza estril se coloca el disco de novobiocina en el centro del estriado realizado se incuba a
35C por 18 horas.
Interpretacin de resultados: Un halo de inhibicin de crecimiento menor o igual a 16 mm
correswponde Staphylococcus saprofiticus. Un halo de inhibicin mayor de 16 mm
corresponde al Staphylococcus epidermidis (tambin pueden ser otros estafilococos
negativos).
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-Bilis esculina: Los estreptococos del grupo D crecen rpidamente en el agar bilis esculina e
hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde
oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompaante.
-Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y
otras especies de estreptococos a hemolticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es
una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el
clorhidrato de etilhidrocuprena.
Procedimiento: Se toma una suspensin de colonias puras en caldo Mueller Hinton o
tioglicolato y con un hisopo se estra una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la
estra se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmsfera de CO2 al 5 %(jarra con vela)
durante 24 hs. a 35 C.
Interpretacin: Sensible, cuando hay inhibicin alrededor del disco. Se considera como punto
de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el
crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben
resolverse por acumulacin de pruebas a favor o en contra.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN
1. Se realizarn pruebas de:
- Catalasa para diferenciar a la familia Micrococcaceae de Streptcoccoceae
-Coagulasa para identificar al Staphylococcus aureus
-Novobiocina, bacitracina, optoquina, Camp
- Diferenciar hemlisis en agar sangre
2. Realizar el portafolio de la prctica correspondiente y colocar los resultados obtenidos.
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a. Cuales seran los pasos para la identificacin del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. Cul sera el microorganismo presente segn los resultados del literal 5.1.?
c. Qu antibiticos empleara?
6. Jos Antonio presenta fiebre reumtica, su mdico solicita realizar exmenes
microbiolgicos para detectar el microorganismo presente:
a. Cuales seran los pasos para la identificacin del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. Cul sera el microorganismo presente segn los resultados del literal 6.1.?
c. Qu antibiticos empleara?
7. Utilizando una foto explique la prueba de Camp.
8. Verdadero o falso:
Es mejor sembrar al Streptococcus pneumoniae en agar chocolate que en agar sangre
(justifique su respuesta).
9. Mencione dos diferencias entre enterococos y no enterococos.
10. Por qu razn especies de bacterias del gnero Micrococcus crecen bien en agar
sangre en una atmsfera con oxgeno?
11. Cmo identificara al Staphylococcus saprofyticus del Streptococcus pneumoniae?.
Mencione dos pruebas microbiolgicas.
12. Segn el grado de hemlisis como puedo identificar al Streptococcus pneumoniae del
Streptococcus pyogenes?. Mencione dos pruebas microbiolgicas.
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PRACTICA No. 6
ORINA
OBJETIVOS:
Conocer la forma adecuada de recoleccin de una muestra de orina tanto en hombres
como en mujeres
Realizar el examen elemental y microscpico de orina y Gram gota fresca
Conocer la realizacin de un urocultivo y los diferentes microorganismos que pueden
estar presentes
CONTEXTUALIZACIN
El examen general de orina de rutina urianlisis es una de las primeras pruebas usadas
para la identificacin de patologa en las vas urinarias y es parte indispensable de la patologa
clnica. Puede proporcionar una estimacin de la funcin renal, dar informacin sobre las
posibles causas de disfuncin e incluso puede indicar enfermedad sstmica. El examen
general de orina es un estudio cuidadoso y sistemticos de las prpiedades fsicas, qumicas
y microscpicas de la orina. Aunque los datos que se obtienen slo en ocasiones ayudan a
dar un diagnstico tentativo, al mismo tiempo sirven de gua para seleccionar pruebas ms
especficas para un diagnstico definitivo.
RECOLECCIN DE LA MUESTRA
-La informacin adecuada al paciente es esencial, deben prepararse pautas para la obtencin
apropiada de la muestra en una tarjeta impresa, con el procedimiento descrito y
prefentemente ilustrado para asegurar el cumplimiento por parte del paciente.
-Debe indicarse al paciente que se lave y enjuague bien las manos
-Luego que higiniece bien el rea periuretral con un antisptico suave para evitar la
contaminacin.
-Indicar al paciente que se enjuague muy bien, porque el antisptico puede ser
bacterioesttico, en las mujeres se debe hacer que escurra el agua de adelante hacia atrs.
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-Una vez completada la higiene, el paciente debe retraer los labios vaginales o el glande del
pene, empezar a orinar. En cuanto cierta cantidad de orina haya limpiado la entrada uretral
obtener una muestra de orina del chorro medio de la miccin, se coloca el frasco de
recoleccin en posicin con la mano libre, sin tocar la superficie de el borde interno de la
abertura con los dedos, es importante indicar a los varones que la punta del pene no debe
tocar ninguna de las partes del frasco recolector en ningn momento.
-Cuando la muestra est dentro del frasco, se tapa tan pronto como sea posible para evitar la
contaminacin bacteriana proveniente del aire. Es indispensable no tocar la superficie intena
de la tapa. El frasco de recoleccin debe ser estril.
-Llevar de inmediato al laboratorio, cuando hay que esperar ms de una hora se debe
refrigerar.
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- Microscpico: leucocitos, eritrocitos, clulas bajas, clulas altas (se reporta nmero por
campo en 10 campos con lentes 40x), moco, bacterias, cristales, parsitos, hongos (se
reporta por cruces en 10 campos con lentes 40x) y cilindros se reporta nmero por placa (con
lentes de 10x).
Los organismos que pueden encontrarse en la orina incluyen: Escherichia coli, Proteus,
Pseudomona aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, enterococos,
Mycobacterum tuberculosis, Serratia, Klebsiella y Enterobacter.
