ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE SALUD PBLICA

ESCUELA DE MEDICINA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

Fecha: 23 de octubre de 2013

Curso: 4to B

Docente: Dra. Rosa Vlez Pazmio

Estudiante: Francisco Santilln Freire

Prctica N: 5

Tema: Observacin de muestras de medios de cultivo

Marco terico:

Introduccin

Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos, pero no requieren de

mayor espacio para su continua reproduccin, por lo que es sencillo crear un ambiente
artificial dentro de un tubo de ensayo, un matraz o una caja Petri. El recipiente debe
estar completamente estril previo a la inoculacin de microorganismos, y posterior a
esta debe ser protegido contra posibles factores contaminantes externos. Para ello la
caja Petri cuenta con una tapa que lo hace correctamente, que al voltearla no solo
evita la contaminacin externa de la muestra, sino tambin la fuga de microorganismos
que se encuentran en la muestra. En el caso de matraces o tubos de ensayo, existen
tapones especiales como los de algodn que evitarn la fuga o ingreso de
microorganismos, de la misma forma existen tubos de tapa rosca que son ms
seguros incluso al momento de manipularlos.1

Los medios de cultivo son indispensables para el aislamiento y separacin de

microorganismos, especialmente de bacterias, lo que permitir su correcta
identificacin y por lo tanto un diagnstico asertivo. Para ello se procede a la siembra
del microorganismo que no es ms que la estriacin desde la muestra inoculada
previamente inoculada, lo que permitir separar a la bacteria en colonias facilitando su
estudio.

Colonia llamamos al conjunto de grmenes idnticas caractersticas hereditarias,

tintoriales y metablicas, que se desarrollan generalmente en un medio slido. La
morfologa de la colonia es caracterstica de cada tipo de bacteria, por lo tanto es muy
importante determinar el color, densidad, consistencia, forma y tamao para tener una
pauta de la identificacin de un microorganismo.

Al trabajar con cultivos bacteriolgicos es importante que estos sean manejados

aspticamente evitando contaminacin tanto de la muestra como del personal que
manipula esa muestra y su entorno.

Existen muchos microorganismos que constituyen la flora normal, y que cumplen

funciones importantes, en la siguiente prctica se aislar e identificarn
microorganismos presentes en la faringe.

Objetivos

Aislar cocos Gram positivos y negativos a partir de una muestra de secrecin

farngea.
Aplicar pruebas enzimticas para su identificacin.
Observar a travs del microscopio los microorganismos que se han formado en
el medio de cultivo
Reconocer las reacciones de hemlisis.

Materiales

Hisopos
Cajas Petri con agar sangre
Cajas Petri con agar EMB
Placas portaobjetos
Incubadora
Microscopio
Sangre con EDTA
Tubos de ensayo
Palillos
Lpiz graso

Reactivos

Perxido de hidrogeno
Colorante Gram
Azul de metileno
Aceite de inmersin
Suero fisiolgico
Discos de bacitrina
Discos de optoquina
Plasma sanguneo con EDTA
Desarrollo de la prctica

Se tomar una muestra de secrecin orofarngea, una muestra de acn, y una muestra
nasofarngea para identificar los microorganismos presentes en estas zonas. Luego,
se proceder a identificar el tipo de microorganismo, basndose en la morfologa de la
colonia, el tipo de reacciones hemolticas, coloracin Gram y pruebas enzimticas.

Procedimiento

1. Permitir que los medio de cultivo adquieran la temperatura ambiente, ya que

medios fros pueden inhibir el crecimiento de algunos tipos de bacterias.
2. Tomar una muestra de secrecin orofarngea, nasofarngea o de acn con un
hisopo estril.
3. Junto a un mechero encendido, abra la caja Petri e inocule la muestra en un
lado superior de la caja, tanto en el agar sangre como en el EMB.
4. No inocules en reas grandes, ya que esto dificultar la estriacin y el
aislamiento posterior de las colonias.
5. Con otro hisopo o un asa bacteriolgica esterilizada, estre sobre el inculo de
extremo a extremo hasta 1/3 de la caja.
6. Si utiliza el asa bacteriolgica, esterilice y enfre a partir de la estriacin
anterior, evitando el contacto con el lugar de inoculacin para evitar la
formacin de aerosoles.
7. Usando el paso anterior realice 2-3 estriaciones ms.
8. Realice cortes en el agar sangre para observar de mejor manera las reacciones
de hemlisis.
9. Al estriar en tres planos se puede cuantificar a groso modo los
microorganismos presentes
a. Si crecen solamente en la primera estriacin: Escasos
b. Si crecen en la 2 estriacin: Moderado
c. Si crecen en la 3 estriacin: Abundante

