FUNDACION UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA- UNIAGRARIA FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

DILUCIONES SERIADAS DECIMALES Y RECUENTO EN PLACA.

Presentado por: GUSTAVO NARVAEZ, JEYSON SUAREZ, JUAN CARLOS GUZMAN, FERNANDO GONZALES.

DESCRIPCION DEL PRDUCTO Arroz de leche con un poco de canela en polvo sobre la superficie, producto elaborado en una panadera ubicada en el norte de la ciudad de Bogot, este producto ese encontraba empacado en vasos desechables y exhibido en una bandeja plstica sobre un mostrador, en el momento de la compra del producto se cubri con la respectiva tapa del envase, este producto se encontraba a una temperatura media. FICHA TECNICA DEL MEDIO DEL CULTIVO

Oxytetracycline Glucose Extract Agar (OGYE)

Yeast

DM487. Un medio selectivo para enumeracin de levaduras y mohos en muestras alimenticias. Contenido: ver etiqueta del envase. Composicin* Concentracin del medio: Extracto de levadura Glucosa Biotina Agar 5.0 g/litro 20.0 g/litro 0.0001 g/litro 12.0 g/litro pH final: 7.0 0.2

Almacenamiento y caducidad Todos los contenedores deben ser almacenados bien cerrados en un lugar seco a 25 C o por debajo hasta la fecha de caducidad mostrada en la etiqueta del envase. Algunos medios pueden requerir almacenamiento a 2 8 C, referirse a la etiqueta del envase. Precauciones Exclusivamente para uso diagnostico in vitro. Respetar las precauciones de seguridad y utilizar tcnicas aspticas. Debe ser utilizado solo por personal de laboratorio cualificado y con experiencia. Antes del desecho, esterilizar todo el material biolgico. Referirse a la hoja de seguridad del producto (disponible si se requiere o a travs de la pgina web de MAST)

Materiales requeridos pero no proporcionados Accesorios y productos para anlisis microbiolgico de base, por ejemplo: lazos, suplementos selectivos MAST, hisopos, palillos aplicadores, incineradores e incubadores, et as como reagentes bioqumicos y aditivos como sangre). Procedimiento 1. Referirse a la etiqueta del envase para cantidades y volmenes requeridos. Preparar MAST Oxytetracycline Glucose Yeast Extract Agar (OGYE) (DM487) suspendiendo los polvos en agua destilada o desionizada. Para los envases de sobre, disolver el contenido entero sobre el volumen mostrado en la etiqueta. 2. Autoclave a 115 C (10 p.s.i.) durante 10 minutos. 3. Enfriar a 50 - 55 C y mantener a esta temperatura en una cubeta de agua. Aadir MAST Oxytetracycline Selectavial (SV204) como se indica i mezclar bien. 4. Verter en las placas (15 20 ml por placa) y dejar solidificar. 5. Las placas de cultivo preparadas deben ser usadas inmediatamente o almacenadas en bolsas de plstico 2 8 C hasta un mximo de una semana antes de su uso. 6. Preparar un homogenato de la muestra usando bien un aparato stomacher o mezclador homogenizando 25 g o 25 ml de muestra en 225 ml de diluyente preparado. 7. Usando un homogenato y una gama adecuada de diluciones

decimales, inocular la superficie de una placa agar mediante un mtodo adecuado para la enumeracin. 8. Las placas deben ser incubadas al revs, a 22 - 25 C de tres a cinco das, comprobando si hay micelios areos despus de dos das. Interpretacin de resultados Despus de incubacin registrar el crecimiento de microorganismos. Las caractersticas tpicas a notar incluyen: tamao de la colonia y morfologa, pigmentacin, y hemolisis en medio que contenga sangre. Control de calidad Comprobar si hay signos de deterioro. Se recomienda que el control de calidad se lleve a cabo con al menos u microorganismo que demuestre una reaccin esperada. No usar el producto si la reaccin con el microorganismo de control es incorrecta. La lista de abajo ilustra una variedad de actuaciones de las cepas de control de uso rutinario, que el usuario final puede obtener fcilmente.(1) Microorganismos Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 Aspergillus niger ATCC 16404 Candida albicans ATCC 10231 Escherichia coli ATCC 25922 Resultados Crecimiento Crecimiento Crecimiento Ningn crecimiento