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Una vez recogida la muestra en las condiciones anteriormente descritas se debe proceder a
cultivar enseguida, no debe pasar ms de una hora entre la recogida de la muestra y el
cultivo.
El cultivo de la muestra de orina comprender preferiblemente una tcnica cuantitativa y otra
cualitativa.
Puesto que en la orina nos encontramos con organismos Gram positivos y negativos es
necesario realizar cultivos para ambos grupos.
As se utilizar agar sangre para los Gram positivos (se puede aadir cido nalidixico
colimicina para evitar crecimiento de Gram negativos) y Mc Conkey o EMB para los Gram
negativos.
El cultivo cuantitativo de la orina puede verificarse bien con una asa de 0.001ml, se utiliza
muestra no centrifugada.
El nmero total de bacterias encontradas por mililitro es el siguiente se cuenta cuantas
colonias crecieron y se multiplica por 1000.
Una bacteriuria infenor o igual a 10.000 grmenes por ml se considera que no tiene
significacin patolgica, ms all de los 100,000 grmenes por ml, la infeccin urinaria es
prcticamente segura.
Entre 10.000 y 100.000 grmenes por ml, la repeticin del examen y el contexto clnico son
indispensables para una correcta interpretacin.
La presencia de 104 /ml de un solo tipo de bacilo Gram negativo es una indicacin consistente
de infeccin de vias urinarias, en especial en varones. En algunas ocasiones en mujeres
jvenes con disuria e infeccin de vas urinarias agudas tendrn 102 o 103 por mililitro.
As, la interpretacin de los resultados del cultivo de orina depende del mtodo de recogida y
entrega al laboratorio, de los tipos y nmero de bacterias presentes y de la valoracin de
estos hallazgos en relacin con el cuadro clnico del paciente.
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PRUEBA DE BAAR EN ORINA
Cuando se sospecha de una infeccin tuberculosa del aparato urinario, deber examinarse el
sedimento de la orina centrifugada por media hora a 3000 rpm por seis das consecutlvos. Se
recomienda la recogida de la orina matutina pero todo su volumen en recipientes estriles.
Las extensiones del sedimento se tien mediante la coloracin de Ziehl Neelsen y se busca la
presencia de organismos cido resistentes.
Para el reporte igual que para esputo, si se siembra esta muestra en medio de Lowenstein
Jensen se debe tratar previamente a la muestra por digestin como a la muestra de esputo.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN
1. Cada grupo de trabajo recibir una muestra de orina para que le realicen un EMO,
Gram gota fresca y un urocultivo. Para esta actividad los estudiantes deben revisar los
procedimientos mencionados y la manera en que se deben reportar. Se evaluar el
informe durante la clase.
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PRCTICA No. 7
OBJETIVOS:
Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa
en cido pirvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan
cido pirvico producen cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan,
en cambio, el camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El
indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es til
para la diferenciacin de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo
negativo).
Procedimiento y resultado:
Con un asa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas.
Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo.
Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
Agregar 5 gotas del indicador rojo metilo y observar si hay cambio de color.
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms.
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2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido pirvico
un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetona (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metablicos. En presencia de oxgeno e KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de alfa-naftol antes
del agregado de KOH.
Procedimiento y resultados:
3.PRUEBA DE LA UREA
Principio
La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa da 2
molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de
la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del medio. Es una
actividad caracterstica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de
Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de
Yersinia pestis (-)
Procedimiento y resultados
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Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas
que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados da por da.
Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
Procedimiento y resultados
Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular en el medio SIM.
Incubar a 37C por 18 a 24 horas.
Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el medio y el reactivo.
Si el ensayo es negativo no hay cambio ded c o hay un color amarillo en la
interfaseolor, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
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5. AGAR KLIGLER (TSI)
Principio
El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estra permanecer cida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los organismos que
no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirn productos
alcalinos y el medio permanecer rojo. La produccin de SH2 se manifiesta por un
ennegrecimiento del medio.
Resultados
Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, lactosa (E.
coli)
Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente
(Shigella spp.)
Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa)
Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp)
Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.)
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6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)
Principio
La descarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilacin de
lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilacin es una reaccin anaerbica, se
debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos
etapas: por fermentacin de la glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0),
apareciendo color amarillo. La acidificacin es necesaria para que ocurra la
decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la formacin de las aminas que elevan el
pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
Procedimiento y resultados:
Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos
Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril.
Incubar a 37C
Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da
Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)
Principio
Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato) usado
para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un medio de cultivo con
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citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a
pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es
negativo se mantiene verde.
Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en
un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C
durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra,
acompaado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados
(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli
8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la prdida de NH3 en un aminocido originando un cido
carboxlico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen cido fenilpirvico que
con Fe3Cl en solucin cida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es
negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
7. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, de esta manera se puede observar si se utiliza al
malonato como fuente de carbono.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
1. Efectuar la siembra en los medios de cultivo para la identificacin de bacilos Gram
negativos, partiendo de un medio Mac conkey en donde un microorganismo "x" se ha
desarrollado. Trabajo grupal, venir estudiando la prctica, se evaluar durante la
clase.
2. Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.
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PRCTICA No. 8 (PRIMERA PARTE)
COPROLGICO Y COPROPARASITARIO
Objetivos:
-Realizar el examen coproparasitario utilizando soluciones apropiadas
-Identificar diversos parsito causantes de infecciones
-Muestras frescas deben ser examinadas o procesadas dentro de los 30 minutos posteriores a
la recoleccin pues es ms probable que en estas se encuentren trofozoitos mtiles. Las
muestras blandas pueden ser examinadas hasta despus de 2 horas.