Ilustracin 1 Imagen tomada de Rodriguez, E. Bacteriologa General: Principios y Prcticas de Laboratorio. 1

Edicin. Costa Rica: Universidad de Costa Rica. 2005. p. 107,108, 109, 152-18. Disponible en:
http://books.google.com.ec/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=fr
Recomendaciones

Al estriar, utilice toda la superficies del medio de cultivo, no realice nicamente

lneas.
No es necesario esterilizar el asa en cada estriacin si se trabaja con muestras
que contienen pocas bacterias o cultivos puros.
Las estriaciones deben estar juntas, excepto la 3 donde se trata de separar las
colonias.
Nunca estre sobre una estriacin previa.
Inocule las cajas Petri a 37C por 24-48hs. Llvelas a la incubadora y observe
el crecimiento bacteriano.

Identificacin

Para la identificacin bacteriana, se valoran los siguientes parmetros:

Morfologa y aspecto de las colonias.

Coloracin Gram de las colonias que se desarrollan en el agar.
En casos de ser cocos Gram positivos, realizar pruebas de catalasa.

Catalasa

Enzima hemoproteica que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en oxgeno y

agua. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el
perxido de hidrogeno es letal para las clulas bacterianas.

La prueba de catalasa se hace generalmente en lmina portaobjetos (en ocasiones en

tubo), y se la utiliza para diferenciar a Streptococcus negativos de Staphylococcus
positivos y Micrococcus positivos, as como Bacillus positivos de Clostridium positivos.2

El procedimiento para esta prueba es el siguiente:

1. Con el asa bacteriolgica esterilizada transfiera una colonia bien aislada hacia
el portaobjetos estril.
2. Aadir 1-2 gotas de H2O2 al 15%.
3. Observe si se forman burbujas luego de aadir el reactivo, si se forman pocas
burbujas luego de 20-30 segundos, la prueba no puede considerarse como un
resultado positivo.
4. Anote los resultados.
5. Descarte la placa en un recipiente con desinfectante para luego someterlo al
autoclave.2

En el caso de identificar Staphylococcus, realice la prueba de coagulasa, utilizada

para distinguir los Staphylococcus patgenos de los no patgenos.

Coagulasa

Enzima termoestable que tiene la capacidad de convertir el fibringeno en fibrina y es

importante para diferenciar el gnero Staphylococcus.
Tienes dos tipos de prueba, uno en tubo y otra en placa.

La prueba en tubo detecta la coagulasa libre o estafilocoagulasa, que transforma la

protrombina en estafilotrombina que convierte el fibringeno en fibrina.

Procedimiento:

1. Inocule una muestra del cultivo a probar en un tubo con plasma estril.
2. Incubar el tubo en bao mara a 37C.
3. Para evidenciar la formacin del cogulo, observe el tubo cada 30min, en
posicin inclinada.
4. Esta inclinacin permite que el cogulo se forme en el fondo del tubo, caso
contrario el lquido se recorrera a la pared del tubo.
5. Si a las 4hs la prueba es negativa, incube por 24hs a bao mara a 37C.

La prueba en placa detecta la coagulasa fija que se encuentra en la membrana, y es

aquella que media la fijacin del fibringeno con el estafilococo y los aglutina,
formando el grupo conocido como factor de agrupamiento.

Procedimiento

1. Coloque una gota de agua destilada en una placa portaobjetos estril.

2. Tome una muestra de cultivo e inoclelo en la gota, si se aglutina, pase a la
prueba con tubo.
3. En caso de que no haya aglutinacin, agregue una gota de plasma y mezcle.
4. Observe si se forma un precipitado granular entre los primero 5-20 segundos
formada la suspensin bacteriana.
5. Si ese precipitado es fuerte constituye una prueba positiva.
6. Si la precipitacin es dbil u ocurre luego de 20 segundos, se debe realizar la
prueba en tubo.
7. Una prueba positiva en lmina es vlida nicamente cuando la suspensin
bacteriana no se autoglutina.
8. La aglutinacin se puede observar a travs del microscopio a 200x.

Si identifica Streptococcus, realizar la prueba de bacitrina y optoquina.