IFU458 MM 08/08 V2 MAST es una marca registrada ATCC es una marca registrada de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA *La composicin puede variar para seguir los criterios de actuacin

Plate Count Agar

DM195 Para el examen bacteriolgico de comida, agua, leche y otros productos lcteos. Contenido: ver etiqueta del envase

bioqumicos y serolgicos, y aditivos como sangre. Procedimiento 1. Referirse a la etiqueta del envase para cantidades y volmenes requeridos. Preparar MAST Plate Count Agar (DM195) suspendiendo los polvos en agua destilada o desionizada. Para los envases de sobre, disolver el contenido entero sobre el volumen mostrado en la etiqueta. 2. Autoclave a 121 C (15 p.s.i.) durante 15 minutos. 3. Enfriar a 45 - 50 C y mezclar bien antes de preparar para verter en las placas (10 12 ml en cada placa) con muestras seriales diluidas de leche y otros productos lcteos. 4. Incubar las placas aerbicamente durante 48 horas a 31 - 33 C (o temperaturas alternativas de acuerdo con la metodologa seguida). Interpretacin de resultados Despus de la incubacin contar todas las colonias (usar placas para el recuento de levaduras entre 30 y 300 colonias) y despus dejar para los factores de dilucin el clculo del nmero de colonias que forman unidades (CFU) por cada ml de muestra original. Control de calidad Comprobar si hay signos de deterioro. El control de calidad debe ser llevado a cabo con al menos un organismo que demuestre la actuacin esperada. No usar si el resultado de control del microorganismo es incorrecto. La lista de abajo ilustra una variedad de actuaciones de las cepas de control de uso rutinario, que el usuario final puede obtener fcilmente.(2)

Composicin* Concentracin del medio: Triptona Dextrosa Extracto de levadura Agar pH final: 7.0 0.2 Conservacin y caducidad Todos los contenidos deben ser mantenidos cerrados hermticamente y almacenados en un lugar seco a 25 C o menos hasta la fecha de caducidad mostrada en la etiqueta del envase. Algunos medios requieren almacenamiento a 2- 8 C, referirse a la etiqueta del envase. Precauciones Exclusivamente para uso diagnostico in vitro. Respetar las precauciones de seguridad y utilizar tcnicas aspticas. Debe ser utilizado solo por personal de laboratorio cualificado y con experiencia. Antes del desecho, esterilizar todo el material biolgico. Referirse a la hoja de seguridad del producto (disponible si se requiere o a travs de la pgina web de MAST). Materiales requeridos pero no proporcionados Accesorios y productos para anlisis microbiolgico de base, por ejemplo: anillos para anlisis, suplementos selectivos MAST, esponjas, torundas, incineradores y termostatos, etc Otros, como reactivos 5.0 g/litro 1.0 g/litro 2.5 g/litro 12.0 g/litro

Microorganismos Escherichia coli ATCC 25922

Resultados Crecimiento

Staphylococcus epidermis Crecimiento ATCC 14990

IFU342 MM 06/08 V2 MAST es una marca registrada ATCC es una marca registrada de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA *La composicin puede variar para seguir los criterios de actuacin

PROCEDIMIENTO Inicialmente se pes la cantidad necesaria de la muestra del producto, en este caso el arroz de leche, todo el procedimiento se realiz cerca al mechero y utensilios estriles, en seguida se realizaron las diluciones con agua peptonada al 0,1% en tubos de ensayo con tapn cada una con su respectiva pipeta, despus se realizaron las respectivas siembras en superficie rastrillada (PC) y en profundidad completando con agar (OGY), luego fueron llevadas a incubacin.
10g arroz con leche
PESAR LA MUESTRA

0.1 ml dilucion
SIEMBRA EN SUPERFICIE

-Agua peptonada 90ml. -Muestra.