-Guardar a temperatura ambiente mximo por 1 a 2 horas. En refrigeracin hasta por 48 horas
si no dispone de preservantes.
- Preserve las muestras tan pronto como sea posible. La muestra debe ser dividida y
guardadas en dos diferentes preservantes: formalina al 40% y PVA.
-Asegrese de que la muestra se mezcle bien con el preservante (heces formadas necesitan
ser bien desarmadas).
-Asegrese de que el recipiente est bien sellado. Refuerce con parafilm y otro material.
Guarde el recipiente en una funda plstica.
Observaciones:
- Ciertas drogas y compuestos pueden provocar que la muestra sea insatisfactoria para la
examinacin. Las muestras deben recolectarse antes de que estas sustancias sean
administradas o despus de que los efectos hayan pasado. Tales sustancias incluyen:
anticidos, caoln, aceite mineral y otras sustancias que contengan aceites, antidiarreicos no
absorbibles, bario o bismuto (se necesitan 7 a 10 das para superar estos efectos), agentes
antimicrobianos (2 a 3 semanas) y pigmentos biliares (3 semanas).
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2. Examen corpolgico y coproprasitario
a. Macroscpico:
Examine macroscpicamente usando un aplicador para detectar la presencia o ausencia de:
progltides, esclex o gusanos adultos. Puede encontrar progltides mtiles de tenias entre o
sobre las heces. Ocasionalmente puede encontrar en la superficie de las heces gusanos de
Ascaris y Enterobius.
La consistencia de las heces nos puede dar una idea del estado de vida del parsito que
buscamos, as para protozoarios intestinales: las formas qusticas sern posiblemente ms
observadas en heces formadas o semiformadas, pastosas; mientras que los trofozoitos se
hallarn en heces semilquidas y lquidas.
En el caso de los helmintos intestinales, huevos, larvas se pueden encontrar en heces fecales
de cualquier consistencia. Se puede sospechar de infeccin amebiana cuando las heces
fecales estn Iquidas y gaseosas.
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MOCO: su aparicin suele ser reconocida macroscpicamente. Si est mezclado con las
heces, dando un aspecto brillante, procede del intestino delgado. Moco en colon distal, moco
opaco, mezclado con clulas epiteliales, sangre o pus es indicativo de un proceso inflamatorio
(enteritis o colitis).
El moco tambin est presente en heces fecales de pacientes con infeccin donde se hallarn
trofozoitos.
b. Microscpico:
Para el examen microscpico se necesita de las siguientes soluciones:
Solucin de lugol:
- Hace ms notable la estructura interna de los parsitos intestinales.
Los quistes se tien rnuy bien con el lugol haciendo posible la identificacin correcta de la
especie: se puede observar el nmero y estructura del nucleo, la cromatina toma un color caf
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oscuro, el citoplasma un color amarillo o naranja, las masas de glucgeno se tien de caf
rojizo. Los cuerpos cromatoides son menos visibles que en solucin salina
- Destruye la motilidad de los trofozoitos.
- Se observan mejor las caracterfsticas morfolgicas de huevos y larvas de helmintos
intestinales.
-Facilita tambin la observacin de los siguientes elementos:
CLULAS:
- La presencia de clulas epiteliales es indicativo de irritacin gastrointestinal.
- Los eritrocitos no deben ser observados en condiciones normales. Su presencia evidencia
sangrado en la parte baja del apararato digestivo.
- Los leucocitos normalmente no se observan o son escasos. Nmeros elevados aparecen
en las inflamaciones gastrointestinales; indican principalmente infeccin bacteriana. Se
pueden observar macrfagos y leucocitos en los casos de disentera amebiana crnica con
invasin bacteriana secundaria. Los eosinfilos son numerosos en la amebiasis
especialmente en la fase aguda.
- Los PMN (polimorfonucleares) pueden ser identificados por presentar forma redonda o
irregular, de 10 a 20 , citoplasma claro, refringente, granuloso y el ncleo escasamente
notable. Se los puede observar mejor si se aade una gota de cido actico al 10% a la
emulsin de heces. Se debe informar en que cantidad se encuentran por campo. Si se
observan ms de 10 leucocitos por campo, se hace una lmina y se colorea con Wright, se
hace el recuento diferencial y si hay mayor cantidad de neutrfilos (polimorfonucleares) la
infeccin es causada por bacterias, si hay mayor cantidad de mononucleares la infeccin es
de tipo viral.
CRISTALES:
- Oxalato de calcio, y fosfato triple: son encontrados con frecuencia y carecen de
significado clnico al igual que escasos cristales de cidos grasos.
- Cristales de hematoidina: son agujas amarillas que se presentan en grupo o haces
despus de hemorragia intestinal.
- Cristales de Charcot-Leyden: tienen forma de rombos alargados, normalmente se
encuentran en el citoplasma de los eosinfilos. Se observan ocasionalmente en las
infecciones parasitarias, especialmente en amebiasis invasora.
ALIMENTOS NO DIGERIDOS:
- Sustancias vegetales: las clulas vegetales se observan en varias etapas de
descomposicin. Los pelos vegetales son de tamao variable (50-300), truncos en un
extremo y delgados en el otro, curvos, de color amarillo plido o transparentes.
En su interior se observa un conducto central estrecho, vaco, entre dos capas transparentes
que refractan la luz. Los pelos vegetales se asemejan a las larvas de Strongyloides.
- Sustancias animales: las fibras de carne digerida tiene un tamao de 100-200, de forma
oval, rectangular, redondeada, De color amarillo o trasparente, sin grnulos ni estriaciones en
su interior. Poseen estriaciones longitudinales y transversales cuando no han sido digeridas
adecuadamente,
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- Grnulos de almidn: pueden estar bien, parcial o no digeridos. Su tamao va de 50-100,
de forma redonda u oval y contorno irregular. El almidn no digerido se torna azul, violeta o
negro si se aade lugol. En solucin salina aparecen blancos o amarillo grisceos.
