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COLOMBIANA
NTC
4458
2007-12-12
E:
CORRESPONDENCIA:
DESCRIPTORES:
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproduccin
Primera actualizacin
Editada 2007-12-21
PRLOGO
ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN
CONTENIDO
Pgina
1.
OBJETO .......................................................................................................................1
2.
3.
4.
PRINCIPIO....................................................................................................................2
4.1
4.2
4.3
4.4
GENERALIDADES .......................................................................................................3
5.
5.1
GENERALIDADES ......................................................................................................3
5.2
DILUYENTE..................................................................................................................3
5.3
MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES....................................................3
5.4
5.5
6.
6.1
6.2
INCUBADORA..............................................................................................................6
Pgina
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
MEDIDOR DE pH .........................................................................................................6
7.
MUESTREO..................................................................................................................6
8.
9.
PROCEDIMIENTO........................................................................................................7
9.1
9.2
9.3
10.
10.1
10.2
10.3
11.
MTODO DE CLCULO..............................................................................................8
11.1
11.2
11.3
11.4
Pgina
12.
PRECISIN ................................................................................................................10
12.1
12.2
13.
ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
LMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIN DE NMEROS PEQUEOS
DE COLONIAS.......................................................................................................................11
ANEXO B (Informativo)
BIBLIOGRAFA......................................................................................................................12
1.
OBJETO
2.
Esta norma no aplica para la deteccin de E. coli H7 O157 (vase la NTC 4899).
REFERENCIAS NORMATIVAS
TRMINOS Y DEFINICIONES
3.2 Escherichia coli. Bacilo corto gram negativo que forma parte de la flora normal de
intestino de animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo,
O-Nitrofenli--D- galactopiransido positivo y su crecimiento ptimo es a 37 C. Algunas cepas
pueden producir enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonizacin e invasin
por lo cual pueden causar enfermedades diarreicas, as como infecciones urinarias y
nosocomiales.
4.
PRINCIPIO
4.1
Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, el grupo coliforme se define como toda bacteria que
posea la enzima -D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de actuar sobre el substrato
cromognico, formado en la liberacin del cromgeno.
4.2
Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que
da respuesta positiva al grupo coliforme y posee adems la enzima B-Glucoronidasa, la cual
tiene la propiedad de abrir el substrato fluorognico, resultando en la liberacin del fluorgeno.
Un substrato fluorognico tal como 4-metil-umbeliferil--D-glucornido (MUG) es utilizado para
detectar la enzima B-glucoronidasa la cual es producida por E. coli.
La enzima B-glucoronidasa hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es
revelado bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una
prueba positiva para E.coli.
El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnologa del substrato definido, el cual emplea
nutrientes - indicadores que producen color, fluorescencia, o ambos, al ser metabolizados por
los microorganismos coliformes y E. coli; los cuales son detectados simultneamente.
El reactivo proporciona dos nutrientes-indicadores especficos: ONPG (O- nitrofenil --dgalactopiransido) y MUG (4-metil-umbeliferil-- d- glucornido). Durante la metabolizacin de
stos nutrientes por la enzima Coliforme -D galactosidasa y - glucoronidasa de E. coli, se
produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada
la presencia de coliformes y de E. coli respectivamente.
2
4.3
GENERALIDADES
4.4.1 Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo selectivo y empleando una cantidad
especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es lquido, o una cantidad
especificada de una suspensin inicial en el caso de otros productos.
Se realizan otras siembras en las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la
muestra de ensayo o de la suspensin inicial.
4.4.2
NOTA
4.4.3 Se calcula el nmero de coliformes y E. coli por mililitro o por gramo de muestra a partir
del nmero de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (vase el numeral 10).
5.
5.1
GENERALIDADES
Para los procedimientos de laboratorio corrientes, vase la NTC 4206 (ISO 7218).
5.2
DILUYENTE
Vanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especfica
relacionada con el producto sometido a anlisis.
5.3
MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES
NOTA Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5.3.1
Peptona
7,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Lactosa
10,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
3
Sales biliares
1,5 g
Rojo neutro
0,03 g
Cristal violeta
0,002 g
12 g a 18 g 1
Agar
Agua destilada o desionizada
5.3.2
1 000 ml
Preparacin
5.4.1
Peptona
7,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Lactosa
10,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Sales biliares
1,5 g
Rojo neutro
0,03 g
Cristal violeta
0,002 g
0,1 g
Agar
Agua destilada o desionizada
5.4.2
1 000 ml
Preparacin
5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronido
5.5.1
Peptona
20,0 g
Sales biliares
1,5 g
X B-D glucornido
0,075 g
Agar
15,0 g
1 000 ml
Preparacin
NOTA
El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si
cumple con las especificaciones adecuadas.