DILUCION 1 ml dilucion -Agar OGYE. 0.1 ml dilucion 1 ml dilucion SIEMBRA EN SUPERFICIE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD 72 horas a 30 C
INCUBADORA

Agua peptonada 9 ml.

DILUCION

1 ml dilucion -Agar OGYE. 0.1 ml dilucion 0.1 ml dilucion Agua peptonada 9 ml. DILUCION 1 ml dilucion -Agar OGYE.

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

5 dias a 25 C INCUBADORA

SIEMBRA EN SUPERFICIE

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

Despus de haber cumplido su periodo de tiempo requerido en las respectivas incubadoras se procede a realizar el recuento en placa.

RESULTADO Microorganismos mesofilos RECUENTO EN CADA DILUCIN 10 1 2

-1

CAJA

10

-2

10

-3

RECUENTO TOTAL

7 2

0 12

4 1 Invalido

Tabla 1. Recuento en placa Mesofilos Aerobios en agar PC Hongos y Levaduras RECUENTO EN CADA DILUCIN 10 1 2
-2

CAJA

10

-3

10

-4

RECUENTO TOTAL

1 0

1 0

7 17 Invalido

Tabla 2. Recuento en placa Hongos y Levaduras en agar OGYE ANALISIS DE RESULTADOS

En la tabla 1 y 2 se observan los resultados de los recuentos para microorganismos mesofilos aerobios, hongos y levaduras realizados de una muestra de arroz de leche. En ambas tablas se puede apreciar que el nmero de colonias contadas en las diferentes diluciones, estn por debajo del rango estndar (30-300), lo que indica que la elaboracin del arroz con leche se llev a cabo bajo condiciones higinicas adecuadas, originando una baja carga microbiana en el producto, adems de estar recin preparado con temperatura relativamente alta en el momento de la compra y su tiempo expuesto al medio ambiente era mnimo.

Por otro lado es de observar que en los recuentos de las diferentes diluciones tanto para mesofilos (Tabla 1), como para hongos y levaduras (Tabla 2), no existe una concordancia entre los resultados obtenido ya que no se refleja una disminucin de la cantidad de microorganismo a medida de realizar las respectivas diluciones, las cuales tiene como objetivo disminuir la carga microbiana existente en un alimento y facilitar el conteo de microorganismo (3). Por el contrario en la tabla 1 se puede apreciar que a medida de realizar las diluciones los recuentos aumentaron encontrndose el mayor recuento (12 colonias) en la dilucin 10 -2, en comparacin de la dilucin 10-1( 7 y 2 colonias) en donde se esperaba una mayor contraccin de microorganismos puesto que corresponde a la dilucin ms concentrada. Resultados similares se encontraron en el recuento para hongos y levaduras en donde el mayor nmero de colonias se obtuvo en la dilucin 10 -4 (7 y 17 colonias) la cual fue la ms diluida. Muy posiblemente estos resultados fueron consecuencia de errores en la metodologa al realizar las diluciones o las respectivas siembras que no permitieron un recuento eficaz de los

microorganismos encontrados en la muestra analizada, por tal motivo que no fue posible realizar el recuento total para mesofilos aerobios, hongos y levaduras, por lo tanto sera apropiado realizar nuevamente las pruebas realizando de forma adecuada las diluciones y las siembras, de esta manera obtener resultados coherentes. BIBLIOGRAFIA 1). MAST group. Industrial Microbiology/Dehydrated Culture Media/OGYE AGAR BASE, [en linea]. [3 de marzo del 2012] .Disponible en la Web: http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU458_SPA.pdf 2). MAST group. Industrial Microbiology/Dehydrated Culture Media/PLATE COUNT AGAR, [en linea]. [3 de marzo del 2012] .Disponible en la Web: http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU342_SPA.pdf 3). Simanca MM y Durango MA. Microbiologa de alimentos. Guas de laboratorio. 16p