- Grasas: glbulos de grasa neutra aparecen de tamao variable, perfectamente redondos,
contomo bien definido, uno o varios anillos que refractan la Iuz intensamente. En lugol se los
ve de color naranja, amarillo o rojo. Los cidos grasos se observan como agujas incoloras. Se
puede usar tambin una tincin Sudn para su identificacin.
FLORA INTESTINAL
- Levaduras: Cndida es un habitante normal del intestino humano. Aparecen de forma
redonda u oval, a menudo con brotes, de 5-8, conteniendo de 3 a 6 grnulos en posicin
excntrica. En solucin salina se las ve con paredes gruesas y bastante refrctiles. Con lugol
aparecen de color pardo. Raras veces se observa pseudohifas o pseudomicelios. Tambin
puede aparecer en heces fecales artrosporas, que, son otra clase de hongos, tienen forma
rectangular y citoplasma claro; stas deben ser reportadas. Cndida puede producir
candidiasis o moniliasis intestinal especialmente despus de tratamientos prolongados con
antibiticos o en pacientes inmunodeprimidos. Un nmero significativo de micelios, hifas o
cualquier otra clase de esporas deben ser reportados.
-Bacterias: la flora bacteriana normal constituye un tercio del peso de las heces secas.
Predominan en el adulto la flora gramnegativa especialmente el colibacilo. En los lactantes
predomina la flora grampositiva. Tanto en lugol como en solucin salina solo se aprecia si se
trata de cocos y/o bacilos.
Tcnicas:
- Flotacin
- Sedimentacin
Principio:
Se basan en la diferencia de peso especlfico de los parsitos y el medio de suspencin
empleado.
La flotacipn debe permitir que los organismos floten.
La sedimentacin debe favorecer el asentamiento
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PARSITOS
a. Nemtodos: Gusanos redondos
Ascaris lumbricoides: Se observan huevos que miden aprox. 45-75 x 30-50
micras, presenta una clula rodeada por tres capas, producen una patologa de
dolor de estmago y desnutricin.
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Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 micras tiene una membrana
interna y una externa, tambin puede causar trastornos nerviosos.
c. Protozoarios: Amebas
Entamoeba histoltica: Se observan quistes que miden aprox. 20 micras, se
observa con uno a cuatro ncleos. Pueden causar lesin de la mucosa intestinal.
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Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simtricamente lateral, con un
extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro ncleos y dos cuerpos
parabasales, produce una diarrea amarillenta y vmito.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
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PRCTICA No. 8 (SEGUNDA PARTE)
OBJETIVOS:
-Conocer y poner en prctica diversas pruebas qumicas en heces fecalesque ayudan a
diagnosticar enfermedades de origen gastrointestinal
-Realizar siembras y coloraciones en heces fecales sospechosas de microorganimos
bacterianos infecciosos
ANALISIS QUMICOS
Reaccin qumica, pH: Las heces normales son neutras o ligeramente alcalinas, pero esto
depende de mltiples factores: dietticos, endgenos, etc. por lo que las variaciones tanto en
la salud como en la enfermedad son irregulares y de escaso valor clnico. Para su medicin
se emplea una tira de papel indicador universal. Sobre el cual se aplica una pequea cantidad
de material fecal. Se espera unos minutros y se compara con la escala de colores.
Se realiza tinciones con Sudn lll o lV para cualificarlas. Tambin se realiza dosificacin de
grasas. Se considera patolgica la materia fecal que contiene una cantidad total de grasas por
encima del 30%.
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Rotavirus: Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en
nios de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada ao en los pases
en desarrollo y son causa de ms de 800.000 fallecimientos anuales. Las infecciones
humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y, en menor medida, o con
otras caractersticas epidemiolgicas, por los grupos B y C.
Sangre oculta: el examen qumico de sangre en las deposiciones tiene inters cuando se
sospecha de la existencia de hemorragias digestivas subclnicas, es decir, sin que se avisen
visiblemente en forma de melenas, las causas pueden ser neoplsicas o inflamatorias. Por
ejemplo en la parasitosis por anquilostoma o tenias.
La prdia de 50 - 75 ml sangre (tubo gastrointestinal superior) provoca una coloracin roja
oscura, negra de las heces (melena). Una hemorragia de 2 a 3 das ocasiona prdidas de ms
de 1000 ml de sangre. La sangre oculta puede persistir hasta 5 a 12 das. Heces de un color
rojizo brillante se presentan por prdidas ms leves (tubo gastrointestinal bajo). Se debe
adems descartar una coloracin anormal de las heces causada por colorantes de alimentos.
Resultado:
Indicadores oxidado (compuesto de quinona) de color azul ( en el caso dei
guayaco); o en funcin del reactivo.
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Causas para el aparecimiento de falsos positivos y falsos negativos son:
Leucocitos fecales suelen encontrarse en las infecciones bacterianas del intestino provocadas
por microorganismos como:
- Salmonella spp.
- Shigella spp.
- Yersinia spp.
- Escherichia coli invasiva
As como por procesos inflamatorios no bacterianos como:
- Colitis ulcerosa
- Colitis asociada a antibiticos
En las heces de la diarrea secundaria a virus, bacterias toxnicas y parsitos no suelen
encontrarse leucocitos fecales.
Observacin:
- Realice una observacin sistemtica de varios campos hasta obtener 100 clulas
- Mientras cuenta las 100 clulas debe diferenciar las clases de clulas blancas.