INCUBADORA
CAJAS DE PETRI
BAO DE MARA
O equipo similar, con capacidad de operar a 45 C 2 C (para mantener los medios de cultivo
antes de la siembra).
6.6
MEDIDOR DE pH
7.
MUESTREO
El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma especfica apropiada para el
producto que se estudia de acuerdo con la AOAC (Oficial Methods of Anlisis of AOAC
International). Si no existe una norma especfica, se recomienda que las partes interesadas
lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
8.
La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con las normas de la coleccin NTC 4491
para muestras microbiolgicas o normas que traten acerca del producto que interese. Si no
existe norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre
este punto.
9.
PROCEDIMIENTO
9.1
Vanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especfica
apropiada para el producto que interese.
9.2
INOCULACIN E INCUBACIN
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.3). Usando una pipeta estril
(vase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto
es lquido o 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos (vase el numeral 9.1).
Se toman otras dos cajas de Petri estriles. Usando otra pipeta estril, se transfiere a cada
caja 1 ml de la primera dilucin decimal (10-1) de la muestra de ensayo, si el producto es
lquido o 1 ml de la primera dilucin decimal (10-2) de la suspensin inicial en el caso de otros
productos.
Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estril
para cada dilucin decimal.
9.2.2 Se vierten aproximadamente entre 10 ml a 15 ml del medio (vase el numeral 5.3), a
45 C 2 C, en cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de la
suspensin inicial (o de la dilucin 10-1 si el producto es lquido) y el momento en que el medio
(vase el numeral 5.3) se vierte en las cajas no debe ser mayor de 20 min.
Cuidadosamente se mezcla el inculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las
cajas de Petri sobre una superficie horizontal fra.
9.2.3 Despus de que se complete la solidificacin, se vierten aproximadamente 4 ml de
medio de cultivo que cubra la superficie (vase el numeral 5.3, 5.4, 5,5) a 45 C 2 C, sobre la
superficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describi anteriormente. Se
pretende dejar una doble capa para visualizar mejor las colonias.
9.2.4
9.2.5 Si el objeto del anlisis es solo la determinacin de E. coli, para una mejor
recuperacin de bacterias injuriadas, incubar a 35 C 1 C (si son productos lcteos incubar
a 30 C 1 C) las primeras 4 horas y despus incubar a 44 C 1 C por 18 h a 20 h.
9.3
Despus del perodo especificado de incubacin (vase el numeral 9.2.4), se cuentan las
colonias coliformes caractersticas en cada caja que contenga no ms de 150 colonias3, ya
sean caractersticas o no, usando el equipo para el recuento de colonias.
Mediante la utilizacin de una lmpara de fluorescencia de 360 nm a 366 nm hacer la lectura
de las bacterias E. coli fluorescencia positiva.
NOTA
Despus de la incubacin durante 24 h, las colonias caractersticas son de color rojo prpura con un
dimetro de 0,5 mm o mayor, y algunas veces estn rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
Por encima de este nmero existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atpica.
Despus del periodo especificado de incubacin (vanse los numerales 9.2.4 para coliformes y
9.2.5 para E.coli), realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresar
independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E. coli glucoronidasa
positivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias (vase el numeral 6.6).
10.1
Examinar las cajas de petri usando una lmpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios,
de onda larga (366 nm)).
La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli.
Si la fluorescencia es cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 h para la prueba con
ONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para verificar la fluorescencia intensificada
como prueba de resultado positivo.
10.2
Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color azul verdosas (T,B,X, D
glucornido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
10.3
Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-glucornido). Se
presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
11.
MTODO DE CLCULO
11.1
CASO GENERAL
C
(n1 + 0,1 n2 )d
en donde
n1
n2
-2
en la primera dilucin seleccionada (10 ): 83 y 97 colonias
-3
en la segunda dilucin seleccionada (10 ): 13 y 8 colonias
N=
83 + 97 +13 + 8
201
C
=
=
= 9136
(n1 + 0,1 n2) d (2 + 0,1 x 2 ) x 10 2 0,022
Al redondear el resultado como se indic antes, se obtiene 9 100 9,1 x 103 UFC/ml o UFC/g
de producto.
11.2
En una dilucin de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente fueron
caractersticas.
En una dilucin de 10
caractersticas.
NE =
-5
5 + 3 + 0+1
(2 + 0,1 x 2) x 10 4
9
2,2 x 10 4
= 40 000
COLONIAS NO CARACTERSTICAS
12.
PRECISIN
12.1
Consltese la Tabla A.1. Para obtener los lmites de confianza, se multiplican los lmites
superior e inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilucin.
13.
10
Superior
<1
<1
<1
10
12
13
14
10
16
11
18
12
19
13
20
14
21
15
23
11
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
http://www.epa.gov/nerlcwww/online.htm. 2006-11-12.
[6]
http://www.bergeys.org/. 2006-11-12.
[7]
12