Bacitrina

Prueba utilizada para la identificacin de Streptococcus hemoltico del grupo A.

Este antibitico interfiere la formacin de unidades de peptidoglicano y es cpaz de

romper la membrana citoplasmtica bacteriana. La prueba se la realiza en una placa
Petri de agar sangre.

Procedimiento

1. Divida la placa en tres secciones e inocule densamente cada uno de los

Streptococcus a probar, rotule adecuadamente.
2. Sumerja las pinzas en alcohol de 95% y pasarlas luego por la llama del
mechero para esterilizarlas.
 3. No acerque el alcohol a la llama, no sumerja las pinzas encendidas en el
recipiente con alcohol. Note que la llama de las pinzas con alcohol es
difcil de observar.
4. Colocar un disco de bacitrina en el centro de cada uno de los rayados
realizados.
5. Presione levemente el disco contra el agar con el fin de que se adhiera al
medio.
6. Incubar a 35C por 24hs.
7. Observe la formacin de halos y anote los resultados

Optoquina

Prueba para el estudio de Streptococcus hemoltico, especialmente al S. pnumoniae.

La optoquina u optoqun (hidrocloruro de etilhidroxicuprena), es un derivado

hidrosoluble de la quinina capaz de inhibir el crecimiento del S. pneumoniae debido a
cambios de la tensin superficial lo que afecta a la membrana celular bacteriana y
aumenta su fragilidad. De igual manera se la utiliza en un medio de cultivo con agar
sangre.

Procedimiento

1. Divida la placa en tres secciones e inocule densamente cada uno de los

Streptococcus a probar, rotule adecuadamente.
2. Sumerja las pinzas en alcohol de 95% y pasarlas luego por la llama del
mechero para esterilizarlas.
3. No acerque el alcohol a la llama, no sumerja las pinzas encendidas en el
recipiente con alcohol. Note que la llama de las pinzas con alcohol es
difcil de observar.
4. Colocar un disco de optoquina en el centro de cada uno de los rayados
realizados.
5. Presione levemente el disco contra el agar para que se adhiera al medio de
cultivo.
6. Incubar a 35C por 24hs en atmsfera con CO2 incrementado.
7. Examine el disco en busca de zonas de inhibicin y mida su dimetro.
8. Anote los resultados2

Interpretacin

Sensible: presencia de inhibicin alrededor del disco.

Resistente: cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco.
Los casos de halos intermedios deben resolverse por acumulacin de pruebas
a favor o en contra.
 Observaciones

La clara diferencia en la formacin de colonias fue que ciertos tipos de colonias

se formaron en el agar sangre mientras que en el EMB no, esto se debe por su
selectividad que a diferencia del agar sangre no lo es.
El conocimiento bsico para la toma y tincin de muestras fue clave en esta
prctica, ya que se obtuvo una calidad visual alta al momento de observar
microorganismos al microscopio.
El halo formado nos permiti distinguir los diferentes tipos de hemolisis que
sucedieron en el medio agar sangre.
En ningn momento se dej de lado las normas de bioseguridad aprendidas,
esto fue un factor determinante en la recoleccin y tincin de muestras.

Conclusiones

El conocimiento base de normas de bioseguridad, toma de muestras y tincin

de las mismas nos permiti obtener resultados de calidad, comprobndolo al
momento de llevar las muestras al microscopio.
El uso del mechero fue fundamental para la creacin de un dimetro de
seguridad al momento de manipular los medios de cultivo.
Las reacciones de hemlisis permite identificar el tipo de bacteria con la que se
est tratando, por ende asegura un mejor diagnstico.
El uso de los medios de esterilizacin debe ser preciso caso contrario se
contaminara el personal y el entorno en donde se encuentra manipulando
muestras.

Preguntas de investigacin

1. Defina enzima, sustrato, que valor tienen las pruebas enzimticas en el

diagnstico microbiolgico?

Las enzimas son protenas cuya accin biolgica consiste en la catlisis de reacciones
del metabolismo las cuales transcurriran muy lentamente sin su intervencin. El
concepto de catlisis implica la influencia del catalizador en la reaccin acelerndola
sin consumirse en dicho proceso. El sustrato es la molcula sobre la que acta la
enzima.3

2. Cul es el sustrato de la reaccin de catalasa y coagulasa? Por qu produce

burbujas en la reaccin de catalasa positiva? Por qu se forma el cogulo en la
prueba de coagulasa?