Resultados:
La morfologa y propiedades de tinciln de los PMN en esta muestra son los mismos que los
estudiados en Hematologa, la diferencia es que se los observa ms pequeos.
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Reporte:
- Si hay variedad de leucocitos se reporta como % de PMN (diferencial)
lnterpretacin:
Mayor cantidad de neutrfilos: infeccin bacteriana
Mayor cantidad de mononucleares: infeccin viral
PMN Neutrfilos
Mononucleares Linfocitos y Monocitos
COPROCULTIVO
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
69
PRCTICA No. 9
ESPUTO
OBJETIVOS:
-Obtener muestras de esputo vlidas que provengan del sistema respiratorio inferior
-Detectar diferentes microorganismos que pueden causar infecciones en las vas respiratorias
bajas mediante el anlisis del esputo utilizando diversas tcnicas microbiolgicas
CONTEXTUALIZACIN
Material necesario:
- Frasco estril de boca ancha y hermtico.
- Suero fisiolgico estril y nebulizador.
Tcnica:
-Enjuagar la boca con agua destilada estril o solucin salina.
-Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal.
-De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones
de suero fisiolgico estril (15 ml durante 10 minutos), siendo til adems realizar un drenaje
postural o fisioterapia respiratoria.
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-Volumen de muestra requerido: de 2 a 10 Ml
Transporte y conservacin:
Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si esto no es posible, conservar en
frigorfico a 4C.
Observaciones:
- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibitico.
- No es til para anaerobios.
- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia
- La expectoracin debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (ms de 25
leucocitos polimorfonucleares y menos de 10 clulas epiteliales por campo 10x).
EXAMENES
a) Examen macroscpico:
La descripcin del esputo o de las secreciones producidas con la tos debe comprender
el color, la consistencia, aspecto, el olor entre otros, as:
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Aspecto normal: el esputo es de aspecto claro y acuoso y cualquier opacidad procede
de material celular en suspensin.
Color: el color del esputo est determinado por las sustancias que contiene y con
frecuencia puede indicar el proceso patolgico.
Este anlisis nos ayuda a tener un diagnstico previo de lo que podra tener el paciente,
por ejemplo, los esputos muy abundantes y purulentos sugieren un absceso pulmonar o
una bronquiectasia; los esputos sanguinolentos, sangrado (hemoptisis); los esputos
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espumosos y teidos de sangre, edema pulmonar; los esputos abundantes y mucinosos,
carcinoma de clulas alveolares.
b) Examen microscpico:
Tmense porciones de moco, pus, material caseoso. Examnese en forma de preparacin
hmeda y frotis coloreado.
Enfermedades
Bronquitis: Es una inflamacin de las vas areas bajas. Sucede cuando la trquea y los
bronquios, situados entre los pulmones, se inflama a causa de una infeccin o por alguna
otra causa. La bronquitis aguda generalmente sigue a una infeccin respiratoria viral. La
bronquitis crnica es una afeccin prolongada. Las personas tienen tos que produce moco
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excesivo.
Tuberculosis pulmonar: Es una enfermedad infecciosa, causada por Mycobacterium
tuberculosis. Infecciones ocasionadas por micobacterias atpicas (bacilos tuberculoides)
tales como: M. Kansasii, M. marinum, M. flavescens, M. gordonae, M. obuense.
Neumona bacteriana: Pulmona o neumonitis es una enfermedad inflamatoria de los
pulmones. La neumona puede afectar a un lbulo pulmonar completo (neumona lobular), a
un segmento de lbulo, a los alvolos prximos a los bronquios (bronconeumona) o al tejido
intersticial (neumona intersticial). La neumona bacteriana es una infeccin de los pulmones
causada por bacterias. El Streptococcus pneumoniae, un organismo Gram positivo que a
menudo coloniza la garganta, es la bacteria que con ms frecuencia causa neumona en
todos los grupos de edad excepto en recin nacidos. Otra causa importante de neumona por
bacterias Gram positivas es la causada por el Staphylococcus aureus. Tambin ocasionan
neumona bacterias del gnero Pseudomonas (bacilos Gram negativos), Klebsiella (bacilos
Gram negativos), Haemophilus influenza (cocobacilo Gram negativo).
Neumona viral: Es una inflamacin (irritacin e hinchazn) de los pulmones causada por
una infeccin con un virus que puede ser influenza, parainfluenza, adenovirus, rinovirus,
virus del herpes simple, virus sincicial respiratorio, hantavirus y citomegalovirus.
Neumona atpica: Se refiere a la neumona causada por ciertas bacterias a saber:
Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae y Chamydophila pneumoniae.
Enfermedades pulmonares parasitarias: Se producen ms comnmente por un nemtodo
como el Strongyloides stercoralis o el Ascaris lumbricoides. Tambin estn enfermedades
pulmonares causadas por parsitos trematodos como el Paragonimus westermani.
Fibrosis qustica (FQ): Es una enfermedad hereditaria frecuente que afecta al organismo
en forma generalizada, causando discapacidad progresiva y muerte prematura.
Neoplasias pulmonares: Tumores o cnceres del pulmn. Se atribuye al hbito de fumar,
asbesto, derivados del carbn, radiaciones ionizantes, xido de hierro, gas mostaza, nquel,
petrleo, uranio y cloruro de vinilo.
Asma bronquial: Es una enfermedad en la que se inflaman los bronquios, lo que produce
obstruccin de las vas areas, marcada por ataques recurrentes de disnea paroxstica, con
produccin de silbido debido a la contraccin espasmdica de los bronquios.
Esputo: mucoide viscoso generalmente presenta eosinofilia.
Neumoconiosis: Condicin caracterizada por la deposicin permanente de cantidades
sustanciales de partculas de materia en los pulmones, generalmente de origen ocupacional
o ambiental, y por la reaccin tisular a su presencia. Como por ejemplo al inhalar polvo de
piedras, arenas o pedernales que contienen bixido de silicio, con formacin de cambios
fibrticos nodulares generalizados en ambos pulmones.
Neumona por hongos: Infecciones con hongos del gnero Aspergillus, Pneumocistis,
Blastoyces dermatitidis, Coccidioides immitis (generalmente se presenta en pacientes con
SIDA), Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum. La infeccin ocasionada por el
Histoplasma capsulatum, est considerada una de las principales micosis endmicas del
continente americano.
Neumona por aspiracin: Tipo de neumona que se produce por la aspiracin de
alimentos, de lquidos, o del contenido gstrico en el tracto respiratorio superior.
Absceso pulmonar: Es la inflamacin de los pulmones y de las vas respiratorias que llevan
a ellos (bronquios) debido a la inhalacin de materiales extraos.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN:
- Se realizar el examen macroscpico de la muestra y se observar una preparacin
hmeda para rechazar o aceptar la muestra de esputo.
- Examen microscpico: Montaje hmedo directo y con KOH (para visualizar hongos),
GRAM y BAAR .
- Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma.
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PRCTICA No. 10
MALARIA O PALUDISMO
CONTEXTUALIZACIN
Los parsitos causantes de la malaria o paludismo son protozoarios esporzoarios del gnero
Plasmodium. Las dos especies que existen en el Ecuador, en las zonas tropicales y
subtropicales son Plasmodium vivax y Plasmodium falciplarum.
Se transmiten por la picadura de un vector, el mosquito del gnero Anopheles.
Gota gruesa
Es ms eficaz que el extendido, pues permite visualizar mayor numero de parsitos, por la
mayor cantidad de sangre que se estudia en cada campo microscpico. Es necesario lisar los
eritrocitos para permitir la visualizacin de los parsitos.
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Frotis extendido
Facilita la observacin del detalle mor'folgico de los parsitos y su relacin con los entrocitos,
por lo tanto permite confirmar la especie con mayor certeza.
MUESTRAS
Se puede utilizar sangre totalobtenida en un tubo que contenga EDTA. Muchas veces resulta
conveniente tambin tornar una muestra capilar para realizar los frotis. No se recomienda usar
sangre con heparina o con citrato de sodio.
COLORACION DE GIEMSA
Fundamento: Los parsitos causantes der patudismo se encuentran en la sangre; una parte
de su evotucin ocurre en el interior de los glbulos rojos. Estos parsitos se detectan en
extensiones sanguneas teidas con los colorantes de Giemsa.
Preparacin de las extensiones sanguneas
-Cuando se debe obtener la muestra.- Por lo general los parsitos son ms numerosos en la
sngre al final de un ataque de fiebre. La recoleccin de sangre se debe hacer invariablemente
antes de que se administren medicamentos antipaldicos.
- Preparar un frotis sanguneo para un examen minucioso por especies
- Preparar una gota gruesa para deteccin de los parsitos
- No se recomienda conservar los frotis sin tincin durante ms de 4 das.
Tincin
Antes de teirlas fijense las extensiones solo con metanol (2 a 3 minutos). Evtese que este
alcohol toque las gotas gruesas.
1. Haga una dilucin delcolorante de giemsa 1:10 con agua amortiguada,
2. Coloque los portaobjetos en una bandeja de tincin y cbralos con el colorante diluido.
3. Deje reposar por 30 minutos.
4. Lave la tincin con agua amortiguada.
5. Escurra el agua y deje secar el frotis
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACION
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PRCTICA No. 11
CONTEXTUALIZACIN
La importancia de este tipo de infecciones es cada vez mayor, pues su incidencia va cada vez
en aumento. Varios son los factores que intervienen: aumento de densidad y movilidad de las
poblaciones, dificultad para lograr cambios en la inadecuada conducta sexual de las personas.
Adems se debe tomar en cuenta que para la mayora de estas infecciones no existen
todava vacunas disponibles.
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OTROS: Staphylococcus aureus
GRUPO 1: mtodos propios, muchas veces el xito o fracaso der estudio recae en la
experiencia del microbilogo
GRUPO 2: diagnstico clnico primario, confirmacin por tcnicas parasitarias, bacterianas y
pruebas serolgicas (inmunolgicas)
GRUPO 3: pruebas inmunolgicas
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Ureaplasma urealyticum
Puede ser responsable de uretritis no gonococcicas en varones.
Son difciles de aislar, requiere de medios de cultivo especiales. Las colonias tienen
apariencia de huevos fritos, muy pequeas.
Cultivos: caldos de peptona con infusin de corazn y 2% de agar (pH7.8), 7% de lquido
asctico humano o de suero de animal (caballo o conejo), 37C por 48 a 96 horas.
Muestras: Hisopos rectales, secreciones uretrales o genitales.
El diagnstico puede tambin ser serolgico.
Cndida albicans
Es una levadura oval que produce un seudomicelio en cultivo, en los tejidos y exudados. Son
Gram positivas. En agar Sabouraud crecen colonias blandas color cremoso.
Puede causar vulvovaginitis, con irritacin, prurito y secrecin.
Muestras: raspados, exudados
Pruebas: Gram y cultivos en medios comunes o Agar de Nickerson.
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Trichomonas vaginalis
Es un parsito protozoario mastigophoro (flagelado). Tiene forma de pera, con una membrana
ondulante alineada, posee un flagelo posterior recto y 4 flagelos anteriores.
Se la puede observar en ftotis directos de secreciones vaginales.