Los cocos gram positivos son los productores de catalasa. El sustrato de la catalasa
es el perxido de hidrgeno generado por otras enzimas, resultando oxgeno y agua,
es por esto que se forman burbujas frente a la reaccin positiva de la catalasa, es S
auereus es el nico que produce reacciones positivas a catalasa y coagulasa por lo
que es fcil de identificar.

El sustrato de la coagulasa producida por el S. aureus es el fibringeno del plasma y

activa una cascada de reacciones que provocan la coagulacin del plasma. La
coagulasa ligada o factor de afinidad por el fibringenose detecta con una prueba
 rpida de portaobjetos cuyo resultado se considera positivo si se observa aglutinacin
de microorganismos sobre un portaobjetos de vidrio4, 5

3. Que puede inhibir la actividad de la catalasa?

La formacin de catalasa es reprimida por los hidratos de carbono fermentables en el

medio, por lo que se recomienda el empleo de caldo con carne picada como medio de
crecimiento cuando se comprueba la catalasa.

La formacin de catalasa y peroxidasa es reprimida en las clulas que desarrollan en

medios que contienen glucosa como sustrato primario.

El agregado de tolueno inhibe las reacciones catalticas y peroxidativas.

La catalasa es inactivada por la luz del sol en condiciones de aerobiosis.6

4. Porqu se forman colonias en el agar sangre y no en el EMB?

Porque el agar sangre es un medio rico en nutrientes por lo que se desarrollan
muy fcilmente colonias de diversos microorganismos, a diferencia del agar
EMB que adems de poseer un escaso aporte de nutrientes, es un medio
selectivo solamente para bacilos Gram negativos especialmente del tipo
entrico.6
5. Porqu en el EMB hubo desarrollo de los elementos que va a observar y
el agar sangre no?
Por su bajo aporte de nutrientes, lo que limita a la formacin de
microorganismos que cumplan estas caractersticas como por ejemplo los
bacilos Gram negativos.7
6. Qu factores hay que tener en cuenta al momento de preparar un medio
de cultivo?
a. Usar en todo momento normas de bioseguridad.
b. Al tomar los diferentes tipos de agar se debe utilizar las medidas
correctas antes y despus de mezclarlas con agua, ya que de
esta manera asegura una muestra de mejor calidad y una
diferenciacin adecuada.
c. El tipo de bacteria que queremos aislar.
d. identificar el agar necesario para el cultivo de microorganismo.
e. Preparar el medio cerca de un mechero, antes y despus de
inocular la muestra.
f. Procure invertir la caja Petri una vez inoculada para evitar la
propagacin de microorganismos.
g. Refrigerar a la temperatura indicada (36) para evitar una
alteracin del medio de cultivo.
h. El material que se use para preparar un medio de cultivo debe
estar completamente estril, con el fin de asegurar una muestra
totalmente pura.
i. Asegrese que los datos del paciente, el tipo de muestra tomada,
fecha, se encuentren rotuladas en la caja Petri.8, 9
7. Tipos de hemlisis?
Existen tres tipos:
a. Alpha: lisis parcial de los eritrocitos que rodea una colonia. Produce
una coloracin verde o pardo en el medio de cultivo
b. Beta: lisis completa de eritrocitos. Produce una eliminacin de sangre
por debajo de las colonias y a su alrededor.
c. Gamma: no existe hemlisis. Halos incoloros10
8. Que tipos de estructuras se observan en el azul de metileno?
Se observa bacterias de un color azul intenso y leucocitos polimorfonucleares
de una tonalidad ms clara. Se la puede complementar con tincin Gram, ya
que bacterias Gram negativas como la H. influenzae o la N. meningiditis no
suelen teirse con la tincin Gram.11
9. De que organismos se trata en el EMB?
Se trata de bacterias del tipo bacilos, ya que la combinacin eosina y azul de
metileno inhibe la formacin de bacterias Gram positivas o negativas
fastidiosas como los estreptococos o estafilococos.7
Bibliografa

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2. Rodriguez, E. Bacteriologa General: Principios y Prcticas de Laboratorio. 1
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8. Laboratorios Britania. Argentina: Laboratorios Britania. 2010. [actualizado 2010,
citado 23 de octubre de 2013]. Disponible en:
http://www.britanialab.com/productos/231_hoja_tecnica_es.pdf

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