Muestras: secreciones uretrales y vaginares, los frotis se los puede teir con hematoxilina,
Wright-Giemsa o ticin de Gram.
Gardnerella vaginalis
Se lo asla de mujeres que sufren vaginitis, sepsis neonatal, bacteremia post partum, y de
hombre con uretritis no especfica.
En los frotis hmedos produce clulas indicadoras (clulas gua o clue cells), que son clulas
epitetiates vaginales con muchos bastoncillos minsculos. Se ha comprobado que estas
bacterias no requieren ningn factor especial de crecimiento y se los observa como
cocobacilos gram negativos. Las colonias son pequeas grises, beta hemolticas.
Una prueba rpida de su presencia es colocar unas gotas de KOH al 10% en preparaoiones
en fresco de secreciones vaginales; es caracterstico encontrar un olor a pescado por la
presencia de aminas.
82
Treponerrna pallidum
Son espiroquetas muy mtiles, no se le puede cultivar in vitro.
Se puede hacer la observacin directa en microscopio de campo oscuro en lquidos tisulares
exprimidos de las lesiones superficiales tempranas.
El diagnstico se lo hace en base a pruebas serolgicas: tesis no treponmicos para
screening: VDRL o su variante, el RPR. EI test confirmatorio es el FTA-Abs (prueba
Treponmica)
Haemophilus ducreyi
Causa la enfermedad venrea chancroide" (chancro blando), que es una lcera desgarrada
de los genitales.
Son cocobacilos Gram-negativos- pequeos, dificiles de cultivar, puesto que requieren del
llamado factor X, crece mejor a partir de raspados de la base de la lcera sembradas en agar
chocolate con 1% de isovitalex vancomicina (3g/ml).
Se incuba en atmsferde CO2 al 10%, a 37C.
Chlamydia trachomatis
Son bacterias parsitas intracelulares estrictias, no mtiles. Gram negativas.
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lntracelularmente forman inclusiones (micro cotonias). Son metablicamente muy activas, Se
colorean bien con Giemsa
Producen linfogranuloma venreo (serotipos L1, L2 y L3), que se caracteriza por adenitis
inguinal supurativa, o uretritis inespecfica (serotipos-k).
Para su diagnostico se necesitan tcnicas especiales como cultivos celulares, que son
tcnicas complejas y poco utilizadas de forma rutinaria, por lo que se prefiere el diagnstico
inmunolgico para encontrar anticuerpos sricos. Tambin existen pruebas para detectar el
antgeno en orina o en secrecin vaginal.
Calymatobacterium granulomatis
Casa de la enfermdad venrea'"granuloma inguinale", caracterizada por la presencia de
hinchazones en los genitales, nalgas y abdomen con lesiones granulornatosas que pueden
ser ulcerativas o sangrantes.
Es un bacilo Gram negativo, no mtil, pleomrfico, con extremos redondeados, que se colorea
bipolarmente y aparece como "imperdibles".
Difcil de cultivar, Requrere de bajas tensiones de oxfgeno. Se pueden utilizar embriones de
pollo de 5 das y se desarrolla despus de las 72 horas a 35C.
Hrpes virus 1
El HSV-2 causa el herpes genital. El herpes genital primario puede ser grave y durar largo
tiempo. Produce lesiones vesculo-ulcerativas en el pene del varn o cuello, vulva, vagina y
perin en la mujer. Las lesiones son dolorosas y se acompaan de fiebre, malestar general y
linfadenopata inguinal.
El diagnstico del laboratorio se realiza por aislamiento del virus de las lesiones, pero ms
prcticos resultan los tests inmunolgicos.
VIH
Pertenece a los retrovirus. La enfermedad (SIDA) se caracteriza por una, depresin del
sistema immunitario y por desarrollo de neoplasias poco comunes como el Sarcoma de
Kaposiy por otras infecciones oportunistas graves.
El diagnstico de laboratorio se hace por aislamiento del virus por PCR, conteo de linfocitos
CD4 de sangre perifrica, mdula sea o plasma. Las pruebas inmunolgicas con suero del
paciente por ELISA (test de screening) y la confirmacrn por la tcnica de Western-Blot.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
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PRACTICA No. 12
Objetivos:
CONTEXTUALIZACIN
Las reacciones de antgeno y anticuerpo son muy especficas. Un antgeno reaccionar slo
con el anticuerpo estimulado por antgenos de su propia clase o muy relacionados. Debido a
su elevada especificidad, las reacciones entre un antgeno y un anticuerpo pueden usarse
para identificar uno por medio del otro.
Esta especificidad es la base de las reacciones serolgicas. Las posibles reacciones cruzadas
entre antgenos relacionados pueden limitar la especificidad de la prueba.
Las reacciones de antgenos con anticuerpos se utilizan para identificar componentes
especficos en mezclas. Los microorganismos y otras clulas poseen diversos antgenos, y
por tanto, pueden reaccionar con numerosos anticuerpos diferentes.
Antgeno: sustancia que reacciona con anticuerpos o receptores de clulas T, despertadas por
inmungenos.
Anticuerpo: Protena producida a causa de la introduccin de un antgeno, y que tiene la
capacidad de combinarse con el antgeno que estimul su produccin.
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REACCIONES ANTGENO ANTICUERPO EN EL LABORATORIO
Los diferentes tipos de reacciones de antgenos con anticuerpos utilizan la ventaja de las
distintas caractersticas fsicas o biolgicas de sus reactantes y de acuerdo con ellas, se
escogen las ms adecuadas con fines de diagnstico.
Radioinmunoanlisis (RIA): este mtodo cuantifica antgeno que pueden ser marcados con
radioactividad. Se basa en la competencia por el anticuerpo especfico entre una
concentracin conocida de material marcado y una concentracin desconocida de material no
marcado. Ms adelante los complejos que se forman entre antgeno y anticuerpo pueden
separarse y la cantidad de radiactividad se mide.
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Anlisis inmunosorbente con enzima enlazada (ELlSA): Este mtodo tiene numerosas
variantes depende de la conjugacin de una enzima o un antgeno o un anticuerpo. La enzima
se detecta por anlisis de su actividad con su sustrato.
Para medir antgenos, anticuerpos conocidos se fijan a una fase slida, se incuba con
diluciones del suero problema, se lava e incuba de nuevo con una anti- inmunoglobulina
marcada con una enzima. La actividad enzimtica medida por adicin del sustrato especfico
con desarrollo de color es una funcin directa de la cantidad de anticuerpo unido.
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Fijacin de complemento: El sistema de complemento est constituido por 20 o ms
protenas plasmticas que interactan entre si y con las membranas celulares. Cada
componente protenico debe ser activado en secuencia, en condiciones apropiadas para que
la reaccin progrese. Los complejos de antgenos con anticuerpos se cuentan entre los
activadores y la prueba de fijacin del complemento puede usarse para identificar a uno de
ellos si el otro se conoce.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
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Efectuar varias pruebas inmunolgicas tales como: ASTO, VDRL, HIV y observar sus
resultados.
Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.
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MICOSIS
Hasta que punto debe ser un hongo identificado es una decistin clnica y a veces acadmica.
Frecuentemente una identificacin es realizada para eliminar la posibilidad de que el aislado
sea un patgeno verdadero. La especificacin deber ser interpretada slo cuando sea
clnicamente relevante o acadmicamente importante.
COLECCIN DE ESPECMENES
La tcnica para la coleccin de material para cultivo de hongos es importante, ya que muchas
levaduras y mohos no patgenos: Son frecuentes contaminantes en especmenes clnicos y
pueden crecer ms y enmascarar los hongos patgenos significantes.
Piel: Las lesiones cutneas requieren raspados del borde activo. Material suficiente y
representativo para cultivo y examen microscpico deber ser colectado y transportado al
laboratorio.
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Pelo: Los pelos infectados deben ser arrancados y enviados al laboratono.
Uas: Las uas infectadas no deben ser cortadas con tijeras. No colecte detritus de debajo de
la ua infectada. Primero, remueva la parte superficial no infectada de la ua por raspado.
Cuando se alcanza la porcin enferma, remuvala por raspado y envela al laboratorio.
Especmenes subcutneos
Todo material debe ser enviado al laboratorio en un contenedor estril. Transporte e
inoculacin rpida son necesarios ya que muchos especmenes pueden tambin contener
bacterias que pueden crecer y enmascarar y consecuentemente inhibir o retardar el
aislamiento de los hongos patgenos.
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Esputo, secreciones traqueales, secreciones bronquiales y respiratorias bajos un buen
especmen de esputo es de 5 a 10 ml de material recientemente descargado del rbol
bronquial, con cantidades mlnimas de contaminantes orales o nasales.
Tres especmenes pequeos de este tipo son mejores que un especimen coleccionado de 24
horas de volumen total igual. El hecho de que el especimen sea obtenido por la maana
temprano o a otra hora no es importante a pesar que muchos pacientes producen ms esputo
poco despus de levantarse en la maana. El esputo debe ser colectado usando un
contenedor estril. Esputos inducidos deben tambin ser colectados en un contenedor estril.
Aspirados traqueales y secreciones bronquiales pueden ser enviados en tubos de ensayo con
tapn de caucho u otros contenedores estriles apropiados,
Lavados gstricos
Lavados gstricos en ayunas debern ser colectados cuando no sea posible obtener esputo.
Debern ser colectados en tubos estriles. Una serie de tres especmenes es recomendada.
Orina
El espcimen de eleccin es la porcin media del chorro de la miccin de la maana obtenida
limpiamente. Mltiples especmenes de este tipo son superiores a un especimen recolectado
de 24 horas. Mantener refrigerado antes de procesar.
Mdula sea
Los especmenes de mdula sea son enviados en 0,1 ml de anticoagulante EDTA.
Tejidos
Los especmenes de tejido deben ser remitidos en un contenedor estril. Si el tejido est seco,
mjelo tigeramente con solucin salina al 0.85% y refrigrelo hasta ser procesado. Todo tejido
debe ser molido o finamente cortado cuidadosamente.
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HONGOS
Examen macroscpico
Examen microscpico directo del material clnico (KOH 10%)
Cultivos
Reportes preliminares:
Dentro de 24 horas de la recepcin de especfmenes con el resultado de la coloracin
Despus de 7 das de incubacin (si no se detecta crecimiento) reportando No hay
crecimiento en siete das
Reportes finales:
Los reportes finales sern enviados al completarse los procedimientos de identificacin o
despus de 28 das de incubacin si no hay evidencia de crecimiento fungal.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Examinar microscpicamente con KOH al 10 20% o en forma directa las muestras
entregadas y realizar la interpretacin de los elementos entregados.
Observar placas teidas con Gram y comparar entre las muestras.
Revisar los medios de cultivos con crecimiento de hongos y compare con cultivos
bacterianos.
Realice reflexiones sobre los resultados obtenidos junto con las fotos respectivas
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BIBLIOGRAFIA
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Aires, Argentina: Mdica Panamericana.
Gilbert, David N.. (2010). The Sanford guide to antimicrobial therapy 2010(40). Sperryville,
Estados Unidos: s.n..
Ash L. R. (2010), Atlas de Parasitologa Humana, 5ta. Edicin, Buenos Aires: Editorial Mdica
Panamericana.
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, (1995) O. M. S., Ginebra.
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